עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

Summary

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Abstract

הרוב המכריע של ספקטרומטריית מסה (MS) מבוסס שיטות ניתוח חלבון בה התקדמות עיכול אנזימטי לפני הגילוי, בדרך כלל עם טריפסין. שלב זה הכרחי עבור הדור של פפטידים בעלי משקל מולקולרי קטן, בדרך כלל עם MW <3,000-4,000 Da, כי ליפול בתוך טווח סריקה יעילה של מכשור ספקטרומטריית מסה. פרוטוקולים קונבנציונליים לערב עיכול אנזימטי O / N ב 37 ºC. ההתקדמות שחלה באחרונה הוביל לפיתוח של מגוון רחב של אסטרטגיות, בדרך כלל בתחום השימוש של microreactor עם קיבוע אנזימים או של מגוון רחב של תהליכים פיזיקליים משלימים המפחיתים את הזמן הדרוש לעיכול פרוטאוליטים לכמה דקות (למשל, מיקרוגל או גבוהה לַחַץ). בעבודה זו, אנו מתארים גישה פשוטה וחסכונית שיכול להיות מיושמת בכל מעבדה להשגת עיכול אנזימטי מהיר של חלבון. החלבון (או תערובת החלבונים) היא adsorbed על Perf הגבוהה C18-בונדד התהפכו פאזייםormance כרומטוגרפיה נוזלי (HPLC) חלקיקי סיליקה נטענו מראש טור נימים, טריפסין חיץ מימי הוא החדיר מעל החלקיקים לתקופה קצרה של זמן. כדי לאפשר on-line זיהוי MS, פפטידים tryptic הם eluted עם מערכת ממס עם תוכן אורגני גדל ישירות למקור MS יון. גישה זו תמנע את השימוש של חלקיקי קיבוע אנזימים יקרן ואינו מצריכה כל עזרה שתגיע להשלמת התהליך. עיכול חלבון וניתוח מדגם מלא ניתן להשיג בפחות מ ~ 3 דקות ו ~ 30 דקות, בהתאמה.

Introduction

זיהוי ואפיון של חלבונים מטוהרים מושגת לעתים קרובות על ידי שימוש בטכניקות MS. החלבון מתעכל עם אנזים ופפטידים שלה מנותחים עוד יותר על ידי MS באמצעות התקנה ניסיונית עירוי פשוט. עיכול פרוטאוליטים הכרחי להפקה שברי פפטיד קטנים שנופלים הטווח המוני השימושי של רוב מנתחי MS, וזה יכול להיות מקוטע בקלות דרך התנתקות מושרה התנגשות אנרגיה נמוכה להפקת מידע רצף חומצות האמיניות. עבור חלבונים מבודדים או תערובות חלבון פשוט, אין צורך עוד הפרדה chromatographic של פפטידים לפני גילוי MS. תערובת של פפטידים 25-50 להיות יכולה לנתח בקלות על ידי יציקת המדגם עם משאבת מזרק ישירות מקור יון MS.

ספקטרומטר המסה יכול לבצע את הניתוח ולאשר את הרצף של חלבון בתוך מסגרת זמן קצרה. בעזרת שיטות איסוף הנתונים מודרניות, תהליך זה יכול להתבצע within כמה דקות או אפילו שניות. הגורם המגביל בהשלמת התהליך על בקנה מידת זמן קצר הוא צעד העיכול פרוטאוליטים. בדרך כלל, זה מתבצע על פני כמה שעות (או O / N), בתמיסה, ב 37 ºC, באמצעות מצע: יחסי אנזים של (50-100): 1. כדי לצמצם את זמן עיכול אנזימטי לדקות או שניות, microreactors אנזים משותק, בצורה של כורי microfluidic או מחסניות זמינות מסחרי, תוארו. ^1-6 בדרך כלל, האנזים הוא משותק על ידי קוולנטיים, הלא קוולנטיים / ספיחה פיזית, מורכב היווצרות או אנקפסולציה, ^3,6 יעילות משופרת של תהליך אנזימטי מתאפשר בזכות יחסי קרקע-נפח האנזים אל המצע גדול. יתרונות נוספים של כורים משותקים כוללים מופחת autolysis והתערבות של האנזים בניתוח MS, שיפור יציבות אנזים ויכולת שימוש חוזר. מגוון של גישות, באמצעות זכוכית או מכשירי microfabricated פולימריים תואר,באמצעות אנזימים משותקים על חרוזים מגנטיים ידי אינטראקציות נוגדן-אנטיגן, ^7,8 הלכוד רשתות ננו-חלקיקים מזהב, ⁹ גלומים סול ג'ל טיטניה-אלומינה ¹⁰ ו nanozeolites, ¹¹ או נתפסו באמצעות Ni-נ.ת.ע או ההיווצרות המורכבת-Tag שלו. ⁶ לחלופין נימים, פתוח צינורי עם קיבוע אנזימים פותחו, כמו גם. ¹² יתר על כן, מחשוף פרוטאוליטים משופר הודגם באמצעות הקרנת מיקרוגל מבוקר ¹³ או לחץ בסיוע או לחץ טכנולוגית אופניים (PCT) לצמצום זמני התגובה ל 30-120 דקות. ¹⁴

למרות היתרונות המרובים של כורי אנזים משותקים, העלויות של מחסניות מסחריות היא גבוהות, הזמין של מכשירי microfluidic לשימוש שיגרתי מוגבל, ושימוש תוצאות טכנולוגיות מיקרוגל או PCT ב צורך במכשור נוסף. מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח שיטה כי circumveNTS החסרונות האלה, וזה יכול להיות מיושם בקלות בכל מעבדה להעצים חוקרים עם גישה פשוטה ויעילה לביצוע מחשוף אנזימטי של חלבונים כהכנה לניתוח MS בתוך דקות. הגישה מתבססת על השימוש הידרופובי, C18-חלקיקים שהם שנטענו מראש נימים או מכשיר microfluidic, ואת הספיחה של החלבון (ים) של עניין על חלקיקים אלה ואחריו עיכול אנזימטי במהלך העירוי של האנזים על מיטה וחלבון שנתפס ארוז (ים). לפי גישה זו, המצע הוא משותק באמצעות קישור לא קוולנטי, ואת האנזים הוא החדיר מעל החלבון ההמום. יעילות עיכול פרוטאוליטים מוגברת על-ידי אזורים פני החלקיקים גדולים החושפים את חלבון לעיבוד האנזימטית, מרחקים וזמני דיפוזיה אל מפני השטח של חלקיקים, שיפור העברת המוני, לא מצורף קוולנטיים שעשויים להשפיע על פעילותו של האנזים, היכולת במהירות evaluatשילובי דואר של אנזימים שונים, disposability, ריבוב אם התהליך מבוצע במתכונת microfluidic. גישה זו באה לידי ביטוי עם השימוש תערובת של חלבונים סטנדרטיים טריפסין-האנזים הנפוץ ביותר לעיכול פרוטאוליטים לפני גילוי ESI-MS. ספקטרומטר מסה משמש לגילוי במחקר זה היה quadrupole מלכודת ליניארי המכשיר (LTQ).

Protocol

1. הכנה של נימי microreactor

1. חותכים את 100 מיקרומטר קוטר פנימי (ID) x 360 מיקרומטר קוטר חיצוני (OD) נימי באורך של 7-8 ס"מ, ואת נימי 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD 3-5 ס"מ עם קופיץ נימי זכוכית; לאמת תחת מיקרוסקופ כי בשני הקצוות נימי יש חתך נקי, ישר, ללא כל קוצים בולטים.
2. הכנס את 20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי לתוך קצה אחד של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר, למשך פרק ~ 6 מ"מ; במקרה הצורך, יש למלא אחר המבצע הזה תחת מיקרוסקופ.
3. החל טיפה קטנה של E6000 הדבק סביב צומת של הנימים מזהים 90 מיקרומטר OD / 100 מיקרומטר עם סופו של Q-Tip, ולתת את התרופה הדבקה O / N ב RT.
4. חותכים את 20 מוכנס מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD נימי באורך של ~ 10-15 מ"מ; זה יהיה פולט יינון electrospray.
5. טרום לחתוך באמבטיה "OD הצצה, 1/16" הצצה OD ו 1/16 "OD PTFE 1/32ing לחתיכות של 4-5 ס"מ אורך; אלה יהיו השרוולים המשמשים איגודים נימי למתן חיבור חופשי דליפה.
6. חבר את הקצה השני של נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר לאיחוד הצצה; להשתמש שרוול 1/32 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
7. הכנס / להדק פיסת ~ 5 ס"מ 1/16 "צינורות PTFE אל הקצה השני של האיגוד.
8. לשקול ~ 4 מ"ג של C18 (5 מיקרומטר) חלקיקים בתוך מראש לנקות / יבשים 2 בקבוקון זכוכית מ"ל; להוסיף 0.5 מ"ל isopropanol, לסגור את הבקבוקון לפזר את התערובת הדלילה באמבטיה ultrasonicator.
9. משיכה עם מזרק 250 μl כ 200 סלארי μl, הכנס את מחט המזרק בצינור 1/16 "PTFE של האיגוד הצצה, ולחלק את התערובת הדלילה לאט לתוך נימי OD 100 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר; להתבונן תחת מיקרוסקופ כמו נימים מתמלאות חלקיקים עד אורך של אריזת 2-3 מ"מ מושגת; זה יהיה microreactor (איור 1) 20 μ.נימים מ מזהה שומרות על חלקיקי microreactor דרך שפעת Keystone. ¹⁵
10. שוטפים את microreactor עם ~ 50 μl פתרון של H ₂ O / CH ₃ CN 50:50 v / v, ולאחר מכן עם ~ 50 μl פתרון של H ₂ O / CH ₃ CN 98: 2 V / V.

2. הכנת פתרונות לדוגמא

הערה: תפעול הכרוכות בטיפול של ממיסים אורגניים וחומצות והכנת הפתרון הם להתבצע במנדף. תלבש משקפי מגן, כפפות וביגוד מגן.

1. לשטוף עם CH ₃ OH ולייבש כמה צלוחיות זכוכית (4 מ"ל) צינורות פוליפרופילן (15 מ"ל).
2. הכן 10 מ"ל של פתרון של H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 V / V) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל ידי ערבוב 9.8 מ"ל H ₂ O עם 200 μl CH ₃ CN; ומערבבים על ידי sonication.
3. הכן 10 מ"ל של פתרון של H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל על ידי ערבוב 5 מ"ל H _{2 <}/ sub> O עם 5 מ"ל CH ₃ CN; ומערבבים על ידי sonication.
4. הכן 4 מ"ל של תמיסה מימית acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ"ל H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 V / V) בבקבוקון זכוכית 4 מ"ל; ומערבבים על ידי sonication.
5. הכן 4 מ"ל של פתרון אורגני acidified (נ 0.01% TFA / v) על ידי הוספת 4 μl TFA (10%) ל -4 מ"ל H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; ומערבבים על ידי sonication.
6. לשקול 16 מ"ג NH ₄ HCO ₃ עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; להוסיף 4 מ"ל של H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) פתרון ולפזר על ידי sonication; הדבר גורם פתרון 50 מ"מימ של NH ₄ HCO ₃ (pH ~ 7.8) במאגר מימי.
7. לשקול 5 מ"ג של חלבון סטנדרטי (למשל, אלבומין בסרום שור, המוגלובין α / β, ציטוכרום C, anhydrase פחמתית, α-2-HS-גליקופרוטאין, וכו ') עם microbalance אנליטיות בקבוקון זכוכית 4 מ"ל; להוסיף שתייה DI 4 מ"לr ולפזר על ידי sonication; זה בדרך כלל תוצאות פתרון ריכוז גבוהה מיקרומטר-רמה.
8. הכן 1 מ"ל פתרון חלבון (1-2 מיקרומטר) על ידי דילול פתרון ריכוז מיקרומטר ברמה גבוהה עם נפח מתאים של NH ₄ HCO ₃ (50 מ"מ) חיץ מימית; ומערבבים על ידי sonication.
9. הכן את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על ידי המסת טריפסין 20 מיקרוגרם רצף כיתה ב 170 μl NH ₄ HCO ₃ (50 מ"מ) חיץ מימית; לפזר על ידי sonication.

3. הגדרת ניסוי

הערה: מערכת LTQ-MS מצויד מקור ESI שונה הכוללת XYZ שלבית מובנה הביתה המאפשר התממשקות של ספקטרומטר מסה לגישות קלט מדגם שונים.

1. ניתקתי את microreactor הנימים מהאיגוד הצץ ולהתחבר טי הצץ.
2. הכנס ~ 2 ס"מ חוט Pt בזרוע בצד של טי הצצה; להשתמש שרוול הצצה "1/32 למתןדליפה ללא חיבור עבור בידוד חוט Pt.
3. חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ 'אורך) נימי מדגם העברה לקצה השני של טי הצצה; להשתמש שרוול 1/32 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
4. אבטח את טי הצצה על הבמה-XYZ ומקם את מ"מ ESI פולט ~ 2 הרחק נימי מפרצון ספקטרומטר מסה.
5. חבר את הכבל Pt למקור אספקת החשמל ESI של ספקטרומטר מסה.
6. חבר את הקצה השני של נימי העברת מדגם לאיחוד נירוסטה; להשתמש שרוול 1/16 "הצצה למתן חיבור דליפה חינם.
7. חבר צינורות PTFE 1/16 "4-5 ס"מ עד הסוף השני של האיחוד נירוסטה להכניס את המחט במזרק 250 μl בצינור PTFE; להפעיל את המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה לפי השווי הרצוי (למשל, 2 μl / min).
8. פרמטרי רכישת נתוני הקלט טנדם MS לתוך חבילת התוכנה שולטת מכשיר MSd לשמור כקובץ שיטה ולהכין את ההתקנה לביצוע הניתוח; עבור מערכת LTQ-MS, השתמש בפרמטרי ניתוח הנתונים התלויים הבאים: הדרה דינמית הופעל עבור 180 שניות עם רוחב המוני הדרת ± 1.5 מ '/ z; אחד MS סריקה ואחריו זום אחד ו- MS ² סריקות על 5 הפסגות האינטנסיביות ביותר העליונות, זום רוחב סריקת ± 5 מ '/ z; דיסוציאציה התנגשות מושרה (CID) פרמטרים שנקבעו ברוחב בידוד 3 מ '/ z, אנרגית התנגשות מנורמלת 35%, ש הפעלת 0.25, וזמן הפעלה של 30 מילים-שניות.

4. הגדרת Microfluidic

1. כן מכשיר microfluidic זכוכית או מצעים פולימריים; ^16-18 הפריסה של המכשיר מסופקת 2A איור, מורכב microreactor (1) (אורך רוחב 0.13 מ"מ x 2 מ"מ x 50 מיקרומטר עמוקים) מחוברים כניסה (2 ), מוצא (3) וכן יציאה בצד (4); ערוצי מקשרות מניפולציות fluidic הם ~110 מיקרומטר רחב ו ~ 50 מיקרומטר עמוק; מבנה רב (5), מורכב ~ 1.5-2 מיקרומטר עמוק x 10 מיקרומטר x הרחב 100 מיקרומטר microchannels הארוך להציב 25 מיקרומטר בנפרד, יפעל כמסנן עבור שמירה על חלקיקי microreactor.
2. הפעל חיבורים נוזלים למסירת השבב על ידי הדבקת מחברים מיוחדים ליציאות המפרצון, או על ידי המצאת עמדת פולימריים המתאימה אבזרים למסירת נוזל (איור 2 ב). ¹⁶
3. הכינו תרחיף של חלקיקים C18 (5 מיקרומטר) כמתואר בשלב 1.8; לספק את התערובת הדלילה אל microreactor עם מזרק באמצעות צינורות 1/16 "PTFE המחובר ליציאת שבב הצד (4); לאטום את הנמל לאחר טעינת חלקיק עם דבק אפוקסי תרופה עבור שעה 1 בתנור ב 90 ºC ^16.
4. הכנס נימי (20 מיקרומטר מזהה x 90 מיקרומטר OD x 10 מ"מ אורך) בנמל לשקע, חותם עם דבק E6000, ולתת תרופה O / N; זה יהפוך את פולט ESI ( 6).
5. חבר OD 50 מיקרומטר מזהה x 360 מיקרומטר (~ 0.5 מ 'אורך) נימי מדגם העברה לנמל כניסת שבב (2); חבר את הקצה השני של נימי מזרק μl 250 ואת משאבת מזרק, כמתואר 3.6-3.7.
6. מניח מחבר הצצה טי קל משקל על קו העברת מדגם קצר לפני יציאת הכניסה (2) והכניס תיל Pt על הזרוע בצד של טי, כמתואר 3.2; זה יהיה האלקטרודה ESI.
7. אבטח את המכשיר microfluidic על הבמה XYZ עם פולט ESI ממוצבת ~ 2 מ"מ מן נימי מפרצון ספקטרומטר מסה; להכין את MS לניתוח כמתואר 3.8.

5. טוען לדוגמא, פרוטאוליטים עיכול Elution עבור ניתוח MS

הערה: כל השלבים העברה פתרון / מדגם מבוצעים בעזרת משאבת מזרק וצריך לאפשר לכמה דקות נוספות כדי להשלים, כדי לפצות על-volum מתes הקשורים קווי העברה ומן microreactor; את הזמן הדרוש יהיה תלוי את הספיקות מעורבות.

1. שוטפים את microreactor ולהכינו ניתוח על ידי יציקת בתמיסה מימית של NH ₄ HCO ₃ (50 מ"מ) H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
2. טענו מדגם החלבון (1 מיקרומטר) על microreactor ידי יציקת הפתרון המדגם ב 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
3. להשרות את הפתרון טריפסין (5 מיקרומטר) על חלבון adsorbed על microreactor ב 2 μl / דקה במשך 1-3 דקות.
4. להרוות את תהליך העיכול פרוטאוליטים על ידי שטיפת microreactor עם בתמיסה מימית acidified של TFA (0.01% v / v) H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 V / V) בשעה 2 μl / דקה 5 דקות; להשתמש במזרק 250 μl.
5. התחל משחררי החלבון לעכל מן microreactor על ידי יציקת פתרון אורגני acidified של TFA (0.01%v / v) H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) ב 300 NL / min.
6. הפעל את תהליך רכישת נתונים MS ואת מתח ESI (~ 2,000 V); לרכוש נתונים MS באמצעות הפרמטרים רכישת נתונים הניתנים בשלב 3.8; להתבונן elution של פפטידים tryptic.

6. עיבוד נתונים

1. לעבד את הנתונים MS טנדם עם מנוע חיפוש תואם לפורמט נתונים MS גלם.
   1. לעבד את קבצי גלם LTQ-MS באמצעות אורגניזם ספציפי מינימאלי מסד נתוני חלבון מיותר; להעלות את הנתונים הגולמיים של מנוע החיפוש, להגדיר את העמידות המוני הורה שבר יון ל Da 2 ו -1, בהתאמה, ולהשתמש רק שברי tryptic מלא עם עד שני החמיץ שסעים עבור החיפוש; אינו מאפשר שינויי posttranslational; להגדיר את שיעורי גילוי הגבוהים וביטחון בינוני שווא (FDR) עד 1% ו -3%, בהתאמה, אינו מאפשר שינויי posttranslational.
2. לסנן את הנתונים כדי לבחור ברמת ודאות גבוהה רקפפטיד תואם את החלבונים המופיע במאגר; להעריך את תוצאות חלבון פפטיד-רמה.

תוצאות

תוצאת נציג של תהליך עיכול פרוטאוליטים בצעה בו זמנית על תערובת של חלבונים, עם microreactors המתואר לעיל (איורי 1 או 2), מופיע בלוח 1. הטבלה כוללת רצף הפפטידים הייחודי לזהות חלבון מסוים, הצלב מתאם ציון (Xcorr) (כלומר, ציון המאפיין את איכות המ?...

Discussion

Microreactor המתואר בעבודה זו מספק קל ליישם התקנה ניסיונית לביצוע עיכול אנזימטי של חלבונים כדי לאפשר ניתוח MS והזדהות תוך פחות מ -30 דקות. היתרונות הברורים של מערכת זו, בהשוואת גישות קונבנציונליות, כוללים פשטות, מהירות, צריכת מגיב נמוכה ועלויות נמוכות. בפרט, אין צורך חרוזי מח?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111