Haute résolution quantitative immunomarquage Analyse des Récepteurs Membranaires au rétiniennes Synapses ruban

Résumé

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Résumé

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

Introduction

Le glutamate est le neurotransmetteur excitateur majeur dans la rétine ^1. Ganglionnaires rétiniennes de cellules (CGR), recevoir une entrée synaptique glutamatergique de cellules bipolaires ^2, les neurones de la rétine de sortie qui envoient des informations visuelles au cerveau. Des études physiologiques ont montré que l'excitation synaptique du CGR est médiée par postsynaptique récepteurs NMDA (de NMDARs) et les récepteurs AMPA (AMPA) ^3,4,5. Bien que les courants post-synaptiques excitateurs (de EPSCs) dans CGR sont médiés par des récepteurs AMPA et NMDARs ^3,5,6,7,8, EPSCs miniatures spontanés (mEPSCs) sur CGR présentent seulement une composante AMPA médiation ^4,5,9. Toutefois, la réduction glutamate absorption révélé une composante de NMDAR dans EPSCs spontanées ^5, ce qui suggère que NMDARs sur dendrites RGC peuvent être situés à l'extérieur des synapses excitateurs. guanylate kinase associée à la membrane (de MAGUKs) tels que PSD-95 que les récepteurs de neurotransmetteurs grappe, y compris les récepteurs de glutamate et de canal ioniques sur les sites synaptiques, présentent également des profils d'expression subsynaptic distinctes ^{10,11,12,13,14.}

Au cours des dernières décennies, l'immunohistochimie confocale et-enrobage pré microscope électronique (EM) immunohistochimie ont été employés pour étudier l'expression du récepteur de la membrane. Bien immunocoloration confocal révèle les grandes tendances de l'expression du récepteur, sa résolution inférieure, il est impossible d'utiliser de distinguer localisation subcellulaire. Pré-enrobage des études de Em In rétine des mammifères indiquent que les sous-unités NMDAR sont présents dans les éléments post-synaptiques à cônes bipolaires synapses à ruban de cellules ^15,16,17. Ceci est en contraste apparent à l'évidence physiologique. Toutefois, la diffusion du produit de réaction est un artefact bien connue dans la méthode de pré-enrobage immunoperoxydase. Par conséquent, cette approche ne donne généralement pas de données statistiques fiables et peut exclure distinction entre la localisation de membrane synaptique par rapport extrasynaptique ^18,19,20,21 de la membrane. SurD'autre part, les données physiologiques et anatomiques sont compatibles avec une localisation synaptique des récepteurs AMPA sur CGR ^3,5,7,9,22. Ainsi, les récepteurs du glutamate et à la rétine MAGUKs ruban synapse sont localisés, non seulement pour le post-synaptiques, mais aussi dans les compartiments membranaires ou périsynaptiques extrasynaptiques. Cependant, une analyse quantitative à haute résolution de ces protéines membranaires dans un ruban synapse rétine est encore nécessaire.

Ici, nous avons développé une technique postembedding EM immunologique d'examiner la localisation subsynaptic de sous-unités NMDAR, sous-unités AMPAR et PSD-95 puis en estimant le nombre, la densité et la variabilité de ces protéines au niveau des synapses SUR DES CGR de rat marquée en utilisant la sous-unité de la toxine cholérique B (CTB) méthodes de traçage rétrograde.

Protocole

Soin et la manipulation des animaux étaient conformes aux NIH de protection des animaux et les lignes directrices utilisation Comité. jour postnatal (P) 15-21 Les rats Sprague-Dawley, injectés avec 1-1,2% CTB bilatéralement par le colliculus supérieur, ont été maintenus sur un 12: la lumière de 12 h: cycle d'obscurité.

1. Fixation de tissu rétinien

1. Assembler les matériaux et outils suivants: Un microscope à dissection, 2 pinces avec des pointes très fines, des ciseaux, du papier filtre de cellulose, pipette en plastique et une lame de microscope.
2. Anesthésier le rat dans une chambre fermée avec 2,0 ml halothane (e anesthésique pour inhalation). Déterminer anesthésie suffisante par ces méthodes: l'absence de retrait de la patte arrière après pincement de l'orteil, ou le manque de réflexe de clignement. Puis décapiter immédiatement avec une guillotine. Retirez les yeux avec une paire de ciseaux de l'iris et les placer dans un plat en verre contenant du paraformaldéhyde 4% dans 0,1 M de tampon phosphate (PB) à pH 7,4.
3. Utilisation du microscope à dissection, retirez le maïsea en coupant l'avant du globe oculaire. Retirer la lentille et vitré de la surface de la rétine interne avec une pince.
4. Peler la sclérotique avec les deux pinces jusqu'à ce que la rétine est isolé de la bonnette.
5. Couper la rétine immédiatement en 100 - 200 bandes um d'épaisseur avec un rasoir, et sous réserve de la fixation de changement de pH.
6. Fixer des bandes de la rétine dans 4% de paraformaldehyde dans 0,1 M de PB à pH 6,0 pendant 20 à 30 minutes, puis dans du paraformaldehyde à 4%, plus 0,01% de glutaraldéhyde à un pH de 10,5 pendant 10 à 20 min à température ambiante.
7. Après plusieurs lavages dans du PB avec 0,15 _{mM de CaCl2} (pH 7,4 à 4 ° C), cryoprotect les bandes de la rétine avec la glycérine (60 minutes à chaque fois dans 10%, 20%, 30%, O / N à 30%) dans 0,1 M PB avant le gel substitution.

2. Gel de substitution

NOTE: Cette méthode de congélation-substitution est modifié à partir d'un protocole publié plus tôt ^19,20. En outre, il est crucial que les instruments sont très froids (porter des gants); oinon, le tissu peut décongeler partiellement au toucher avec les instruments. Toutes ces étapes sont effectuées dans la chambre AFS et les instruments ne sont jamais autorisés à se déplacer au-dessus du bord de la chambre. De même, le refroidissement correct de tous les produits chimiques utilisés dans l'AFS est nécessaire.

1. Plongez-geler les bandes de la rétine dans le propane liquide à -184 ° C dans un instrument EM de cryoconservation (PCC). L'utilisation d'un pinceau fin, placer les échantillons sur de petits morceaux de ruban adhésif double-bâton attachés aux moignons métalliques qui vont à l'extrémité des tiges plongeant (évacuent tampon en utilisant la brosse).
2. Plongez les tiges dans le propane liquide et y maintenir pendant environ 5 secondes, puis transfert à l'instrument de gel-substitution automatique (AFS) en utilisant une chambre de transport petite qui est rempli avec de l'azote liquide ( 'LN ₂ refroidi récipient de transfert de cryo').
3. Après avoir placé l'échantillon congelé et instruments (forceps et scalpel) dans l'AFS, refroidir les instruments dans la chambre pour soiminutes sieurs avant de toucher le tissu, ou les refroidir en plaçant les pointes des instruments pendant quelques secondes dans la petite chambre de transport (rempli d'azote liquide ( 'LN ₂ refroidi récipient de transfert de cryo')).
4. Une fois dans l'AFS, retirer l'échantillon et la bande du stub à l'aide d'une amende scalpel. Aussi, gardez le contrôle de flux d'azote gazeux, TF (TF est décrit comme une «commande de régulateur pour LN ₂ vaporisateur ') ouverte au cours de ces procédures.
5. Avant de placer le tissu congelé dans les supports plats-enrobage (avant la mise en place de la SPA), découper un cercle mince à partir d'une feuille de plastique transparent et placez-le dans le bas de la porte de manière à recouvrir le fond de chaque puits. Ceci permet l'élimination relativement plus facile des blocs d'échantillons polymérisés lorsque vous avez terminé.
   NOTE: Auparavant, nous avons utilisé une méthode alternative pour les détenteurs d'incorporation plats, et en utilisant des capsules doubles Reichert + gélatine (voir Petralia et Wenthold, 1999) ^20.
6. Utilisez la séquence suivante automatique dans l'AFS (en utilisant la terminologie de l'instrument): T1 = -90 ° C pendant 32 h, S1 = augmenter la température de 4 ° C / h (11,3 h), T2 = -45 ° C pendant 50 h, S2 = augmenter la température de 5 ° C / h (9 h), T3 = 0 ° C pendant 40 heures (total = 142.3 h). Il peut prendre de deux à quatre heures pour placer les échantillons dans l'AFS (à -90 ° C) avant de commencer la séquence chronométrée.
7. Immerger les coupes congelées à 1,5% d'acétate d'uranyle dans le méthanol à -90 ° C pendant> 32 h dans l'AFS. Placez deux morceaux de tissus (généralement) dans chacune des sept puits dans le support en aluminium plate-enrobage (trois insèrent dans les AFS).
   1. Placez le tissu + bande dans l'acétate d'uranyle / méthanol dans les puits et enlever la bande plus tard, juste avant de commencer l'intégration moyen (comme Lowicryl HM20) infiltration, si elle est trop difficile à enlever le tissu de la bande.
8. Puis augmenter progressivement la température à -45 ° C (+ 4 ° C par heure; dans la séquence automatique).
9. Laver les échantillons trois fois dans le méthanol préalablement refroidi, en utilisant une pipette à pointe fine en plastique pour enlever l'ancienne solution de chaque détenteur plate-enrobage, puis en utilisant une autre pipette en plastique standard pour ajouter le méthanol frais préalablement refroidi.
10. Puis, en utilisant la même méthode, infiltrer les échantillons au fur et à des résines de température enrobage faibles telles que l'incorporation moyen (HM20 / méthanol à 1: 1 et 2: 1, chacun pendant 2 heures, suivi par de la résine pure pendant 2 heures, puis modifier les résines et de garder O / N).
11. Modifier à nouveau la résine, le lendemain, en ajustant le niveau de la résine pour atteindre juste le bord supérieur du puits.
12. Polymériser les échantillons (-45 ° C à 0 ° C en séquence automatique, + 5 ° C par heure) avec une lumière UV pendant 40 heures.
13. Ensuite, retirer les échantillons provenant de l'AFS. Typiquement, les blocs échantillons montrent encore un peu de couleur rose en couleur. Placer les échantillons proches de la lumière fluorescente dans la hotte pour émanation chimique, à la température ambiante O / N ou plus jusqu'à ce qu'ils apporeille tout à fait clair.

3. Postembedding EM immunomarquage Immunocytochimie

NOTE: Postembedding immunocytochimie est effectuée comme décrit ^23,24,25.

1. Coupez 1 um sections avec ultramicrotome, sections de tache avec 1% toluidine-bleu, et de les examiner pour la section orientation; orienter le bloc de tissu pour réaliser le plan transversal optimal de la coupe.
2. Couper 70 coupes ultrafines nm d'épaisseur avec ultramicrotome et les recueillir sur Formvar carbone revêtues de nickel grilles à sous.
3. Grilles lavage une fois dans de l'eau distillée ₂ O, suivie par une solution saline tamponnée au Tris (TBS trois fois, du tampon Tris 0,05 M, NaCl 0,7%, pH 7,6) lavage.
4. Incuber grilles dans 20 gouttes ul de 5% de BSA dans du TBS pendant 30 minutes, puis à 20 gouttes ul d'un mélange contenant de chèvre anti-CTB (1: 3000) et un anticorps dirigé contre une sous-unité de récepteurs NMDA (anti-lapin GluN2A 01:50 , GluN2B 1:30), ou un anticorps anti-lapin GluA2 / 3 (1:30)dans du TBS-Triton (TBST, 0,01% de Triton X-100, pH 7,6) avec 2% de BSA et 0,02 M NaN ₃ O / N à température ambiante.
5. Laver les grilles sur trois gouttes séparées (20 pi) du TBS (pH 7,6) pour 10, 10 et 20 min, suivi par du TBS (pH 8,2) pendant 5 min.
6. Incuber grilles pendant 2 heures sur des gouttes (20 pi) d'un mélange contenant âne IgG anti-lapin (1:20) couplé à 10 nm particules d'or et d'âne anti-IgG de chèvre (1:20) couplés à des particules d'or de 18 nm dans TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M _{de NaN3.}
7. Lavez les grilles dans des gouttes de 20 pi de TBS (pH 7,6) pour 5, 5 et 10 min, puis dans l'eau ultra-pure, puis les sécher.
8. Grilles Counterstain avec 5% d'acétate d'uranyle et 0,3% de plomb citrate de H _{2 O} distillée pour 8 et 5 min dans des conditions sombres, respectivement.
9. Pour les expériences triple marquage, incuber grilles O / N à température ambiante avec 20 gouttes ul d'un mélange d'anticorps anti-chèvre de CTB (1: 3000), anti-souris PSD-95 (1: 100) et anti-lapin GluN2A (1 : 50). Puis incuber grilles pendant 2 heures sur 20 ul gouttes d'un mélange d'IgG couplé à 18, 10, 5 et des particules d'or de la nm dans du TBST (pH 8,2) avec 2% de BSA et 0,02 M _{de NaN3.} Gardez les mêmes procédures que le double marquage pour le lavage et contre-coloration entre et après les anticorps incubation.
10. Les témoins ont été effectuées dans lesquelles les anticorps secondaires ont été appliqués seuls.
11. Voir les grilles sur un EM et numériser des images. Traiter les chiffres définitifs dans Adobe Photoshop 6.0 ​​uniquement pour la luminosité et le contraste si nécessaire ^24.

4. Quantification

1. Sélectionnez manuellement les zones de la couche plexiforme interne (IPL) sans trous ou des fissures à 8,000X grossissement, puis photomontage au hasard sur toute la profondeur de l'IPL à 25,000X grossissement.
2. Identifier les dendrites RGC au cône dyades bipolaires quand ils a) contenir le signal CTB rétrograde transporté (grandes particules d'or), b) présentent bien définie membranes, Fentes, et des densités postsynaptiques, c) contiennent au moins deux petite partie de l'oricles au sein du PSD, ou plus d'une petite particule d'or le long de la membrane plasmique extrasynaptique.
3. Recueillir 45 - 55 dendrites RGC, sur la base de critères ci-dessus, pour l'analyse quantitative.
4. Mesurer les longueurs de la PSD et la membrane plasmique extrasynaptique RGC de dendrites individuelles avec le logiciel NIH ImageJ. Nombre de particules d'or de 10 nm à l'intérieur de la membrane associée à la membrane comme, par rapport à une épaisseur moyenne de 7-9 nm pour la ²⁶ membrane plasmique.
5. Calculer la densité des particules en nombre de particules d'or par micromètre linéaire (or / um). Mesurer la distance entre le centre de chaque particule d'or et au milieu de la PSD (pour la localisation synaptique) ou le bord de la PSD (pour la localisation extrasynaptique).
6. Effectuer une analyse statistique par le logiciel. Utilisez bilatéral tests t pour comparer les moyennes. Conclure importance lorsque P <0,05. Sauf indication contraire, les valeurs de rapport sous forme de moyenne ± SEM ^18.

Résultats

Les résultats présentés ici montrent remarquablement différents modèles de localisation de subsynaptic Glua 3.2 et NMDARs dendrites sur RGC dans la rétine de rat, comme décrit précédemment ^24,25. 77% de particules de 2/3 Glua immunomarquage dans RGC profils dendritiques étaient situés au sein de la PSD (figure 1A), similaire à la plupart des synapses centrales. Cependant, NMDARs étaient situées soit synaptique ou extrasynaptically. 83% de particu...

Discussion

Nous avons décrit quatre techniques pour la réussite de l'intégration post-immuno EM quantitative: 1) à court et à faible fixation, 2) de gel-substitution, 3) post-intégration immunomarquage, et 4) la quantification.

EM immunologique permet la détection de protéines spécifiques dans des coupes de tissus ultraminces. Des anticorps marqués avec des particules d'or peuvent être directement visualisées en utilisant EM. Bien que puissante dans la détection de la localisation ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde	EMS	15710
Glutarldehyde	EMS	16019
NaH2PO4	Sigma	S9638
Na2HPO4	Sigma	7782-85-6
CaCl2	Sigma	C-8106
BSA	Sigma	A-7030
Triton X-100	Sigma	T-8787
NaOH	Sigma	221465
NaN3	JT Baker	V015-05
Glycerol	Gibco BRL	15514-011
Lowicryl HM 20	Polysciences	15924-1
Tris-Base	Fisher	BP151-500
Tris	Fisher	04997-100
Anti-GluN2A	Millipore	AB1555P	Dilution 1/50
Anti-GluN2B	Millipore	AB1557P	Dilution 1/30
Anti-GluA2/3	Millipore	AB1506	Dilution 1/30
Anti-PSD-95	Millipore	MA1–046	Dilution 1/100
Donkey anti-rabbit IgG-10 nm gold particles	EMS	25704	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-10 nm gold particles	EMS	25814	Dilution 1/20
Donkey anti-mouse IgG-5 nm gold particles	EMS	25812	Dilution 1/20
Donkey anti-goat IgG-18 nm gold particles	Jackson ImmunoResearch	705-215-147	Dilution 1/20
Formvar-Carbon coated nickel-slot grids.	EMS	FCF2010-Ni
Uranyl acetate	EMS	22400-1
Methanol	EMS	67-56-1
Lead citrate	Leica
Leica EM AFS	Leica
Leica EM CPC	Leica
Ultromicrotome	Leica
JEOL 1200 EM	JEOL
liquid nitrogen	Roberts Oxygen
Propane	Roberts Oxygen
CTB	List Biological Laboratories	104	1-1.2%
Anti-CTB	List Biological Laboratories	703	Dilution 1/4000