Enzimática processamento rápido de proteínas para a detecção MS com um micro-reator de fluxo-through

Resumo

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Resumo

A grande maioria de espectrometria de massa (MS) baseados em métodos de análise de proteínas envolvem um passo de digestão enzimática antes da detecção, tipicamente com tripsina. Este passo é necessário para a geração de péptidos de baixo peso molecular, geralmente com PM <3000-4000 Da, que caem dentro do intervalo de varrimento efectivo de instrumentação de espectrometria de massa. protocolos convencionais envolvem O / N digestão enzimática a 37 ºC. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de uma variedade de estratégias, que envolvem normalmente a utilização de um micro-reactor com enzimas imobilizadas ou de uma variedade de processos físicos complementares que reduzem o tempo necessário para a digestão proteolítica de alguns minutos (por exemplo, microondas ou alta pressão). Neste trabalho, nós descrevemos um método simples e de baixo custo que pode ser implementado em qualquer laboratório para a realização rápida digestão enzimática de uma proteína. O (ou mistura de proteína) proteína é adsorvida em alta perf de fase inversa C18-ligadoormance partículas de sílica com cromatograf ia líquida (HPLC), pré-carregados numa coluna capilar, e com tripsina em tampão aquoso é administrada por perfusão durante as partículas para um curto período de tempo. Para permitir a detecção em linha de MS, os peptídeos trípticos são eluídas com um sistema de solvente com o aumento do teor orgânico directamente na fonte de iões de MS. Esta abordagem evita a utilização de partículas de alto preço enzima imobilizada e não necessitam de qualquer ajuda para completar o processo. a digestão de proteínas e a análise da amostra completa pode ser realizada em menos de 3 minutos ~ e ~ 30 min, respectivamente.

Introdução

A identificação e caracterização das proteínas purificadas é frequentemente conseguido através de técnicas de MS. A proteína é digerido com uma enzima e os seus péptidos são ainda analisados ​​por MS utilizando uma configuração experimental simples de infusão. A digestão proteolítica é necessário para a geração de fragmentos peptídicos pequenos que caem na gama de massa da maioria dos analisadores útil MS, e que pode ser facilmente fragmentado por baixo de energia de colisão de dissociação induzida para gerar informação sobre a sequência de aminoácidos. Para as proteínas isoladas ou misturas de proteínas simples, não há mais necessidade de separação cromatográfica dos péptidos antes da detecção MS. Uma mistura de péptidos 25-50 podem ser facilmente analisadas por infusão da amostra com uma bomba de seringa directamente na fonte de iões de MS.

O espectrómetro de massa pode realizar a análise e confirmar a sequência de uma proteína dentro de um curto espaço de tempo. Com os métodos modernos de aquisição de dados, este processo pode ser realizado Within alguns minutos ou mesmo segundos. O fator limitante para completar todo o processo em uma escala de tempo curta é a etapa de digestão proteolítica. Normalmente, isto é realizado ao longo de algumas horas (ou O / N), em solução, a 37 ºC, utilizando substrato: rácios de enzimas de (50-100): 1. Para reduzir o tempo de digestão enzimática para minutos ou segundos, microrreactores enzima imobilizada, sob a forma de reactores de microfluidos ou cartuchos disponíveis comercialmente, foram descritos. ^06/01 Tipicamente, a enzima é imobilizada por ligação covalente, não-covalente / adsorção física, complexo formação ou encapsulamento, ^3,6 a eficiência melhorada do processo enzimático a ser activada pela grande superfície para volume e rácios de enzima e substrato. As vantagens adicionais de reactores imobilizadas incluem a redução da autólise e interferência do enzima na análise de MS, melhorou a estabilidade da enzima e reutilização. Uma variedade de abordagens, utilizando vidro ou dispositivos microfabricados poliméricos têm sido descritos,usando enzimas imobilizadas em esferas magnéticas por interações antígeno-anticorpo, ^7,8 aprisionados em redes de nanopartículas de ouro, ⁹ encapsulado em titânia de alumina sol-gel ¹⁰ e nanozeolites, ¹¹ ou capturados através de Ni-NTA ou His-Tag formação do complexo. ⁶ Alternativamente , capilares tubulares abertas com enzimas imobilizadas têm sido desenvolvidos, assim. ¹² além disso, a clivagem proteolítica aumentada foi demonstrada utilizando a irradiação de microondas controlado ¹³ ou assistida por pressão ou ciclagem tecnologia pressão (PCT) para reduzir os tempos de reacção a 30-120 min. ¹⁴

Apesar das várias vantagens de reactores de enzimas imobilizadas, os custos de cartuchos comerciais é alta, a disponibilidade de dispositivos de microfluidos para uso de rotina é limitado, e o uso de tecnologias de micro-ondas ou de PCT resultados em necessidade de instrumentação adicional. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método que circumvents estas desvantagens, e que pode ser facilmente implementado em cada laboratório para capacitar investigadores com uma abordagem simples e eficaz para a realização de clivagem enzimática das proteínas na preparação para análise por MS em poucos minutos. A abordagem baseia-se na utilização de, C18-partículas hidrofóbicas, que são pré-carregados em um capilar ou dispositivo de microfluidos, e a adsorção da proteína (s) de interesse sobre essas partículas, seguido por digestão enzimática durante a infusão da enzima sobre o de leito fixo e de proteína (s) capturado. Nesta abordagem, o substrato é imobilizada através de interacções não covalentes, e a enzima é infundido através da proteína imobilizada. A eficiência proteolítica digestão é aumentada pelas grandes áreas de superfície de partícula que expõem a proteína para o processamento enzimático, as distâncias e os tempos de difusão de e para a superfície de partículas reduzido, uma melhor transferência de massa, sem ligação covalente que pode afectar a actividade da enzima, a capacidade Avaliado com a rapideze combinações de diferentes enzimas, descartável, e a multiplexação, se o processo é executado num formato de microfluidos. Esta abordagem é demonstrada com o uso de uma mistura de proteínas padrão e tripsina a enzima mais comumente utilizado para a digestão proteolítica antes da detecção ESI-MS. O espectrómetro de massa utilizados para a detecção neste estudo foi um instrumento linear armadilha de quadrupolo (LTQ).

Protocolo

1. Preparação do capilar microrreactor

1. Cortar o diâmetro interno 100 um (ID) x 360 uM exterior capilar diâmetro (DO) a um comprimento de 7-8 cm, e a 20 uM ID x 90 um OD capilar de 3-5 cm com o cutelo de capilar em vidro; verificar sob o microscópio que ambas as extremidades capilares têm um corte limpo, em linha reta, sem quaisquer rebarbas salientes.
2. Inserir a 20 um x 90 um ID OD capilar para um final de 100 uM ID x 360 uM OD capilar, para um comprimento de ~ 6 mm; em caso de necessidade, observar esta operação sob um microscópio.
3. Aplique uma pequena gota de E6000 cola em torno da junção dos 90 mm OD / 100 capilares mm ID com o fim de um Q-tip, e deixe a cola cura O / N à temperatura ambiente.
4. Cortar a 20 um x 90 um ID OD capilar inserido com um comprimento de ~ 10-15 mm; este vai ser o emissor de ionização por electropulverização.
5. Pré-cortar a 1/32 "OD PEEK, 1/16" PEEK OD e 1/16 "banheira de PTFE ODing em pedaços de 4-5 cm de comprimento; estas serão as mangas utilizados em uniões capilares para fornecer uma conexão livre de vazamento.
6. Ligar a extremidade oposta da 100 mm Dl x 360 uM OD capilar para uma união PEEK; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
7. Inserir / apertar uma peça de ~ 5 cm de comprimento tubagem de PTFE 1/16 "para a extremidade oposta da união.
8. Pesar ~ 4 mg de C18 (5 uM), em partículas de um pré-limpos / secos frasco de 2 ml de vidro; adicionar 0,5 ml de isopropanol, fechar o recipiente e dispersar a pasta no banho ultrasonicator.
9. Retirar com uma seringa de 250 ul a cerca de 200 pasta ul, inserir a agulha da seringa no "tubo de 1/16 PTFE da união PEEK, e dispensar lentamente a pasta para o 100 mm ID x 360 mm OD capilar; observar ao microscópio como a capilar enche de partículas até um comprimento de 2-3 mm de embalagem é obtida, o que irá ser o micro-reactor (Figura 1) a 20 μ.m ID capilar retém as partículas na micro-reactor por meio de um efeito de distorção. ¹⁵
10. Lavar o microrreactor com ~ 50 ul de solução de _H2O / _CH3CN 50:50 v / v, e em seguida, com solução de ~ 50 ul de _H2O / _CH3CN 98: 2 v / v.

2. Preparação das Soluções Amostra

Nota: As operações que envolvam o manuseamento de solventes e ácidos orgânicos e preparação da solução são para ser executadas numa hotte. Usar óculos, luvas e vestuário de protecção.

1. Lavar com _CH3OH e secar alguns frascos de vidro (4 mL) e tubos de polipropileno (15 ml).
2. Preparar 10 ml de uma solução de _H2O / _CH3CN (98: 2 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 9,8 ml _{de H2O} com 200 ul _{de CH3CN;} misture com ultra-sons.
3. Preparar 10 ml de uma solução de _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) em um tubo de 15 ml de polipropileno por mistura de 5 ml de H _{2 <}/ sub> O com 5 ml CH ₃ CN; misture com ultra-sons.
4. Prepare a 4 ml de uma solução aquosa acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
5. Prepare a 4 ml de uma solução orgânica acidificada (TFA a 0,01% v / v) através da adição de 4 mL de TFA (10%) a 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) em um frasco de vidro de 4 mL; misture com ultra-sons.
6. Pesar 16 mg _de NH ₄ HCO ₃ com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicionar 4 ml de H ₂ O / CH ₃ CN: solução (98 2 v / v) e dispersa-se por ultra-sons; isto resulta em uma solução 50 mM de NH ₄ HCO ₃ (pH ~ 7,8) em tampão aquoso.
7. Pesar 5 mg de uma proteína padrão (por exemplo, albumina de soro bovino, a hemoglobina α / β, citocromo C, anidrase carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc) com uma microbalança analítica em um frasco de vidro de 4 mL; adicione 4 ml wate DIR e dispersar por sonicação; Isto normalmente resulta numa solução de elevada concentração de nível uM.
8. Prepare 1 ml de solução de proteína (1-2? M), diluindo a solução de concentração elevada de nível um, com um volume adequado de NH ₄ HCO ₃ (50 mM), tampão aquoso; misture com ultra-sons.
9. Preparar a solução de tripsina (5 ^ M) por dissolução de 20 ug de tripsina de grau de sequenciação-em 170 mL _de NH ₄ HCO ₃ (50 mM), tampão aquoso; dispersar por sonicação.

3. Configuração Experimental

Nota: O sistema LTQ-MS está equipado com uma fonte ESI modificado que inclui uma XYZ-estágio home-construído, que permite a interface do espectrômetro de massa para várias abordagens de entrada da amostra.

1. Desligue o microreator capilar a partir da união PEEK e se conectar à PEEK Tee.
2. Insira fio Pt A ~ 2 cm de comprimento no lado-braço do PEEK T; utilizar uma "manga PEEK 1/32 para fornecer umaconexão e para o isolamento do fio Pt livre de vazamento.
3. Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para a extremidade oposta do PEEK T; usar uma luva 1/32 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
4. Fixe o Tee PEEK na XYZ-stage e posicione o ESI emissor ~ 2 mm de distância da massa capilar de entrada espectrômetro.
5. Ligue o fio de Pt à fonte de alimentação de energia ESI do espectrômetro de massa.
6. Ligar a extremidade oposta do capilar de transferência de amostras para a união de aço inoxidável; usar uma luva 1/16 "PEEK para fornecer uma conexão livre de vazamento.
7. Conectar um 4-5 cm de comprimento "1/16 tubagem de PTFE para a extremidade oposta da união de aço inoxidável e inserir a agulha da seringa de 250 ul na tubagem de PTFE; ligar a bomba e ajustar a taxa de fluxo no valor desejado (por exemplo, 2 ul / min).
8. em tandem entrada parâmetros MS de aquisição de dados para o pacote de software que controla o instrumento de MSd salvar como um arquivo método para pronta a configuração para realizar a análise; para o sistema LTQ-MS, use os parâmetros de análise dependentes seguintes dados: a exclusão dinâmica habilitado para 180 segundos com largura de massa exclusão ± 1,5 m / z; uma MS varredura seguido por um zoom e MS ² varreduras em 5 melhores picos mais intensos, aumentar a largura de digitalização ± 5 m / z; dissociação induzida por colisão (CID) parâmetros definidos no isolamento largura de 3 m / z, energia de colisão normalizada de 35%, a activação Q 0.25, e tempo de activação 30 ms.

4. Setup Microfluidic

1. Preparar um dispositivo de microfluidos de vidro ou substratos poliméricos; ^16-18 a disposição do dispositivo é fornecida na Figura 2A, que consiste de um micro-reactor (1) (0,13 mm Comprimento largura x 2 mm x 50 mm de profundidade) ligada a uma entrada (2 ), saída (3) e uma porta lateral (4); os canais comunicantes para manipulações são fluídicos ~110 uM de largura e ~ 50 mm de profundidade; uma estrutura de múltiplos canais (5), que consiste em ~ 1,5-2 uM de profundidade x 10 m de largura x 100 mm de comprimento colocados microcanais de 25 um para além, irá actuar como um filtro para a retenção das partículas no microrreactor.
2. Ative as conexões de fluido de entrega para o chip por meio de colagem conectores especializados para as portas de entrada, ou através da elaboração de um suporte polimérico que acomoda acessórios para fornecimento de fluido (Figura 2B). ¹⁶
3. Prepara-se uma pasta fluida de partículas de C18 (5 uM) tal como descrito no passo 1.8; fornecer a pasta para o micro-reactor com uma seringa usando 1/16 "tubagem de PTFE ligado à porta lateral do chip (4); selar a porta após o carregamento de partícula com cola epóxi e cura durante 1 hora num forno a 90 ° C ^16.
4. Inserir um capilar (20 uM ID x 90 um comprimento OD x 10 mm) no orifício de saída, selar com cola E6000, e deixar cura S / N; isso vai se tornar o emissor ESI ( 6).
5. Conectar um 50 mm ID x 360 uM OD (~ 0,5 m de comprimento) de transferência das amostras capilar para o orifício de entrada do chip (2); ligar a extremidade oposta do tubo capilar a uma seringa de 250 ul e a bomba de seringa, tal como descrito em 3,6-3,7.
6. Coloque um leve conector PEEK T na linha de transferência de amostras imediatamente antes da abertura de entrada (2) e inserir um fio de Pt sobre o lado do braço do T, como descrito no ponto 3.2; este será o eletrodo ESI.
7. Fixar o dispositivo de microfluidos na fase XYZ com o emissor ESI posicionado ~ 2 mm de distância do capilar massa espectrómetro de entrada; preparar a MS para análise tal como descrito em 3.8.

5. Amostra de carregar, digestão proteolítica e eluição por análise por MS

Nota: Todos os passos de transferência de solução / amostra são realizadas com o auxílio de uma bomba de seringa e deveria permitir a alguns minutos adicionais para completar, para compensar os mortos-volumes associados com as linhas de transferência de e para o micro-reactor; o tempo necessário dependerá das taxas de fluxo envolvidos.

1. Lavar o microrreactor e prepará-la para a análise por infusão de uma solução aquosa de NH ₄ HCO ₃ (50 mM) em H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
2. Carregar a amostra de proteína (1 uM) no micro-reactor por infusão da solução de amostra a 2 mL / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
3. Infundir a solução de tripsina (5 uM) sobre a proteína adsorvida no micro reactor em 2 ul / min durante 1-3 min.
4. Extingue-se o processo de digestão proteolítica, por lavagem do micro-reactor com uma solução aquosa acidificada de TFA (0,01% v / v) em H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) em 2 ul / min durante 5 min; usar uma seringa de 250 ul.
5. Iniciar eluindo a digestão de proteínas a partir do micro-reactor por infusão de uma solução orgânica acidificada de TFA (0,01%v / v) em _H2O / _CH3CN (50:50 v / v) em 300 nl / min.
6. Ligue o processo de aquisição de dados de MS e a voltagem ESI (~ 2000 V); adquirir dados de MS, utilizando os parâmetros de aquisição de dados fornecidos no passo 3.8; observar a eluição dos péptidos trípticos.

6. Processamento de Dados

1. Processar os dados em tandem MS com um motor de busca compatível com o formato de dados MS-primas.
   1. Processar os arquivos raw LTQ-MS, utilizando um organismo banco de dados específico de proteína minimamente redundantes; fazer o upload dos dados brutos no motor de busca, definir as tolerâncias de massa pai e de iões fragmento a 2 e 1 Da, respectivamente, e usar apenas fragmentos totalmente trípticos com até dois perderam clivagens para a busca; não permitem modificações pós-translacionais; definir os de média e alta confiança falsos taxas de detecção (FDR) para 1% e 3%, respectivamente, e não permitem modificações pós-translacionais.
2. Filtrar os dados para selecionar apenas de alta confiançapéptido corresponde às proteínas na base de dados; avaliar os resultados de proteína e de nível de péptido.

Resultados

Um resultado representativo de um processo de digestão proteolítica realizado simultaneamente com uma mistura de proteínas, com os micro-reactores acima descritos (Figuras 1 ou 2), é fornecida na Tabela 1. A tabela compreende as sequências de péptidos únicas que identificam uma proteína em particular, a cruz o resultado de correlação (Xcorr) (isto é, uma pontuação que caracteriza a qualidade do jogo experimental-a-teórica para o es...

Discussão

O microreator descrito neste trabalho fornece um fácil de implementar configuração experimental para a realização de digestão enzimática de proteínas para permitir a análise MS e identificação em menos de 30 min. As vantagens deste sistema, em comparação com métodos convencionais, incluem a simplicidade, a velocidade e baixo consumo de reagentes e baixo custo. Em particular, não há necessidade de caros esferas de tripsina imobilizada e os cartuchos. A preparação do microreator capilar é simples

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111