Быстрое Ферментативный Обработка белков для обнаружения MS с проточный микрореакторе

Резюме

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Аннотация

Подавляющее большинство масс-спектрометрии (МС) основе методов анализа белка включают стадию переваривания ферментативная до обнаружения, как правило, с помощью трипсина. Этот шаг необходим для генерации малых пептидов молекулярной массой, как правило, с MW <3000-4000 Da, которые находятся в пределах эффективного диапазона сканирования масс-спектрометрии приборов. Обычные протоколы включают O / N ферментативного расщепления при 37 ° С. Последние достижения привели к разработке различных стратегий, как правило , связанных с использованием микрореакторе с иммобилизованными ферментами или целого ряда дополнительных физических процессов , которые уменьшают время , необходимое для протеолитического расщепления в течение нескольких минут (например, микроволновая печь или высоко- давление). В этой работе мы опишем простой и экономически эффективный подход, который может быть реализован в любой лаборатории для достижения быстрого ферментативного расщепления белка. Белок (или протеиновую смесь) адсорбируют на С18-скрепленные с обращенной фазой высокой перфорацияormance жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) частицы диоксида кремния, предварительно загруженные в капиллярной колонкой, и трипсина в водном буфере вливают над частицами в течение короткого периода времени. Чтобы включить он-лайн обнаружения MS, Триптические пептиды элюируют системой растворителей, с повышенным содержанием органических веществ непосредственно в источнике ионов МС. Такой подход позволяет избежать использования частиц дорогостоящих иммобилизованного фермента и не требует какой-либо помощи для завершения процесса. Переваривания белков и полный анализ образца может быть достигнуто менее чем за ~ 3 мин и ~ 30 мин, соответственно.

Введение

Идентификация и характеристика очищенных белков часто достигается за счет использования методов масс-спектрометрии. Белок переваривается с ферментом и его пептиды дополнительно анализируются с помощью МС с помощью простого инфузионную экспериментальной установки. Протеолитическим расщеплением необходимо для генерации небольших пептидных фрагментов, которые попадают в полезном диапазоне масс большинства анализаторов MS, и которые могут быть легко фрагментированы с помощью низкой энергии соударения индуцированной диссоциации для генерирования информации о последовательности аминокислот. Для получения изолированных белков или простых смесей белков, нет необходимости в дальнейшем хроматографического разделения пептидов до обнаружения MS. Смесь 25-50 пептидов могут быть легко проанализированы путем инфузии образца с помощью шприца непосредственно в источнике ионов МС.

Масс-спектрометр может провести анализ и подтвердить последовательность белка в течение короткого периода времени. С помощью современных методов сбора данных, этот процесс может быть достигнуто шithin несколько минут или даже секунд. Сдерживающим фактором в завершении всего процесса на коротком временном масштабе является протеолитический стадия пищеварения. Как правило, это осуществляется в течение нескольких часов (или O / N) в растворе, при 37 ° С, с использованием субстрата: ферментные соотношения (50-100): 1. Для уменьшения ферментативной время пищеварения минут или секунд, иммобилизованных микрореакторы фермента, в виде микрофлюидальных реакторов или коммерчески доступные картриджи, которые были описаны. ^1-6 Как правило, фермент иммобилизован ковалентным, нековалентная / физической адсорбции, комплекс формирование или инкапсуляция, ^3,6 повышенная эффективность процесса ферментативного быть включен по большой поверхности к объему и соотношения фермент-к-подложке. Дополнительные преимущества иммобилизованных реакторов включают снижение автолиза и помех от фермента в анализе MS, улучшенную стабильность фермента и возможность многократного использования. Разнообразие подходов, с использованием стекла или полимерных микроизготовленном устройств были описаны,с использованием ферментов , иммобилизованных на магнитных шариков с помощью антиген-антитело взаимодействий, ^7,8 захваченный в золотых наночастиц сетей, ⁹ воплощен в оксид титана-оксид алюминия золь-гелей ¹⁰ и nanozeolites, ¹¹ или захвачены в плен через Ni-NTA или Его-Таг формирования комплекса. ⁶ В качестве альтернативы , открытой трубчатые капилляры с иммобилизованными ферментами были разработаны, а также. ¹² Кроме того, повышенная протеолитическое расщепление было продемонстрировано с помощью контролируемого микроволнового излучения ¹³ или давления , при содействии или под давлением технологии непрерывной цикличности (РСТ) для уменьшения времени реакции до 30-120 мин. ¹⁴

Несмотря на многочисленные преимущества иммобилизованных реакторов фермента, стоимость коммерческих картриджей высока, наличие микрофлюидальных устройств для повседневного использования ограничено, а также использование результатов микроволновые или РСТ технологии нуждаются в дополнительной аппаратуры. Цель данной работы заключалась в разработке метода, который circumveNTS эти недостатки, и которые могут быть легко реализованы в любой лаборатории, чтобы расширить возможности исследователей с простым и эффективным подходом для осуществления ферментативного расщепления белков в процессе подготовки к анализу MS в течение нескольких минут. Подход основан на использовании гидрофобных, С18-частиц, которые предварительно загружены в капилляре или микрожидком устройстве, и адсорбцию белка (ов), представляющие интерес на эти частицы с последующим ферментативным расщеплением во время инфузии фермента над уплотненный слой и захватили белок (белки). При таком подходе субстрат иммобилизованные через нековалентных взаимодействий, а фермент вливают над иммобилизованным белком. Эффективность протеолитического расщепления увеличивается на большой поверхности частиц областей, которые выставляют белок для обработки ферментативной, уменьшение расстояния и времени диффузии и из поверхности частиц, улучшается перенос массы, отсутствие ковалентное, которые могут влиять на активность фермента, способность быстро evaluatе комбинации различных ферментов, одноразовости и мультиплексированием, если процесс выполняется в микрожидком формате. Этот подход демонстрируется с использованием смеси стандартных белков и трипсин-наиболее часто используемым ферментом для протеолитического расщепления до обнаружения ESI-MS. Масс-спектрометр используется для обнаружения в данном исследовании была линейная ловушка квадрупольного (LTQ) инструмент.

протокол

1. Получение капилляра микрореакторе

1. Обрежьте внутренний диаметр 100 мкм (ID) х наружный диаметр (OD) капилляра 360 мкм в длину 7-8 см, а 20 мкм ID х 90 мкм OD капиллярную 3-5 см со стеклянной капиллярной скалывателе; проверить под микроскопом, что оба капиллярные концы имеют чистый, ровный срез, без каких-либо выступающих заусенцев.
2. Вставьте 20 мкм ID х 90 мкм OD капилляр в один конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, при длине ~ 6 мм; в случае необходимости, соблюдать эту операцию под микроскопом.
3. Нанесите маленькую капельку клея E6000 вокруг стыке мкм ID капилляров 90 мкм OD / 100 с концом ватной палочкой, и пусть клей лечения O / N при комнатной температуре.
4. Вырезать 20 мкм, вставленный ID х 90 мкм OD капилляр длиной ~ 10-15 мм; это будет ионизацией электрораспылением эмиттера.
5. Предварительно сократить 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK и 1/16 "OD PTFE ваннаING на куски 4-5 см в длину; это будут рукава, используемые в капиллярных союзах для обеспечения подключения к герметичны.
6. Подключите противоположный конец 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра к PEEK союза; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
7. Вставить / затянуть кусок ~ 5 см длиной 1/16 "PTFE трубки в противоположный конец союза.
8. Взвесить ~ 4 мг С18 (5 мкм) частиц в предварительно очищенный / сушат 2 пузырек мл стекл; добавляют 0,5 мл изопропанола, закройте пробирку и дисперсных суспензии в ванне ультразвукового дезинтегратора.
9. Вывод с помощью 250 мкл шприца приблизительно 200 мкл суспензии, вставьте иглу шприца в "PTFE трубки из PEEK союза 1/16, и медленно дозировать суспензии в 100 мкм ID х 360 мкм OD капилляра, наблюдать под микроскопом, что и капиллярная заполняет с частицами до тех пор , длиной 2-3 мм упаковки достигается, это будет микрореактор (рис 1) 20 μ.м ID капиллярная удерживает частицы в микрореакторе через Keystone эффект. ¹⁵
10. Ополосните микрореактор с ~ 50 мкл раствора H ₂ O / CH ₃ CN 50:50 об / об, а затем с ~ 50 мкл раствора H ₂ O / CH ₃ CN 98: 2 об / об.

2. Приготовление растворов образцов

Примечание: Операции, которые вовлекают обработки органических растворителей и кислот и приготовления раствора должны быть выполнены в вытяжном шкафу. Носите защитные очки, перчатки и защитную одежду.

1. Ополосните CH ₃ OH и высушить несколько стеклянных флаконах (4 мл) и полипропиленовые пробирки (15 мл).
2. Приготовьте 10 мл раствора H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 9,8 мл H ₂ O с 200 мкл CH ₃ CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
3. Приготовьте 10 мл раствора H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 об / об) в 15 мл полипропиленовую пробирку путем смешивания 5 мл H _{2 <}/ суб> O 5 мл CH ₃ CN; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
4. Приготовьте 4 мл подкисленного водного раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 об / об) в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
5. Приготовьте 4 мл подкисленного органического раствора (ТФУ 0,01% об / об) путем добавления 4 мкл TFA (10%) в 4 мл H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 об / об) в стеклянную пробирку 4 мл; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
6. Взвесить 16 мг NH ₄ HCO ₃ с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл H ₂ O / CH ₃ CN: раствор (98 2 об / об) и дисперсных с помощью ультразвука; это приводит к 50 мМ раствора NH ₄ HCO ₃ (рН ~ 7,8) в водном буфере.
7. Взвесить 5 мг стандартного белка (например, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин α / β, цитохром С, карбоангидразы, α-2-HS-гликопротеина и т.д.) с аналитическим микровесов в стеклянную пробирку емкостью 4 мл; добавить 4 мл ДИ Wateг и рассеивать с помощью ультразвука; Как правило, это приводит к концентрации раствора высокой мкМ уровня.
8. Готовят 1 мл раствора белка (1-2 мкм) путем разбавления раствора высокой концентрации мкМ уровне с соответствующим объемом NH ₄ HCO ₃ (50 мМ) водного буфера; перемешать с помощью обработки ультразвуком.
9. Готовят раствор трипсина (5 мкМ) , при растворении 20 мкг секвенирование класса трипсина в 170 мкл NH ₄ HCO ₃ (50 мМ) водного буфера; рассеивать путем обработки ультразвуком.

3. Экспериментальная установка

Примечание: Система LTQ-МС оснащена модифицированным источником ESI, который включает самодельный XYZ-этап, который позволяет состыковка масс-спектрометр для различных входных выборок подходов.

1. Отсоедините капиллярную микрореактор из PEEK союза и подключения к PEEK Tee.
2. Вставьте долго ~ 2 см провод Pt в боковом плече PEEK Tee; используйте 1/32 "PEEK втулка дл обеспеченигерметичны соединения и для изоляции провода Pt.
3. Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярную на противоположном конце PEEK Tee; использование 1/32 "PEEK рукав а для обеспечения подключения к герметичны.
4. Закрепите PEEK тройник на XYZ-стадии и положение ESI эмиттер ~ 2 мм от масс-спектрометра на входе капилляра.
5. Подключите провод Pt к источнику питания ESI масс-спектрометра.
6. Подключите противоположный конец передачи образца капилляра к штуцеру из нержавеющей стали; использование 1/16 "PEEK втулка с для обеспечения подключения к герметичны.
7. Подключение длиной 4-5 см 1/16 "PTFE трубки к противоположному концу союза из нержавеющей стали и вставьте 250 мкл иглу шприца в тефлоновой трубке, включите насос и установить скорость потока на необходимом уровне (например, 2 мкл / мин).
8. Входные параметры тандем MS сбора данных в пакет программного обеспечения, который управляет прибором МСd сохранить в виде файла метода к готовой установки для выполнения анализа; для системы LTQ-MS, используйте параметры анализа зависимые следующие данные: динамическое исключение позволило в течение 180 сек с шириной исключения масс ± 1,5 м / г; один MS сканирование с последующим одним зумом и MS ² сканирует на топ - 5 наиболее интенсивных пиков, увеличить ширину сканирования ± 5 м / г; столкновения индуцированной диссоциации (CID) параметры, установленные по ширине изоляции 3 м / г, нормированной энергии столкновения 35%, активации Q 0,25 и времени активации 30 мс.

4. Микрожидкостных Setup

1. Подготовьте микрожидком устройство из стекла или полимерных подложек; ^16-18 компоновка устройства обеспечивается на рисунке 2А, состоящий из микрореакторе (1) (0,13 мм длина х ширина 2 мм х 50 мкм , глубиной) , соединенную с входным отверстием (2 ), выходное отверстие (3) и боковое отверстие (4); соединительные каналы для жидкостных манипуляций ~110 мкм в ширину и ~ 50 мкм глубиной; многоканальная структура (5), состоящая из ~ 1.5-2 мкм глубиной х 10 мкм в ширину х 100 мкм длиной микроканалы помещены 25 мкм друг от друга, будут действовать в качестве фильтра для удержания частиц в микрореакторе.
2. Включение соединения жидкости доставки к чипу склеиванием специализированные разъемы к портам на входе, или путем разработки полимерного стенд , который приспосабливает фитинги для подачи жидкости (рис 2В). ¹⁶
3. Приготовьте суспензию частиц C18 (5 мкм), как описано в пункте 1.8; доставить суспензии до микрореакторе с помощью шприца с помощью 1/16 "PTFE трубки , соединенный с чипом порта (4); герметизировать отверстие после загрузки частиц с эпоксидным клеем и отверждения в течение 1 ч в печи при 90 ° С ^16.
4. Вставьте капилляр (20 мкм ID х 90 мкм длиной OD х 10 мм) в выходном отверстии, печать с E6000 клеем, и пусть лекарство O / N; это станет ESI эмиттер ( 6).
5. Подключение 50 мкм ID х OD 360 мкм (~ 0,5 м длиной) перенос образца капиллярного к входному порту чипа (2); подсоедините противоположный конец капиллярной к 250 мкл шприца и шприцевой насос, как описано в 3,6-3,7.
6. Поместите облегченной PEEK Tee разъем на линии передачи образца непосредственно перед впускным отверстием (2) и вставить провод Pt на боковой ручке тройника, как описано в пункте 3.2; это будет ESI электрод.
7. Закрепите микрожидкостных устройств на этапе XYZ с эмиттером ESI, расположенной ~ 2 мм от впускного масс-спектрометра капилляра; подготовить МС для анализа, как описано в 3.8.

5. Образец Загрузка, протеолитическим расщеплением и элюирования для MS Analysis

Примечание: Все шаги передачи раствор / образец выполняются с помощью шприцевого насоса и должен позволить в течение нескольких дополнительных минут для завершения, чтобы компенсировать мертвой Volumэс, связанные с линиями передачи и из микрореакторе; необходимое время будет зависеть от скорости потока, участвующих.

1. Ополосните микрореактор и подготовить его для анализа путем инфузии водного раствора NH ₄ HCO ₃ (50 ммоль) в H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 об / об) в 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
2. Нагрузка образца белка (1 мкМ) на микрореакторе настаиванием раствор образца по 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
3. Влить раствор трипсина (5 мкМ) в течение адсорбированного белка на микрореакторе в 2 мкл / мин в течение 1-3 мин.
4. Гасят протеолитическую процесс пищеварения путем промывки микрореакторе с подкисленным водным раствором TFA (0,01% об / об) в H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 об / об) со скоростью 2 мкл / мин в течение 5 мин; используют 250 мкл шприца.
5. Начать элюируют протеин переваривается из микрореакторе настаиванием подкисленного органического раствора TFA (0,01%об / об) в H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 об / об) со скоростью 300 л / мин.
6. Включите процесс сбора данных MS и напряжение ESI (~ 2000 В); сбор данных MS, используя параметры сбора данных, представленных в шаге 3.8; наблюдать элюцию триптических пептидов.

6. Обработка данных

1. Процесс данные тандем MS с поисковой системой, совместимой с исходным форматом данных MS.
   1. Процесс исходных файлов LTQ-MS, используя организм определенной базы данных минимально избыточных белков; загрузить исходные данные в поисковой системе, установить массовые допуски родительских и ионных фрагментов до 2 и 1 Da, соответственно, и использовать только полностью триптические фрагменты до двух пропущенных расколы для поиска; не позволяют посттрансляционных модификаций; установить высокие и средние доверительный уровень ложных обнаружения (FDR) до 1% и 3%, соответственно, и не позволяют посттрансляционных модификаций.
2. Фильтрация данных, чтобы выбрать только высокое довериепептид соответствует с белками в базе данных; оценить белковые и пептидные на уровне результатов.

Результаты

Представитель результатом протеолитического процесса пищеварения осуществляется одновременно на смеси белков, с описанными выше микрореакторы (фиг.1 или 2), представлена ​​в таблице 1. Таблица содержит уникальные пептидные последовательности , ко?...

Обсуждение

Микрореактор описано в данной работе, обеспечивает простую в реализации экспериментальной установки для осуществления ферментативного расщепления белков для проведения анализа MS и идентификацию менее чем за 30 мин. Явные преимущества этой системы, по сравнению с традиционными подхо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111