High-Resolution Análise Quantitativa immunogold de Receptores de Membrana na retina fita Sinapses

Resumo

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Resumo

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introdução

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório na retina ^1. Células ganglionares da retina (RGCs), recebendo entrada sináptica glutamatérgica a partir de células bipolares ^2, são os neurônios de saída da retina que enviam a informação visual ao cérebro. Estudos fisiológicos mostraram que a excitação sináptica das CGR é mediada por receptores de NMDA pós-sinapticamente (NMDAR) e os receptores de AMPA (AMPARs ^3,4,5). Embora correntes pós-sinápticos excitatórios (EPSCS) em RGCs são mediadas por AMPARs e NMDAR ^3,5,6,7,8, EPSCS miniatura espontâneas (mEPSCs) em RGCs exibem apenas um componente AMPARs mediada ^4,5,9. No entanto, reduzindo a captação de glutamato revelou um componente NMDAR em EPSCS espontâneas ^5, sugerindo que NMDAR em dendritos RGC pode ser localizado fora das sinapses excitatórias. guanilato quinases associadas a membranas (MAGUKs) como PSD-95 que os receptores de neurotransmissores, incluindo o agrupamento de receptores de glutamato e de canal iónicos em locais sinápticos, também apresentam padrões de expressão subsináptica distintas ^{10,11,12,13,14.}

Nas últimas décadas, imuno-histoquímica confocal e pré-incorporação microscópio eletrônico de imuno-histoquímica (EM) foram utilizados para estudar a expressão do receptor de membrana. Embora imunocoloração confocal revela padrões gerais de expressão do receptor, a sua resolução mais baixa faz com que seja impossível utilizar para distinguir localização subcelular. Pré-incorporação de estudos de EM em retina de mamíferos indicam que subunidades NMDAr estão presentes em elementos pós-sinápticos no cone bipolares sinapses fita celular ^15,16,17. Isto é, em aparente contraste com evidência fisiológica. No entanto, a difusão do produto da reacção é um artefacto bem conhecidos no método de imunoperoxidase pré-incorporação. Assim, esta abordagem não costumam dar os dados estatisticamente fiáveis ​​e podem excluir distinção entre a localização de membrana sináptica contra ^18,19,20,21 membrana extrasynaptic. EmPor outro lado, os dados fisiológicos e anatómicos são consistentes com uma localização sináptica de AMPARs em RGCs ^3,5,7,9,22. Assim, os receptores de glutamato e na sinapse MAGUKs fita da retina estão localizadas não apenas para o pós-sináptica, mas também para os compartimentos membranares perisynaptic ou extrasynaptic. No entanto, uma análise quantitativa de alta resolução destas proteínas da membrana em uma sinapse fita da retina é ainda necessária.

Aqui, nós desenvolvemos uma técnica postembedding EM imuno para examinar a localização subsináptica de subunidades NMDAR, subunidades Ampar e PSD-95, seguido de estimar o número, a densidade e a variabilidade destas proteínas nas sinapses Onto RGCs rato etiquetado usando subunidade da toxina da cólera B (CTB) métodos de rastreio retrógrada.

Protocolo

Cuidados e manipulação dos animais estavam em conformidade com o NIH Animal Care e as diretrizes de uso das Comissões. dia pós-natal (P) 15-21 ratos Sprague-Dawley, injectados com 1-1,2% de CTB bilateralmente através do colículo superior, foram mantidos num 12: 12-h luz: ciclo escuro.

1. Fixação tecido da retina

1. Monte os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinça com pontas muito finas, tesouras, papel de filtro de celulose, pipeta de plástico e uma lâmina de microscópio.
2. Anestesiar o rato numa câmara fechada, com 2,0 ml de halotano (um anestésico de inalação). Determinar anesthetization adequada por estes métodos: a falta de retirada da pata traseira após pitada dedo do pé, ou a falta de reflexo de piscar. Então decapitar imediatamente com uma guilhotina. Remover os olhos com um par de tesouras de íris e colocar num prato de vidro contendo 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (PB) a pH 7,4.
3. Utilizando o microscópio de dissecação, remover o milhoEA cortando fora da parte dianteira do globo ocular. Remover a lente e vítreo a partir da superfície da retina interna com uma pinça.
4. Descasque a esclerótica com as duas pinças até que a retina é isolado a partir da ocular.
5. Cortar a retina imediatamente em 100 - 200 tiras mm de espessura com uma navalha, e sujeito a fixação pH-shift.
6. Fix tiras retina em 4% de paraformaldeído em 0,1 M PB a pH 6,0 durante 20 - 30 minutos e, em seguida, em 4% de paraformaldeído mais 0,01% de glutaraldeído a um pH de 10,5 para 10-20 min à temperatura ambiente.
7. Após várias lavagens em PB com CaCl 0,15 mM de ₂ (pH 7,4 a 4 ° C), cryoprotect as tiras da retina com glicerol (60 min cada em 10%, 20%, 30%, em seguida, O / N em 30%) em 0,1 M PB antes de congelar substituição.

2. Freeze-substituição

NOTA: Este método de congelamento e substituição é modificada a partir de um protocolo publicado anteriormente ^19,20. Além disso, é fundamental que os instrumentos são muito frios (usar luvas); otherwise, o tecido pode descongelar parcialmente quando tocado com os instrumentos. Todos estes passos são feitas no interior da câmara de AFS e os instrumentos não podem mover-se acima da borda da câmara. Da mesma forma, o resfriamento adequado de todos os produtos químicos utilizados no AFS é necessário.

1. Mergulhar-congelar as tiras da retina em propano líquido a -184 ° C em um instrumento EM criopreservação (CPC). Usando um pincel fino, coloque as amostras em pequenos pedaços de fita dupla-stick ligados às bases metálicas que vão na extremidade das hastes mergulhando (pavio fora tampão extra usando o pincel).
2. Mergulhar as varetas para o propano líquido e manter lá por cerca de 5 segundos, e depois transferir para o instrumento de congelamento e substituição automática (AFS), utilizando uma câmara de pequeno porte que é preenchido com nitrogênio líquido ( 'LN ₂ refrigerado recipiente de transferência crio ").
3. Depois de colocar a amostra congelada e instrumentos (fórceps e bisturi) para a AFS, arrefecer os instrumentos na câmara para seminutos veral antes de tocar o tecido, ou resfriá-los, colocando as pontas dos instrumentos por alguns segundos na câmara de pequeno porte (preenchido com nitrogênio líquido ( 'LN ₂ refrigerado recipiente de transferência crio')).
4. Uma vez no AFS, remova a amostra ea fita da parte de stub usando uma multa bisturi. Além disso, manter o controle de fluxo de gás nitrogênio, TF (TF é descrito como um "controle do regulador para LN ₂ vaporizador ') aberta durante esses procedimentos.
5. Antes de colocar o tecido congelado nos suportes planas-incorporação (isto é, antes de estabelecer a AFS), cortado um círculo fina a partir de uma folha de plástico transparente e colocá-lo no fundo do suporte, de modo a revestir o fundo de cada poço. Isso permite a remoção relativamente mais fácil dos blocos de amostras polimerizadas quando terminar.
   NOTA: Anteriormente, foi utilizado um método alternativo para os titulares de incorporação planas, e empregando duplas cápsulas Reichert + gelatina (ver Petralia e Wenthold, 1999) ^20.
6. Utilize a seguinte seqüência automática no AFS (usando a terminologia do instrumento): T1 = -90 ° C durante 32 horas, S1 = aumento de temperatura de 4 ° C / h (11,3 horas), T2 = -45 ° C durante 50 horas, S2 = aumento de temperatura de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C durante 40 horas (total = 142,3 h). Pode levar 2-4 horas para colocar as amostras no AFS (a -90 ° C) antes de se iniciar a sequência temporizada.
7. Mergulhe as secções congeladas em 1,5% acetato de uranila em metanol a -90 ° C durante> 32 horas no AFS. Coloque dois pedaços de tecidos (tipicamente) em cada um dos sete poços no suporte de alumínio do flat-incorporação (três encaixar no AFS).
   1. Colocar o tecido + fita para o acetato de uranilo / metanol nas cavidades e remover a fita depois, imediatamente antes do início de meio de inclusão (tais como Lowicryl HM20) infiltração, se é muito difícil de remover o tecido a partir da fita.
8. Em seguida, aumentar a temperatura por passos para -45 ° C (+ 4 ° C por hora; na seqüência automática).
9. Lave as amostras três vezes em metanol pré-arrefecido, usando uma pipeta de plástico de ponta fina para remover a solução de idade de cada titular flat-a incorporação, e em seguida, usando uma outra pipeta de plástico padrão para adicionar o metanol fresco pré-arrefecido.
10. Em seguida, utilizando o mesmo método, infiltrar-se as amostras progressivamente com baixos resinas incorporação de temperatura, tais como a incorporação de meio (HM20 / metanol a 1: 1 e 2: 1, cada um durante 2 h, seguido de resina pura durante 2 horas e depois mudar as resinas e manter S / N).
11. Mudar a resina novamente no dia seguinte, o ajuste do nível da resina para atingir apenas para a extremidade superior dos poços.
12. Polimerizar as amostras (-45 ° C a 0 ° C em sequência automática; + 5 ° C por hora) com luz UV durante 40 horas.
13. Em seguida, retire as amostras da AFS. Normalmente, blocos de amostras ainda mostrar alguma coloração rosa na cor. Coloque as amostras próximas da luz fluorescente no exaustor de fumos, químicos, à TA O / N ou mais até que apporelha completamente clara.

3. Postembedding EM immunogold Imunocitoqu�ica

NOTA: Postembedding imunocitoquímica é realizada como descrito ^23,24,25.

1. Corte 1 mm seções com ultramicrotome, seções mancha com toluidina azul 1%, e examiná-los para orientação seção; orientar o bloco de tecido para atingir o plano transversal de corte ideal.
2. Cortar 70 cortes ultrafinos nm de espessura com ultramicrotome e recolhê-las on-revestidos Formvar carbono níquel caça-níqueis grades.
3. Lavar grades uma vez em _H2O destilada seguido por uma solução salina tamponada com Tris (TBS três vezes, tampão Tris 0,05 M, 0,7% de NaCl, pH 7,6) de lavagem.
4. Incubar em grades 20 gotas ul de BSA a 5% em TBS durante 30 minutos, e, em seguida, em 20 gotas ul de uma mistura contendo de cabra anti-CTB (1: 3000) e um anticorpo para uma subunidade GluN2A NMDAR (anti-coelho 01:50 , GluN2B 01:30), ou um anti-coelho GluA2 / 3 (1:30)em TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN ₃ O / N à temperatura ambiente.
5. grelhas de lavagem em três gotas separadas (20 ul) de TBS (pH 7,6) durante 10, 10, e 20 min, seguidos pela TBS (pH 8,2) durante 5 min.
6. Incubar durante 2 horas grades em gotas (20 ul) de uma mistura contendo IgG anti-coelho de burro (01:20) acoplado a partículas de 10 nm de ouro e IgG de burro anti-cabra (1:20) acoplados a partículas de ouro de 18 nm, em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN _3.
7. Lavar as grades em gotas 20 ul de TBS (pH 7,6) durante 5, 5, e 10 min, em seguida em água ultrapura e em seguida secá-los.
8. Grades contracoloração com 5% de acetato de uranilo e citrato de chumbo a 0,3% em _H2O destilada para 8 e 5 min sob condições de escuridão, respectivamente.
9. Para experimentos de marcação tripla, incubar grelhas de O / N à temperatura ambiente com 20 gotas ul de uma mistura de CTB anti-cabra (1: 3000), anti-ratinho PSD-95 (1: 100), e anti-coelho GluN2A (1 : 50). Em seguida, incubar grades, durante 2 horas, em 20 gotas ul de uma mistura de IgG acoplado a 18, 10, e 5 nm de partículas de ouro em TBST (pH 8,2) com 2% de BSA e 0,02 M de NaN _3. Mantenha os mesmos procedimentos que a dupla marcação para lavar e contracoloração entre e após incubação de anticorpos.
10. Os controlos foram realizados na qual os anticorpos secundários foram aplicados isoladamente.
11. Veja as grades em um EM e digitalizar imagens. Processar números finais no Adobe Photoshop 6.0 ​​apenas para o brilho e contraste, se for necessário ^24.

4. Quantificação

1. Selecionar manualmente áreas da camada plexiforme interna (IPL), sem buracos ou rachaduras no 8,000X ampliação, em seguida, fotomontagem aleatoriamente toda a profundidade da IPL em 25,000X ampliação.
2. Identificar dendrites RGC no cone duplas bipolares quando a) conter o sinal CTB transportado retrogradamente (grandes partículas de ouro), b) exibem bem definida membranas, fissuras, e densidades pós-sinápticos, c) conter pelo menos dois pequena parte do ouroicles dentro do PSD, ou mais do que uma pequena partícula de ouro ao longo da membrana de plasma extrasynaptic.
3. Colete 45 - 55 RGC dendrites, com base nos critérios acima, para análise quantitativa.
4. Medir os comprimentos da PSD e a membrana plasmática extrasynaptic de dendritos RGC individuais com o software ImageJ NIH. Contagem de partículas de ouro de 10 nm dentro da membrana, como a membrana associada, com base em uma espessura média de 7-9 nm para a membrana plasmática ^26.
5. Calcular a densidade da partícula, como o número de partículas de ouro por micrómetro linear (ouro / iM). Medir a distância entre o centro de cada uma das partículas de ouro e o meio da PSD (para localização sináptica) ou a borda do PSD (para localização extrasynaptic).
6. Realizar a análise estatística pelo software. Use bicaudais testes t para comparação de médias. Concluímos significado quando P <0,05. Salvo indicação em contrário, os dados do Relatório como média ± SEM ^18.

Resultados

Os resultados aqui apresentados demonstram contundentemente diferentes padrões de localização subsináptica de GluA 2/3 e NMDAR em dendrites RGC em retina de ratos, conforme descrito anteriormente ^24,25. 77% das partículas de imunomarcação GluA 2/3 em perfis dendríticos RGC foram localizados dentro do PSD (Figura 1A), semelhante à maioria das sinapses centrais. No entanto, NMDAR foram localizados quer sinapticamente ou extrasynaptically. 83% das partí...

Discussão

Nós descrevemos quatro técnicas para quantitativa pós-incorporação immunogold EM sucesso: 1) curta e fraca fixação, 2) freeze-substituição, 3) pós-incorporação coloração imuno, e 4) quantificação.

EM imuno permite a detecção de proteínas específicas em secções de tecido ultrafinas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pode ser directamente visualizada utilizando EM. Enquanto poderosa na detecção da localização subsináptica de um receptor de membrana, EM i...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000