سريع المعالجة الأنزيمية من البروتينات للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد مع Microreactor التدفق من خلال

Summary

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Abstract

الغالبية العظمى من قياس الطيف الكتلي (MS) القائم على أساليب تحليل البروتين وتشمل خطوة الهضم الأنزيمي قبل الكشف، وعادة مع التربسين. هذه الخطوة ضرورية لتوليد صغيرة الببتيدات الوزن الجزيئي، عموما مع MW <3،000-4،000 دا، التي تقع ضمن نطاق المسح الفعال للأجهزة قياس الطيف الكتلي. وتتضمن البروتوكولات التقليدية O / N الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية. وقد أدت التطورات الحديثة في تطوير مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات، وعادة ما تنطوي على استخدام microreactor مع الانزيمات يجمد أو مجموعة من العمليات الفيزيائية التكميلية التي تقلل من الوقت اللازم لهضم بروتين لبضع دقائق (على سبيل المثال، الميكروويف أو عالية الضغط). في هذا العمل، ونحن تصف مقاربة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن تنفيذها في أي مختبر لتحقيق الهضم الأنزيمي سريع للبروتين. وكثف البروتين (أو خليط من البروتين) على المستعبدين C18-عكس المرحلة الأداء الإقتصادي الأداء العاليormance السائل اللوني (HPLC) جسيمات السيليكا مسبقة في العمود الشعري، وغرست التربسين في المخزن مائي على جزيئات لفترة قصيرة من الزمن. لتمكين على خط للكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد، ومزال الببتيدات زيتية مع نظام المذيبات مع زيادة المحتوى العضوي مباشرة في مصدر MS أيون. هذا النهج يتجنب استخدام جزيئات الإنزيم يجمد مرتفعة الثمن ولا تتطلب أي مساعدات لإتمام العملية. هضم البروتين وتحليل عينة الكامل يمكن تحقيقه في أقل من 3 دقائق ~ و ~ 30 دقيقة، على التوالي.

Introduction

وكثيرا ما حقق تحديد وتوصيف تنقية البروتينات باستخدام تقنيات MS. يتم هضم البروتين مع انزيم ويتم تحليل الببتيدات إلى أبعد من مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام ضخ الإعداد التجريبية بسيط. الهضم بروتين ضروري لتوليد شظايا الببتيد الصغيرة التي تقع في نطاق كتلة مفيد لمعظم تحليل MS، والتي يمكن أن تكون مجزأة بسهولة من خلال الطاقة المنخفضة تصادم التفكك المستحث لتوليد الأحماض الأمينية تسلسل المعلومات. للبروتينات معزولة أو خليط من البروتين بسيطة، ليست هناك حاجة أخرى لفصل الكروماتوغرافي من الببتيدات قبل الكشف عن مرض التصلب العصبي المتعدد. مزيج من 25-50 الببتيدات يمكن تحليلها بسهولة عن طريق غرس العينة مع ضخ حقنة مباشرة في مصدر MS أيون.

مطياف الكتلة يمكن أن تؤدي في التحليل والتأكد من تسلسل البروتين داخل زمنية قصيرة. مع وسائل الحصول على البيانات الحديثة، وهذه العملية يمكن أن يتحقق ثithin بضع دقائق أو حتى ثواني. العامل المحدد في استكمال العملية برمتها على المدى الزمني القصير هو الخطوة الهضم بروتين. عادة، وهذا يتم تنفيذه خلال بضع ساعات (أو O / N)، في الحل، في 37 درجة مئوية، وذلك باستخدام الركيزة: نسب انزيم (50-100): 1. لتقليل الوقت الهضم الأنزيمي لدقائق أو ثواني، microreactors انزيم يجمد، في شكل مفاعلات الموائع الدقيقة أو خراطيش المتاحة تجاريا، وقد وصفت ^1-6 عادة، يتم يجمد الانزيم من قبل التساهمية، غير التساهمية / الامتزاز الفيزيائي، مجمع تشكيل أو التغليف، ^3،6 في تعزيز الكفاءة العملية الأنزيمية التي مكنت من كبير أرض- حجم ونسب انزيم إلى الركيزة. وتشمل مزايا إضافية من المفاعلات يجمد تخفيض انحلال ذاتي والتدخل من الانزيم في تحليل MS، وتحسين الاستقرار انزيم وإعادة استخدام. وقد وصفت مجموعة متنوعة من النهج واستخدام الزجاج أو أجهزة microfabricated البوليمرية،باستخدام الإنزيمات ثبتوا على حبات مغناطيسية بواسطة تفاعلات الضد مستضد، ^7،8 شرك في شبكات جسيمات متناهية الصغر من الذهب، ⁹ مغلفة في تيتانيا الألومينا سول المواد الهلامية ¹⁰ و nanozeolites، ¹¹ أو من خلال القبض على ني NTA أو صاحب الوسم تشكيل تعقيدا. ⁶ بدلا من ذلك ، وقد وضعت الشعيرات الدموية مفتوح أنبوبي مع الإنزيمات ثبتوا، وكذلك ¹² وعلاوة على ذلك، وقد تجلى تعزيز الانقسام بروتين باستخدام تسيطر الميكروويف إشعاع ¹³ أو بمساعدة ضغط أو الضغط تكنولوجيا الدراجات (PCT) للحد من أوقات رد الفعل إلى 30-120 دقيقة ¹⁴

على الرغم من المزايا المتعددة للمفاعلات انزيم يجمد، تكاليف خراطيش التجارية عالية، وتوافر الأجهزة ميكروفلويديك للاستخدام الروتيني محدودة، واستخدام نتائج تقنيات الميكروويف أو معاهدة التعاون بشأن البراءات في الحاجة إلى أجهزة إضافية. وكان الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة التي circumveNTS هذه العيوب، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في كل مختبر لتمكين الباحثين مع نهج بسيط وفعال لأداء الانقسام الأنزيمية للبروتينات في التحضير لتحليل MS في غضون دقائق. يعتمد المنهج على استخدام مسعور، C18 الجسيمات التي هي محملة مسبقا في الشعيرات الدموية أو الجهاز ميكروفلويديك، وامتصاص البروتين (ق) من الفائدة على هذه الجسيمات تليها الهضم الأنزيمي خلال ضخ الانزيم على عمود معبأ والبروتين القبض على (ق). في هذا النهج، وثبتوا الركيزة من خلال التفاعلات غير التساهمية، وغرست الانزيم على البروتين وظائفها. وزيادة كفاءة بروتين الهضم من خلال المناطق سطح الجسيمات الكبيرة التي تعرض البروتين لمعالجة الأنزيمية، وخفض المسافات والأوقات نشر من وإلى السطح من الجزيئات، وتحسين نقل الجماعي، أي مرفق التساهمية التي قد تؤثر على نشاط الإنزيم، والقدرة بسرعة evaluatتركيبات (ه) من الإنزيمات المختلفة، disposability، ومضاعفة إذا تم تنفيذ هذه العملية في شكل ميكروفلويديك. ويتجلى هذا النهج مع استخدام خليط من البروتينات القياسية والتربسين- الأكثر شيوعا انزيم لبروتين الهضم قبل الكشف ESI-MS. كان مطياف الكتلة المستخدمة للكشف في هذه الدراسة فخ رباعي (LTQ) أداة الخطية.

Protocol

1. إعداد شعري Microreactor

1. قطع قطرها الداخلي 100 ميكرون (ID) × 360 ميكرون القطر الخارجي (OD) الشعرية لمدة 7-8 سم، و 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى 3-5 سم مع الساطور الزجاج الشعرية. تحقق تحت المجهر أن طرفي الشعرية لها نظيفة، وقطع على التوالي، دون أي نتوءات بارزة.
2. إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية إلى واحدة من نهاية 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، على طول ~ 6 مم؛ في حالة الضرورة، ومراقبة هذه العملية تحت المجهر.
3. تطبيق قطرة صغيرة من الغراء حول E6000 تقاطع 90 ميكرون OD / 100 الشعيرات الدموية معرف ميكرون مع نهاية * نصيحة، والسماح للالغراء علاج O / N في RT.
4. قطع إدراج 20 ميكرون معرف × 90 ميكرون OD الشعرية على طول ~ 10-15 ملم. وسيكون هذا التأين باعث electrospray.
5. قبل قطع 1/32 "OD نظرة خاطفة، 1/16" نظرة خاطفة OD و1/16 حوض PTFE OD "جي في قطعة من 4-5 سم في الطول. وستكون هذه الأكمام المستخدمة في النقابات الشعرية لتوفير اتصال خالية من تسرب.
6. قم بتوصيل الطرف الآخر من 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية لاتحاد نظرة خاطفة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
7. إدراج / تشديد قطعة من ~ 5 سم 1/16 "أنابيب PTFE في الطرف الآخر من الاتحاد.
8. تزن ~ 4 ملغ من C18 (5 ميكرون) الجسيمات في مرحلة ما قبل تنظيفها / المجففة 2 مل قارورة زجاجية. إضافة 0.5 مل الأيزوبروبانول، أغلق القارورة وتفريق الطين في الحمام ultrasonicator.
9. سحب مع حقنة 250 ميكرولتر ما يقرب من 200 الطين ميكرولتر، تضاف إبرة الحقنة في "أنابيب PTFE 16/01 للاتحاد نظرة خاطفة، والاستغناء ببطء الطين إلى 100 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD الشعرية، مراقبة تحت المجهر باسم شعري يملأ مع جزيئات حتى يبلغ طوله 2-3 ملم التعبئة ويتحقق، وهذا سوف يكون microreactor (الشكل 1) وμ 20.الشعرية م معرف يحتفظ الجزيئات في microreactor من خلال تأثير كيستون. ¹⁵
10. شطف microreactor مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H ₂ O / CH ₃ CN 50:50 ت / ت، وبعد ذلك مع ~ الحل 50 ميكرولتر من H ₂ O / CH ₃ CN 98: 2 ت / ت.

2. إعداد حلول عينة

ملاحظة: العمليات التي تنطوي على التعامل مع المذيبات والأحماض العضوية وإعداد الحل هي التي يتعين القيام بها في غطاء الدخان. ارتداء النظارات والقفازات والملابس الواقية.

1. شطف مع CH ₃ OH ويجف بضع قوارير زجاجية (4 مل)، وأنابيب البولي بروبلين (15 مل).
2. إعداد 10 مل من محلول H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين عن طريق خلط 9.8 مل H ₂ O مع 200 ميكرولتر CH ₃ CN. مزيج من قبل صوتنة.
3. إعداد 10 مل من محلول H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 ت / ت) في أنبوب 15 مل البولي بروبلين من خلال خلط 5 مل H _{2 <}/ دون> O مع 5 مل CH ₃ CN. مزيج من قبل صوتنة.
4. إعداد 4 مل من محلول مائي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 ت / ت) في قارورة زجاجية 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
5. إعداد 4 مل من محلول عضوي المحمض (TFA 0.01٪ ت / ت) وذلك بإضافة 4 ميكرولتر TFA (10٪) إلى 4 مل H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 ت / ت) في كوب قارورة 4 مل. مزيج من قبل صوتنة.
6. تزن 16 ملغ NH ₄ HCO ₃ مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل من H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 ت / ت) حل وتفريق صوتنة. وهذا يؤدي إلى حل 50 ملم من NH ₄ HCO ₃ (الرقم الهيدروجيني ~ 7.8) في المخزن المائي.
7. تزن 5 ملغ من البروتين القياسية (على سبيل المثال، زلال المصل البقري، الهيموجلوبين α / β، السيتوكروم C، الأنهيدراز الكربونيك، α-2-HS-بروتين سكري، الخ) مع توازن دقيق التحليلي في قارورة زجاجية 4 مل. إضافة 4 مل DI توفير المياهص وتفريق صوتنة. هذا ينتج عادة في محلول بتركيز عال على مستوى ميكرومتر.
8. إعداد 1 مل من محلول البروتين (1-2 ميكرومتر) عن طريق تمييع الحل تركيز عالية المستوى ميكرومتر مع حجم مناسب من NH ₄ HCO ₃ (50 ملم) عازلة مائي. مزيج من قبل صوتنة.
9. إعداد الحل التربسين (5 ميكرومتر) عن طريق إذابة 20 ميكروغرام التسلسل الصف التربسين في 170 ميكرولتر NH ₄ HCO ₃ (50 ملم) عازلة مائي. تفريق صوتنة.

3. إعداد التجريبية

ملاحظة: تم تجهيز نظام LTQ-MS مع مصدر ESI تعديل يتضمن XYZ المرحلة محلي الصنع والتي تمكن تفاعل من مطياف الكتلة لمختلف النهج إدخال العينة.

1. فصل microreactor الشعرية من النقابة نظرة خاطفة والاتصال إلى نظرة خاطفة المحملة.
2. إدراج سلك حزب العمال ل~ 2 سم في الجانب ذراع من نظرة خاطفة المحملة. استخدام 1/32 "كم نظرة خاطفة لتوفيراتصال ولعزل السلك حزب العمال خالية من تسرب.
3. توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى الطرف الآخر من نظرة خاطفة المحملة. استخدام كم 1/32 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
4. تأمين المحملة نظرة خاطفة على XYZ المرحلة ووضع ESI باعث ~ 2 ملم بعيدا عن الإعلام الشعرية مطياف مدخل.
5. قم بتوصيل سلك حزب العمال إلى مصدر التيار الكهربائي ESI من مطياف الكتلة.
6. قم بتوصيل الطرف الآخر من شعري نقل العينة إلى الاتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ. استخدام كم 1/16 "نظرة خاطفة لتوفير اتصال خالية من تسرب.
7. توصيل 4-5 سم 1/16 "أنابيب PTFE إلى الطرف الآخر من اتحاد الفولاذ المقاوم للصدأ وإدراج إبرة حقنة 250 ميكرولتر في أنابيب PTFE؛ بدوره على مضخة وتحديد معدل التدفق في القيمة المطلوبة (على سبيل المثال، 2 ميكرولتر / دقيقة).
8. مدخلات جنبا إلى جنب المعلمات الحصول على البيانات MS في مجموعة من البرامج التي تسيطر على أداة لمرض التصلب العصبي المتعددد حفظ كملف طريقة لتجهيز الإعداد لإجراء التحليل؛ لنظام LTQ-MS، استخدم المعلمات تحليل تعتمد البيانات التالية: استبعاد الديناميكي تمكين 180 ثانية مع عرض استبعاد كتلة ± 1.5 م / ض. واحد MS تفحص تليها التكبير واحد وMS ² يمسح على رأس 5 القمم على أشده، وتكبير العرض الضوئي ± 5 م / ض. تصادم التفكك المستحث (CID) المعايير المحددة في عرض العزلة 3 م / ض، تطبيع الاصطدام الطاقة 35٪، وتفعيل س 0.25، ووقت التنشيط 30 ميللي ثانية.

4. إعداد ميكروفلويديك

1. إعداد جهاز ميكروفلويديك من الزجاج أو ركائز البوليمرية، ^16-18 وتقدم تخطيط للجهاز في الشكل 2A، ويتكون من microreactor (1) (0.13 ملم طول عرض × 2 مم × 50 ميكرون العميق) متصلة مدخل (2 )، منفذ (3) ومنفذ الجانب (4)؛ قنوات ربط للتلاعب الموائعية هي ~110 ميكرون واسع و~ 50 ميكرون عميقة. بنية متعددة القنوات (5)، تتكون من ~ 1.5-2 ميكرون عميق × 10 ميكرون يوسع x 100 ميكرون microchannels طويلة وضعت 25 ميكرون وبصرف النظر، سيكون بمثابة مرشح للإبقاء على الجزيئات في microreactor.
2. تمكين الاتصالات السائل التسليم إلى الرقاقة عن طريق الإلتصاق الموصلات المتخصصة إلى الموانئ مدخل، أو عن طريق ابتكار موقف البوليمر الذي يتسع التجهيزات للتسليم السائل (الشكل 2B). ¹⁶
3. إعداد الطين الجسيمات C18 (5 ميكرون) كما هو موضح في الخطوة 1.8. تقديم الطين إلى microreactor مع حقنة باستخدام 1/16 "أنابيب PTFE موصولة إلى منفذ الجانب رقاقة (4)؛ ختم الميناء بعد تحميل الجسيمات مع الغراء الايبوكسي وعلاج لمدة 1 ساعة في الفرن على 90 درجة مئوية ^(16).
4. إدراج الشعرية (20 ميكرون معرف × 90 ميكرون طول OD × 10 ملم) في ميناء منفذ، وختم مع الغراء E6000، والسماح علاج O / N؛ هذا وسوف تصبح باعث ESI ( 6).
5. توصيل 50 ميكرون معرف × 360 ميكرون OD (~ 0.5 مترا) نقل عينة الشعرية إلى ميناء رقاقة مدخل (2)؛ ربط الطرف الآخر من الشعيرات الدموية إلى حقنة ميكرولتر 250 و ضخ حقنة، كما هو موضح في 3،6-3،7.
6. وضع خفيفة الوزن نظرة خاطفة المحملة الموصل على خط نقل عينة فقط قبل مدخل الميناء (2) وادخال سلك حزب العمال على الجانب ذراع المحملة، كما هو موضح في 3.2. وسيكون هذا القطب ESI.
7. تأمين جهاز ميكروفلويديك على مرحلة XYZ مع باعث ESI وضع ~ 2 ملم بعيدا عن الشعرية مطياف الكتلة مدخل. إعداد MS للتحليل كما هو موضح في 3.8.

5. تحميل عينة، متعلق ب التحلل البروتيني الهضم وشطف لتحليل MS

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات نقل الحل / عينة مع المعونة من ضخ حقنة وينبغي أن يسمح لبضع دقائق إضافية لاستكمال، لتعويض القتلى نظام القبولوفاق المرتبطة خطوط نقل من وإلى microreactor. الوقت اللازم سوف تعتمد على معدلات تدفق المعنية.

1. شطف microreactor وإعدادها للتحليل عن طريق غرس محلول مائي من NH ₄ HCO ₃ (50 ملم) في H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
2. تحميل عينة بروتين (1 ميكرومتر) على microreactor عن طريق غرس محلول العينة في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
3. يبث في حل التربسين (5 ميكرومتر) على البروتين كثف على microreactor في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 1-3 دقيقة.
4. إخماد عملية الهضم بروتين وذلك بدهن microreactor مع محلول مائي المحمض من TFA (0.01٪ ت / ت) في H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 ت / ت) في 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق. استخدام حقنة 250 ميكرولتر.
5. بدء يبلغ حجمه البروتين هضم من microreactor عن طريق غرس حل العضوية المحمض من TFA (0.01٪ت / ت) في H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 ت / ت) في 300 نيكولا لانغ / دقيقة.
6. بدوره على عملية الحصول على البيانات MS والجهد ESI (~ 2000 V)؛ الحصول على البيانات MS باستخدام المعلمات الحصول على البيانات المنصوص عليها في خطوة 3.8. مراقبة شطف من الببتيدات زيتية.

6. معالجة البيانات

1. معالجة البيانات جنبا إلى جنب MS مع محرك بحث متوافقة مع تنسيق البيانات MS الخام.
   1. معالجة الملفات الخام LTQ-MS باستخدام كائن قاعدة بيانات محددة بروتين زائدة الحد الأدنى. تحميل البيانات الخام في محرك البحث، تعيين الأم والأيونات جزء التحمل كتلة إلى 2 و 1 دا، على التوالي، واستخدام أجزاء فقط زيتية تماما مع ما يصل الى اثنين غاب الانشقاقات للبحث. لا تسمح التعديلات posttranslational. تعيين العالية والمتوسطة الثقة الزائفة معدلات اكتشاف (فرانكلين روزفلت) إلى 1٪ و 3٪ على التوالي، وعدم السماح للتعديلات posttranslational.
2. تصفية البيانات لتحديد الوحيدة الموثوقةالببتيد مباريات للبروتينات في قاعدة البيانات؛ تقييم البروتين ومستوى الببتيد النتائج.

النتائج

ونتيجة تمثيلية لعملية الهضم بروتين أداء في وقت واحد على مزيج من البروتينات، مع microreactors المذكورة أعلاه (الشكلان 1 أو 2)، وتقدم في الجدول 1. ويتألف جدول تسلسل الببتيد الفريدة التي تحدد بروتين معين، والصليب درجة الارتباط (Xcorr) (أي ا?...

Discussion

وmicroreactor وصفها في هذا العمل يوفر سهلة لتنفيذ الإعداد التجريبية لأداء الهضم الأنزيمي من البروتينات لتمكين تحليل التصلب العصبي المتعدد وتحديد الهوية في أقل من 30 دقيقة. مزايا واضحة لهذا النظام، بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، وتشمل البساطة والسرعة، وانخفاض استهلاك ك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111