Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Abstract

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introduction

גלוטמט הוא הנוירוטרנסמיטר העיקרי המעורר ברשתית 1. תאי גנגליון רשתית (RGCs), קבלת הקלט הסינפטי glutamatergic מתאי דו קוטבית 2, הם נוירונים הפלט של הרשתית ששולחות מידע חזותי אל המוח. מחקרים פיזיולוגיים הראו כי עירור הסינפטי של RGCs מתווכת postsynaptically ידי קולטני NMDA (NMDARs) ואת הקולטנים AMPA (AMPARs) 3,4,5. למרות זרמים סינפתטי (EPSCs) ב RGCs מתווכות על ידי AMPARs ו NMDARs 3,5,6,7,8, EPSCs מיניאטורי ספונטנית (mEPSCs) על RGCs להפגין רק מרכיב בתיווך AMPARs 4,5,9. עם זאת, צמצום ספיגת גלוטמט חשף מרכיב NMDAR ב EPSCs ספונטנית 5, דבר המצביע על כך NMDARs על דנדריטים RGC יכול להיות ממוקם מחוץ סינפסות מעוררות. קינאזות guanylate קרום הקשורים (MAGUKs) כגון PSD-95 כי קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכול, כולל קולטני גלוטמט ערוץ יוןים באתרי הסינפטי, גם להפגין דפוסי ביטוי subsynaptic ברורים 10,11,12,13,14.

במהלך העשורים האחרונים, אימונוהיסטוכימיה confocal ו מיקרוסקופ אלקטרונים טרום הטבעה (EM) אימונוהיסטוכימיה הועסק ללמוד ביטוי קולטן קרום. למרות immunostaining confocal חושף דפוסים רחבים של ביטוי הקולטן, הרזולוציה הנמוכה יותר שלה עושה את זה אי אפשר להשתמש בו כדי להבחין במיקום subcellular. מחקרי EM טרום מוטבע הרשתית יונקת עולים כי יחידות משנת NMDAR נוכחי אלמנטי postsynaptic ב סינפסות סרט מדוך דו קוטבי 15,16,17. זאת בניגוד לכאורה ראיות פיזיולוגיות. עם זאת, דיפוזיה של מוצר התגובה הנה חפצה ידועה בשיטת אימונו-טרום ההטבעה. לפיכך, הגישה זו לא כוללת בדרך כלל נתונים אמינים סטטיסטית ועשויים לכלול הבחנה בין לוקליזציה קרום הסינפטי לעומת 18,19,20,21 קרום extrasynaptic. עַלמצד השני, נתונים פיסיולוגיים אנטומיים עולים בקנה אחד עם לוקליזציה הסינפטי של AMPARs על RGCs 3,5,7,9,22. לפיכך, קולטני גלוטמט MAGUKs ב סינפסה סרט רשתית הם נקודות לא רק על-סינפטי אלא גם על תאי קרום perisynaptic או extrasynaptic. עם זאת, ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנה אלו סינפסה סרט רשתית עדיין יש צורך.

הנה, פיתחנו טכניקה immunogold postembedding EM לבחון את לוקליזציה subsynaptic של יחידות משנה NMDAR, תת-יחידות AMPAR ו PSD-95 ואחריו בהערכת מספר, צפיפות והשונות של החלבונים האלה ב סינפסות על RGCs חולדה שכותרתו באמצעות B למקטע רעלן הכולרה (CTB) שיטות איתור מדרדרות.

Protocol

טיפול הטיפול בבעלי חיים היו בהתאם טיפול בבעלי חיים NIH והנחיות ועדת שימוש. ביום הלידה (P) 15-21 חולדות Sprague-Dawley, הזריקו 1-1.2% CTB בילטרלי דרך colliculus מעולה, נשמרו על 12: אור 12-hr: מחזור כהה.

1. קיבוע רקמת הרשתית

  1. להרכיב את חומרים והכלים באים: מיקרוסקופ לנתח, 2 מלקחיים עם טיפים עדינים מאוד, מספריים, נייר סינון תאי, פיפטה פלסטיק שקופיות מיקרוסקופ.
  2. להרדים חולדה בתא סגור עם 2.0 מ"ל halothane (הרדמה נשימתית). לקבוע הרדמה נאותה בשיטות הבאות: חוסר נסיגת כפה האחורי לאחר קמצוץ הבוהן, או חוסר רפלקס מצמוץ. ואז לערוף מיד עם גיליוטינה. הסר את העיניים עם זוג מספריים איריס ומניחים בצלחת זכוכית המכיל paraformaldehyde 4% חיץ פוספט 0.1 M (PB) ב- pH 7.4.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להסיר את התירסea ידי ניתוק החלק הקדמי של גלגל העין. הסר את העדשה זגוגי מפני שטח הרשתית הפנימית עם מלקחיים.
  4. מקלף את בלובן העין עם שני מלקחיים עד הרשתית מבודדת עיינית.
  5. חותכים את הרשתית מיד לתוך 100 - 200 רצועות מיקרומטר בעובי בתער, ובכפוף קיבעון pH משמרת.
  6. תקן רצועות הרשתית paraformaldehyde 4% ב 0.1 M PB ב 6.0 pH למשך 20 - 30 דקות ולאחר מכן ב 4% paraformaldehyde בתוספת 0.01% glutaraldehyde ב- pH 10.5 במשך 10 - 20 דקות ב RT.
  7. לאחר שטיפות כמה PB עם 0.15 מ"מ CaCl 2 (pH 7.4 ב 4 ° C), cryoprotect רצועות רשתית עם גליצרול (60 דקות כל אחד ב 10%, 20%, 30%, אז O / N ב 30%) ב 0.1 M PB לפני להקפיא חילוף.

2. החלפת Freeze

הערה: השיטה זו להקפיא החלפה היא שונה מן הפרוטוקול שפורסם קודם לכן 19,20. כמו כן, חשוב כי המכשירים הם מאוד קרים (ללבוש כפפות); otherwise, הרקמה עשויה להפשיר חלקית כאשר נגע עם המכשירים. כל הצעדים האלה נעשים בתוך החדר AFS ו המכשירים הם לא יכולים לנוע מעל השוליים של החדר. באופן דומה, קירור הולם של כל הכימיקלים המשמשים AFS הוא הכרחי.

  1. לצלול-להקפיא את רצועות הרשתית פרופן נוזלי -184 מעלות צלזיוס מכשיר cryopreservation EM (CPC). בעזרת המברשת בסדר, מניח את הדגימות על חתיכות קטנות של קלטת מקל פעמים המצורפות בדלי המתכת שהולכים על הקצה של המוטות הצוללות (פתיל את החיץ נוסף באמצעות המברשת).
  2. לצלול את המוטות אל פרופן נוזלי ולשמור שם בערך 5 שניות, ולאחר מכן להעביר אל המכשיר להקפיא החלפה אוטומטית (AFS) באמצעות תא תחבורה קטן כי הוא מלא עם חנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ').
  3. לאחר הצבת מדגם ומכשירים קפוא (מלקחיים אזמל) לתוך AFS, לקרר את המכשירים בתא עבור seדקות veral לפני נגיעה רקמות, או לקרר אותם על ידי הנחת טיפים של המכשירים במשך כמה שניות לתוך תא תחבורה קטן (מלאים בחנקן נוזלי ( "LN 2 מקורר מיכל העברת cryo ')).
  4. מדי פעם את AFS, להסיר את מדגם הקלטת מן הבדל באמצעות אזמל בסדר. כמו כן, לשמור על בקרת זרימת גז חנקן, TF (TF מתואר שליטת רגולטור עבור LN 2 vaporiser ') פתוחה במהלך הליכים אלה.
  5. לפני הצבת הרקמה הקפואה לתוך מחזיקי שטוח הטבעה (כלומר, לפני הגדרת AFS), לחתוך עיגול דק מסדין פלסטיק שקוף ומניחים אותו לתוך החלק התחתון של בעל כדי השורה התחתונה של כל טוב. זה מאפשר הסרה יחסית קלה של אבן polymerized הדגימה בסיום.
    הערה: בעבר, השתמשתי בשיטה אלטרנטיבית לבעלי ההטבעה השטוחים, והעסקת קפסולות רייכרט + ג'לטין כפולות (ראה Petralia ו Wenthold, 1999) 20.
  6. השתמש רצף אוטומטית הבאים AFS (תוך שימוש בטרמינולוגיה מכשיר): T1 = -90 מעלות צלזיוס במשך 32 שעות, S1 = הטמפרטורה לעלייה של 4 מעלות צלזיוס / hr (11.3 שעות), T2 = -45 מעלות צלזיוס במשך 50 שעות, S2 = הטמפרטורה לעלייה של 5 מעלות צלזיוס / hr (9 שעות), T3 = 0 מעלות צלזיוס למשך 40 שעות (סה"כ = 142.3 שעות). זה עלול לקחת 2 - 4 שעות למקום דגימות AFS (ב -90 ° C) לפני תחילת רצף מתוזמן.
  7. לטבול את החלקים הקפואים ב יצטט uranyl 1.5% מתנול ב -90 מעלות צלזיוס במשך> 32 שעות ב AFS. מניח שתי חתיכות של רקמות (בדרך כלל) בכל אחד משבע הבארות בעל אלומיניום שטוח הטבעה (שלוש להשתלב AFS).
    1. הנח את הרקמה + הקלטת לתוך מתנול יצטט uranyl / בבארות והסירו את הסרט מאוחר יותר, בסמוך עד בינוני הטבעת תחילה (כגון Lowicryl HM20) הסתננות, אם זה קשה מדי כדי להסיר את רקמה מהקלטת.
  8. ואז להגדיל את בשלבי הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס (+ 4 ° C לכל hr; ברצף האוטומטי).
  9. שטוף את הדגימות שלוש פעמים מתנול precooled, באמצעות פיפטה פלסטיק קנס שקצו להסיר את הפתרון ישן מכל בעל שטוח הטבעה, ולאחר מכן באמצעות אחר פיפטה פלסטיק רגיל להוסיף מתנול הטרי precooled.
  10. לאחר מכן, תוך שימוש באותה השיטה, לחדור הדגימות בהדרגה עם שרפי הטבעה בטמפרטורה נמוכה כגון הטבעה הבינונית (HM20 / מתנול ב 1: 1 ו -2: 1, כל אחד עבור 2 שעות, ואחריו שרף טהור עבור שעה 2 ולאחר מכן לשנות את השרפים ולשמור O / N).
  11. שנה את השרף שוב למחרת, התאמת רמת השרף להגיע רק עד לקצה העליון של הבארות.
  12. לפלמר הדגימות (-45 ° C עד 0 ° C ברצף אוטומטי; + 5 ° C לכל hr) עם האור UV במשך 40 שעות.
  13. ואז להסיר את הדגימות מן AFS. בדרך כלל, בלוקים מדגמים עדיין להראות קצת הוורדרדות בצבע. מניח את הדגימות קרובות אור ניאון במנדף כימי, ב RT O / N או יותר עד שהם אפליקציההאוזן לגמרי ברור.

3. Postembedding EM immunogold Immunocytochemistry

הערה: immunocytochemistry Postembedding מתבצע כמתואר 23,24,25.

  1. חותכי 1 מיקרומטר החלק עם ultramicrotome, סעיפי כתם עם 1% toluidine כחול, ולבחון אותם להתמצאות סעיף; כוון את לחסום הרקמות כדי להשיג את המטוס הרוחבי האופטימלי של חתך.
  2. חותכים 70 סעיפים ultrathin ננומטר עבה עם ultramicrotome ולאסוף אותם על רשתות חריץ ניקל מצופה Formvar-חמצני.
  3. לשטוף ורשתות פעם אחת המזוקק H 2 O ואחריו מלוח טריס שנאגר שלוש פעמים (TBS, 0.05 חיץ M טריס, 0.7% NaCl, pH 7.6) לשטוף.
  4. דגירה רשתות ב 20 טיפות μl של BSA 5% ב TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב 20 טיפות μl של תערובת המכילה עז נגד CTB (1: 3,000) ו נוגדן כדי GluN2A (נגד ארנב למקטע NMDAR אחד 01:50 , GluN2B 1:30), או GluA2 נגד ארנב / 3 (1:30)ב TBS-טריטון (TBST, 0.01% Triton X-100, pH 7.6) עם BSA 2% ו 0.02 M NaN 3 O / N ב RT.
  5. רשתות לשטוף על שלוש טיפות נפרדות (20 μl) של TBS (pH 7.6) במשך 10, 10, ו -20 דקות, ואחריו TBS (pH 8.2) במשך 5 דקות.
  6. דגירה רשתות עבור שעה 2 על טיפות (20 μl) של תערובת המכילה IgG נגד ארנב חמור (1:20) מצמידים 10 חלקיקי זהב ננומטר IgG נגד עז חמור (1:20) מצמידים את חלקיקי זהב 18 ננומטר ב TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3.
  7. לשטוף רשתות ב 20 טיפות μl של TBS (pH 7.6) במשך 5, 5, ו -10 דקות, ולאחר מכן במים ultrapure ולאחר מכן לייבש אותם.
  8. רשתות Counterstain עם אצטט uranyl 5% ו -0.3% ציטראט הובלת H המזוקק 2 O עבור 8 ו -5 דקות בתנאים כהים, בהתאמה.
  9. בניסויים משולש תיוג, דגירת רשתות O / N ב RT עם 20 טיפות μl של תערובת של אנטי-העז CTB (1: 3,000), אנטי עכבר PSD-95 (1: 100), ו GluN2A נגד ארנב (1 : 50). ואז דגירה רשתות עבור שעה 2 על 20 טיפות μl של תערובת של IgGs מצמידים 18, 10, ו -5 חלקיקי זהב ננומטר TBST (pH 8.2) עם 2% BSA ו 0.02 M NaN 3. שמור אותו נוהל כמו תיוג כפול לרחצה counterstaining בין ואחרי הדגירה נוגדן.
  10. בקרות בוצעו בו נוגדנים משני יושמו לבד.
  11. רשתות צפה על תמונות EM ו digitalize. לעבד נתונים סופיים ב- Adobe Photoshop 6.0 ​​רק עבור בהירות והניגודיות אם יש צורך 24.

כימות 4.

  1. ידני באזורים הנבחרים של שכבת plexiform הפנימי (IPL) ללא חורים או סדקים בהגדלת 8,000X, ואז באקראי פוטומונטאז את מלוא עומקה של IPL בהגדלת 25,000X.
  2. זהה דנדריטים RGC ב צמדים דו קוטביים חרוטים כשהם א) מכילים את אות CTB מועבר retrogradely (חלקיקים זהב גדולים), ב) ממברנות מוגדרות היטב תערוכה, בתרי, צפיפויות postsynaptic, ג) להכיל לפחות שני חלק זהב קטןicles בתוך PSD, או יותר חלקיק זהב אחד קטן לאורך הממברנה extrasynaptic.
  3. אסוף 45 - 55 דנדריטים RGC, על פי קריטריונים לעיל, על ניתוח כמותי.
  4. מדוד את האורכים של PSD ו קרום פלזמת extrasynaptic של דנדריטים RGC פרט עם תוכנת ImageJ NIH. רוזן חלקיקי זהב בתוך 10 ננומטר של קרום כמו קרום קשור, המבוסס על עובי ממוצע של 7 - 9 ננומטר עבור קרום פלזמת 26.
  5. חישוב צפיפות החלקיקים כמספר חלקיקי זהב לכל מיקרומטר ליניארי (זהב / מיקרומטר). למדוד את המרחק בין מרכז של כל חלקיק זהב באמצע PSD (עבור מיקום הסינפטי) או קצה PSD (עבור מיקום extrasynaptic).
  6. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים על ידי התוכנה. השתמש שני זנב t- הבדיקות להשוות אמצעים. להסיק משמעות כאשר P <0.05. אלא אם צוין אחרת, ערכי דוח כמו הממוצע ± SEM 18.

תוצאות

התוצאות המוצגות כאן להפגין דפוסי לוקליזציה subsynaptic שונות לחלוטין של GluA 2/3 ו- NMDARs על דנדריטים RGC ברשתית חולדה, כפי שתואר לעיל 24,25. 77% של חלקיקים immunogold GluA 2/3 פרופילים הדנדריטים RGC אותרו בתוך PSD (איור 1 א), בדומה למרבית סינפסות המרכזית. עם זאת, NMD...

Discussion

תארנו ארבע טכניקות שלאחר הטבעת כמותית מוצלחת immunogold EM: 1) קיבוע קצר וחלש, 2) להקפיא-החלפה, 3) שלאחר הטבעה מכתימה immunogold, ו -4) כימות.

EM immunogold מאפשרת זיהוי של חלבונים ספציפיים בסעיפי רקמות ultrathin. נוגדנים שכותרתו עם חלקיקי זהב ניתן דמיינו י?...

Disclosures

The authors have no disclosures.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי תוכניות המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS) ואת המכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות (NIDCD), של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). אנו מודים מתקן NINDS EM ואת ליבת ההדמיה המתקדמת NIDCD (קוד # ZIC DC 000,081-03) לקבלת סיוע.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ParaformaldehydeEMS15710
GlutarldehydeEMS16019
NaH2PO4SigmaS9638
Na2HPO4Sigma7782-85-6
CaCl2SigmaC-8106
BSASigmaA-7030
Triton X-100SigmaT-8787
NaOHSigma221465
NaN3JT BakerV015-05
GlycerolGibco BRL15514-011
Lowicryl HM 20Polysciences15924-1
Tris-BaseFisherBP151-500
TrisFisher04997-100
Anti-GluN2AMilliporeAB1555PDilution 1/50
Anti-GluN2BMilliporeAB1557PDilution 1/30
Anti-GluA2/3MilliporeAB1506Dilution 1/30
Anti-PSD-95MilliporeMA1–046Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particlesEMS25704Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particlesEMS25814Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particlesEMS25812Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particlesJackson ImmunoResearch705-215-147Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.EMSFCF2010-Ni
Uranyl acetateEMS22400-1
MethanolEMS67-56-1
Lead citrateLeica
Leica EM AFSLeica
Leica EM CPCLeica
UltromicrotomeLeica
JEOL 1200 EMJEOL
liquid nitrogen Roberts Oxygen
PropaneRoberts Oxygen
CTBList Biological Laboratories1041-1.2%
Anti-CTBList Biological Laboratories703Dilution 1/4000

References

  1. Copenhagen, D. R., Jahr, C. E. Release of endogenous excitatory amino acids from turtle photoreceptors. Nature. 341, 536-539 (1989).
  2. Wässle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol. Rev. 71, 447-480 (1991).
  3. Mittman, S., Taylor, W. R., Copenhagen, D. R. Concomitant activation of two types of glutamate receptor mediates excitation of salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 428, 175-197 (1990).
  4. Matsui, K., Hosoi, N., Tachibana, M. Excitatory synaptic transmission in the inner retina: paired recordings of bipolar cells and neurons of the ganglion cell layer. J. Neurosci. 18, 4500-4510 (1998).
  5. Chen, S., Diamond, J. S. Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina. J. Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).
  6. Diamond, J. S., Copenhagen, D. R. The contribution of NMDA and non-NMDA receptors to the light-evoked input-output characteristics of retinal ganglion cells. Neuron. 11, 725-738 (1993).
  7. Lukasiewicz, P. D., Wilson, J. A., Lawrence, J. E. AMPA-preferring receptors mediate excitatory synaptic inputs to retinal ganglion cells. J. Neurophysiol. 77, 57-64 (1997).
  8. Higgs, M. H., Lukasiewicz, P. D. Glutamate uptake limits synaptic excitation of retinal ganglion cells. J. Neurosci. 19, 3691-3700 (1999).
  9. Taylor, W. R., Chen, E., Copenhagen, D. R. Characterization of spontaneous excitatory synaptic currents in salamander retinal ganglion cells. J. Physiol. 486, 207-221 (1995).
  10. Kennedy, M. B. Origin of PDZ (DHR, GLGF) domains. Trends. Biochem. Sci. 20, 350 (1995).
  11. Kim, E., Sheng, M. PDZ domain proteins of synapses. Nat. Rev. Neurosci. 5, 771-781 (2004).
  12. Migaud, M., et al. Enhanced long-term potentiation and impaired learning in mice with mutant postsynaptic density-95 protein. Nature. 396, 433-439 (1998).
  13. Aoki, C., et al. Electron microscopic immunocytochemical detection of PSD-95, PSD-93, SAP-102, and SAP-97 at postsynaptic, presynaptic, and nonsynaptic sites of adult and neonatal rat visual cortex. Synapse. 40, 239-257 (2001).
  14. Davies, C., Tingley, D., Kachar, B., Wenthold, R. J., Petralia, R. S. Distribution of members of the PSD-95 family of MAGUK proteins at the synaptic region of inner and outer hair cells of the guinea pig cochlea. Synapse. 40, 258-268 (2001).
  15. Hartveit, E., Brandstätter, J. H., Sassoè-Pognetto, M., Laurie, D. J., Seeburg, P. H., Wässle, H. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J. Comp. Neurol. 348, 570-582 (1994).
  16. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstätter, J. H., Wässle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  17. Pourcho, R. G., Qin, P., Goebel, D. J. Cellular and subcellular distribution of NMDA receptor subunit NR2B in the retina. J. Comp. Neurol. 433, 75-85 (2001).
  18. Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur. J. Neurosci. 9, 2219-2224 (1997).
  19. Petralia, R. S., Wenthold, R. J., Ariano, M. A. Glutamate receptor antibodies: Production and immunocytochemistry. Receptor Localization: Laboratory Methods and Procedures. , 46-74 (1998).
  20. Petralia, R. S., Wenthold, R. J. Immunocytochemistry of NMDA receptors. Methods. Mol. Biol. 128, 73-92 (1999).
  21. Nusser, Z. AMPA and NMDA receptors: similarities and differences in their synaptic distribution. Curr. Opin. Neurobiol. 10, 337-341 (2000).
  22. Qin, P., Pourcho, R. G. Localization of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the cat retina: a light- and electron-microscopic study. Vis. Neurosci. 16, 169-177 (1999).
  23. Zhang, J., Wang, H. H., Yang, C. Y. Synaptic organization of GABAergic amacrine cells in salamander retina. Visual. Neurosci. 21, 817-825 (2004).
  24. Zhang, J., Diamond, J. S. Distinct perisynaptic and synaptic localization of NMDA and AMPA receptors on ganglion cells in rat retina. J. Comp. Neurol. 498, 810-820 (2006).
  25. Zhang, J., Diamond, J. S. Subunit- and Pathway-Specific Localization of NMDA Receptors and Scaffolding Proteins at Ganglion Cell Synapses in Rat Retina. J. Neurosci. 29, 4274-4286 (2009).
  26. Peters, A., Palay, S., Webster, H. . The fine structure of the nervous system: neurons and their supporting cells, 3rd ed. , (1991).
  27. Baude, A., Nusser, Z., Roberts, J. D. B. The metabotropic glutamate receptor (mGluR1) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction. Neuron. 11, 771-787 (1993).
  28. Van Lookeren Campagne, M., Oestreicher, A. B., van der Krift, T. P., Gispen, W. H., Verkleij, A. J. Freeze-substitution and Lowicryl HM20 embedding of fixed rat brain: Suitability for immunogold ultrastructural localization of neural antigens. J. Hist. Cyt. 39, 1267-1279 (1991).
  29. Matsubara, A., Laake, J. H., Davanger, S., Usami, S., Ottersen, O. P. Organization of AMPA receptor subunits at a glutamate synapse: A quantitative immunogold analysis of hair cell synapses in the rat organ of Corti. J. Neurosci. 16, 4457-4467 (1996).
  30. Petralia, R. S., et al. Organization of NMDA receptors at extrasynaptic locations. Neuroscience. 167, 68-87 (2010).
  31. Merighi, A., Polak, J. M., Priestley, J. V. Post-embedding electron microscopic immunocytochemistry. Electron Microscopic Immunocytochemistry: Principles and Practice. , 51-87 (1992).
  32. Ottersen, O. P., Takumi, Y., Matsubara, A., Landsend, A. S., Laake, J. H., Usami, S. Molecular organization of a type of peripheral glutamate synapse: the afferent synapses of hair cells in the inner ear. Prog. Neurobiol. 54, 127-148 (1998).
  33. Nusser, Z., Lujan, R., Laube, G., Roberts, J. D., Molnar, E., Somogyi, P. Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus. Neuron. 21, 545-559 (1998).
  34. Takumi, Y., Ramirez-Leon, V., Laake, P., Rinvik, E., Ottersen, O. P. Different modes of expression of AMPA and NMDA receptors in hippocampal synapses. Nat. Neurosci. 2, 618-624 (1999).
  35. Grimes, W. N., et al. Complex inhibitory microcircuitry regulates retinal signaling near visual threshold. J. Neurophysiol. 114, 341-353 (2015).
  36. Sassoe-Pognetto, M., Ottersen, O. P. Organization of ionotropic glutamate receptors at dendrodendritic synapses in the rat olfactory bulb. J. Neurosci. 20, 2192-2201 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience108perisynapticimmunogoldNMDAAMPAPSD 95

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved