Veloce enzimatica Trattamento di proteine ​​per MS rilevamento con un microreattore flusso-through

Riepilogo

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

Abstract

La grande maggioranza di spettrometria di massa (MS) a base di metodi di analisi di proteine ​​implicano un'attività digestione enzimatica prima della rivelazione, tipicamente con tripsina. Questo passo è necessario per la generazione di piccoli peptidi peso molecolare, generalmente con MW <3000-4000 Da, che rientra nell'intervallo di scansione effettiva della strumentazione di spettrometria di massa. protocolli convenzionali coinvolgono O / N digestione enzimatica a 37 ° C. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di una varietà di strategie, tipicamente coinvolge l'uso di un microreattore con enzimi immobilizzati o di una serie di processi fisici complementari che riducono il tempo necessario per proteolitica digestione per alcuni minuti (per esempio, microonde o ad alta pressione). In questo lavoro, si descrive un approccio semplice e conveniente che può essere implementato in qualsiasi laboratorio per la realizzazione rapida digestione enzimatica di una proteina. La proteina (o miscela di proteine) è adsorbito sulla alta perf C18-bonded fase inversaormance particelle di silice cromatografia liquida (HPLC) precaricate in una colonna capillare, e tripsina in tampone acquoso viene infusa in particelle per un breve periodo di tempo. Per attivare il rilevamento on-line MS, i peptidi triptici vengono eluite con un sistema solvente con maggiore contenuto organico direttamente nella sorgente MS ioni. Questo approccio consente di evitare l'uso di particelle ad alto prezzo degli enzimi immobilizzati e non richiede alcun aiuto per il completamento del processo. Protein digestione e l'analisi del campione completo può essere realizzato in meno di ~ 3 min e ~ 30 minuti, rispettivamente.

Introduzione

L'identificazione e la caratterizzazione di proteine ​​purificate si ottiene spesso utilizzando tecniche MS. La proteina viene digerito con un enzima e dei suoi peptidi sono ulteriormente analizzato da MS utilizzando un semplice apparato sperimentale infusione. digestione proteolitica è necessaria per la generazione di piccoli frammenti peptidici che rientrano nel range di massa utile della maggior parte degli analizzatori MS, e che può essere facilmente frammentato attraverso bassa energia di collisione di dissociazione indotta per generare aminoacido informazioni sulla sequenza. Per proteine ​​isolate o semplici miscele proteiche, non vi è alcuna ulteriore necessità di separazione cromatografica dei peptidi prima della rivelazione MS. Una miscela di 25-50 peptidi può essere facilmente analizzato infondendo il campione con una pompa a siringa direttamente nella sorgente MS ioni.

Lo spettrometro di massa può eseguire l'analisi e confermare la sequenza di una proteina in un breve lasso di tempo. Con i moderni metodi di acquisizione dati, questo processo può essere realizzato well'ambito pochi minuti o addirittura secondi. Il fattore limitante nel completare l'intero processo in un breve lasso di tempo è la fase di digestione proteolitica. In genere, questa viene eseguita nell'arco di alcune ore (o O / N), in soluzione, a 37 ° C, con substrato: rapporti di enzimi di (50-100): 1. Per ridurre il tempo di digestione enzimatica a minuti o secondi, microreattori enzima immobilizzato, in forma di reattori microfluidici o cartucce disponibili in commercio, sono stati descritti. ^1-6 Tipicamente, l'enzima è immobilizzato da covalente, non covalente / adsorbimento fisico, complesso formazione o incapsulamento, ^3,6 la maggiore efficienza del processo enzimatico viene abilitato dalla grande superficie-volume e rapporti enzima-to-substrato. Ulteriori vantaggi di reattori immobilizzate comprendono la riduzione autolisi e interferenze da parte dell'enzima in analisi MS, una migliore stabilità enzimatica e riutilizzabilità. Una varietà di approcci, utilizzando il vetro o dispositivi microfabbricate polimerici sono stati descritti,utilizzando enzimi immobilizzati su sfere magnetiche da interazioni antigene-anticorpo, ^7,8 intrappolati nelle reti di nanoparticelle d'oro, ⁹ incapsulato in titanio-allumina sol-gel ¹⁰ e nanozeolites, ¹¹ o catturati attraverso Ni-NTA o His-Tag formazione del complesso. In alternativa ⁶ , sono stati sviluppati capillari aperti tubolari con enzimi immobilizzati, pure. ¹² Inoltre, maggiore segmentazione proteolitica è stata dimostrata utilizzando controllata irradiazione a microonde ¹³ o tecnologia cicli di pressione assistita o pressione (PCT) per ridurre i tempi di reazione a 30-120 min. ¹⁴

Nonostante i molteplici vantaggi dei reattori enzima immobilizzato, i costi delle cartucce commerciali è alto, la disponibilità di dispositivi microfluidici per uso di routine è limitato, e l'uso di tecnologie microonde o PCT risultati in necessità di strumentazione aggiuntiva. L'obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un metodo che circumveNTS questi svantaggi, e che può essere facilmente implementato in ogni laboratorio per potenziare ricercatori un approccio semplice ed efficace per l'esecuzione di scissione enzimatica di proteine ​​in preparazione per l'analisi MS in pochi minuti. Questo approccio si basa sull'uso di idrofobici, C18-particelle che sono pre-caricate in un capillare o dispositivo microfluidica, e l'adsorbimento della proteina (s) di interesse nelle particelle seguita da digestione enzimatica durante l'infusione dell'enzima sul letto impaccato e proteine ​​catturato (s). In questo approccio, il substrato viene immobilizzato attraverso interazioni non covalenti, e l'enzima è infuso proteina immobilizzata. L'efficienza proteolitica digestione viene aumentata dalle grandi superfici di particelle che espongono la proteina per la trasformazione enzimatica, distanze e tempi di diffusione da e verso la superficie delle particelle ridotta, migliorato trasferimento di massa, nessun legame covalente che possono influenzare l'attività dell'enzima, capacità rapidamente evaluate combinazioni di diversi enzimi, disponibilità, e multiplexing se il processo viene eseguito in un formato microfluidica. Questo approccio è dimostrato con l'uso di una miscela di proteine ​​standard e tripsina-enzima più comunemente usato per la digestione proteolitica prima della rilevazione ESI-MS. Lo spettrometro di massa utilizzato per la rilevazione in questo studio era uno strumento lineare trappola quadrupolo (LTQ).

Protocollo

1. Preparazione del capillare microreattore

1. Tagliare il diametro interno 100 micron (ID) x 360 micron di diametro esterno (OD) capillare ad una lunghezza di 7-8 cm, e 20 micron ID x 90 micron OD capillare per 3-5 cm con il coltello capillare di vetro; verifica al microscopio che entrambe le estremità capillari hanno un taglio netto, diritta, senza bave sporgenti.
2. Inserire il 20 um ID x 90 micron OD capillare in un'estremità del 100 micron ID x 360 micron OD capillare, per una lunghezza di ~ 6 mm; in caso di necessità, osservare questa operazione al microscopio.
3. Applicare una piccola goccia di colla E6000 attorno alla giunzione dei 90 micron OD / 100 micron capillari ID con la fine di un Q-tip, e lasciare che la colla cura O / N a temperatura ambiente.
4. Tagliare il inserita 20 micron ID x 90 micron OD capillare ad una lunghezza di ~ 10-15 mm; questo sarà l'emettitore Elettrospray.
5. Pre-tagliare il 1/32 "OD PEEK, 1/16" OD PEEK e 1/16 "PTFE vasca ODzione in pezzi di 4-5 cm di lunghezza; questi saranno i manicotti utilizzati nei sindacati capillari per la fornitura di una connessione senza perdite.
6. Collegare l'estremità opposta del 100 micron ID x 360 micron OD capillare per un'unione PEEK; usare un manicotto 1/32 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
7. Inserire / serrare un pezzo di ~ 5 cm di lunghezza 1/16 "tubo PTFE nella estremità opposta del raccordo.
8. Pesare ~ 4 mg di C18 (5 micron) particelle in un pre-pulito / secca 2 ml flacone di vetro; aggiungere 0,5 ml di isopropanolo, chiudere la fiala e disperdere il liquame nella vasca da bagno ultrasonicatore.
9. Prelevare con una siringa 250 microlitri di circa 200 pl liquami, inserire l'ago della siringa nel "tubo 1/16 PTFE dell'unione PEEK, e dispensare lentamente l'impasto in 100 micron ID x 360 micron OD capillare, osservare al microscopio come capillare riempie di particelle fino una lunghezza di 2-3 mm di imballaggio è realizzato; questo sarà il microreattore (Figura 1) il 20 μ.m ID capillare trattiene le particelle nel microreattore con un effetto Keystone. ¹⁵
10. Risciacquare microreattore con ~ soluzione 50 ml di H ₂ O / CH ₃ CN 50:50 v / v, e poi con soluzione ~ 50 ml di H ₂ O / CH ₃ CN 98: 2 v / v.

2. preparazione di soluzioni campione

Nota: Le operazioni che comportano la manipolazione di solventi organici e acidi e la preparazione della soluzione devono essere eseguite in una cappa aspirante. Indossare occhiali, guanti e indumenti protettivi.

1. Risciacquare con CH ₃ OH e asciugare alcune fiale di vetro (4 ml) e tubi di polipropilene (15 ml).
2. Preparare 10 ml di una soluzione di H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 9,8 ml H ₂ O con 200 microlitri CH ₃ CN; mescolare mediante ultrasuoni.
3. Preparare 10 ml di una soluzione di H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) in una provetta da 15 ml polipropilene miscelando 5 ml H _{2 <}/ sub> O con 5 ml di CH ₃ CN; mescolare mediante ultrasuoni.
4. Preparare 4 ml di una soluzione acquosa acidificata (TFA 0,01% v / v) con l'aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni.
5. Preparare 4 ml di una soluzione organica acidificata (TFA 0,01% v / v) con l'aggiunta di 4 microlitri TFA (10%) a 4 ml H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) in una fiala di vetro 4 ml; mescolare mediante ultrasuoni.
6. Pesare 16 mg di NH ₄ HCO ₃ con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml di H ₂ O / CH ₃ CN: soluzione (98 2 v / v) e disperdere per sonicazione; questo si traduce in una soluzione 50 mM di NH ₄ HCO ₃ (pH ~ 7,8) in tampone acquoso.
7. Pesare 5 mg di proteina standard (ad esempio, albumina di siero bovino, emoglobina α / β, citocromo C, anidrasi carbonica, α-2-HS-glicoproteina, etc.) con una microbilancia analitica in una fiala di vetro 4 ml; aggiungere 4 ml DI wateR e disperdere mediante ultrasuoni; questo genere si traduce in una soluzione ad elevata concentrazione di livello pM.
8. Preparare 1 ml di soluzione proteica (1-2 mM) diluendo la soluzione a concentrazione alto livello mM con un volume adeguato di NH ₄ HCO ₃ (50 mM) tampone acquoso; mescolare mediante ultrasuoni.
9. Preparare la soluzione di tripsina (5 mM) sciogliendo 20 mg sequenziamento grado tripsina in 170 microlitri NH ₄ HCO ₃ (50 mM) tampone acquoso; disperdere mediante ultrasuoni.

3. apparato sperimentale

Nota: Il sistema LTQ-MS è dotato di una sorgente ESI modificato che comprende un XYZ stadi casa costruzione che abilita l'interfacciamento dello spettrometro di massa a vari approcci ingresso campione.

1. Scollegare il microreattore capillare dall'unione PEEK e connettersi al PEEK Tee.
2. Inserire lunga ~ 2 centimetri di filo Pt nel braccio laterale del PEEK Tee; utilizzare un "manicotto 1/32 PEEK per fornire un-Perdita di connessione e per isolare il filo Pt.
3. Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare all'estremità opposta del PEEK Tee; usare un manicotto 1/32 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
4. Fissare il Tee PEEK sul XYZ-stage e posizionare la ESI emettitore ~ ​​2 millimetri di distanza dal capillare di ingresso spettrometro di massa.
5. Collegare il filo Pt alla sorgente di alimentazione ESI dello spettrometro di massa.
6. Collegare l'estremità opposta del capillare trasferimento del campione all'unione di acciaio inossidabile; usare un manicotto 1/16 "PEEK per la fornitura di una connessione senza perdite.
7. Collegare un lungo 4-5 cm 1/16 "tubo in teflon all'estremità opposta del raccordo in acciaio inox e inserire l'ago della siringa 250 microlitri nel tubo PTFE, accendere la pompa e impostare la portata al valore desiderato (ad esempio, 2 microlitri / min).
8. tandem Input parametri di acquisizione dati MS nel pacchetto software che controlla lo strumento un MSd salvare come file il metodo per preparare la messa a punto per l'esecuzione di analisi; per il sistema LTQ-MS, utilizzare i parametri di analisi dipendenti seguenti dati: l'esclusione dinamica abilitato per 180 sec con larghezza di massa esclusione ± 1,5 m / z; uno Stato membro scan seguito da uno zoom e MS ² scansioni su i primi 5 picchi più intensi, zoom larghezza di scansione ± 5 m / z; dissociazione indotta da collisione (CID) parametri impostati in larghezza isolamento 3 m / z, energia di collisione normalizzato del 35%, l'attivazione Q 0.25, e il tempo di attivazione di 30 msec.

4. Configurazione Microfluidic

1. Preparare un dispositivo microfluidico in vetro o substrati polimerici; ^16-18 il layout del dispositivo è fornito in Figura 2A, consistente in un microreattore (1) (0,13 mm Lunghezza larghezza x 2 mm x 50 micron di profondità) collegato ad un ingresso (2 ), uscita (3) e una porta laterale (4); i canali comunicanti per le manipolazioni fluidica sono ~110 micron di larghezza e ~ 50 micron in profondità; una struttura multicanale (5), costituito da ~ 1,5-2 micron profondo x 10 micron di larghezza x 100 micron lunghi microcanali posti 25 micron a parte, fungerà da filtro per trattenere le particelle nel microreattore.
2. Attiva connessioni fluido consegna al chip incollando connettori specializzati verso le luci di entrata, o escogitando un supporto polimerico che ospita raccordi per la consegna fluido (Figura 2B). ¹⁶
3. Preparare una sospensione di particelle di C18 (5 micron), come descritto al punto 1.8; consegnare la sospensione al microreattore con una siringa utilizzando 1/16 "tubo in teflon collegato alla porta lato di chip (4); chiudere la porta dopo il caricamento delle particelle con colla epossidica e la cura per 1 ora in stufa a 90 ° C ^16.
4. Inserire un capillare (20 micron ID x 90 micron di lunghezza OD x 10 mm) nel porto di uscita, sigillare con la colla E6000, e lasciare che la cura O / N; questo diventerà l'emettitore ESI ( 6).
5. Collegare un 50 micron ID x 360 micron OD (~ 0,5 m di lunghezza) trasferimento del campione capillare alla porta di ingresso del circuito integrato (2); collegare l'estremità opposta del capillare ad un microlitri siringa 250 e la pompa a siringa, come descritto in 3.6-3.7.
6. Collocare un leggero connettore PEEK Tee sulla linea di trasferimento del campione appena prima luce di ingresso (2) e inserire un filo di Pt sul braccio laterale della T, come descritto in 3.2; questo sarà l'elettrodo ESI.
7. Fissare il dispositivo microfluidica sul palco XYZ con l'emettitore ESI posizionato ~ 2 mm di distanza dal capillare spettrometro di massa in ingresso; preparare la MS per l'analisi come descritto in 3.8.

5. Campione Caricamento, proteolitica Digestione e eluizione per MS Analysis

Nota: Tutte le fasi di trasferimento soluzione / campione vengono eseguite con l'ausilio di una pompa a siringa e dovrebbe consentire per alcuni minuti supplementari per completare, per compensare la dead-volumes associati alle linee di trasferimento da e per il microreattore; il tempo necessario dipenderà dalle portate coinvolti.

1. Risciacquare microreattore e prepararla per analisi infondendo una soluzione acquosa di NH ₄ HCO ₃ (50 mM) in H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
2. Caricare il campione di proteine ​​(1 pM) sul microreattore infondendo la soluzione campione a 2 microlitri / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
3. Infondere la soluzione di tripsina (5 mM) sopra la proteina adsorbita sul microreattore a 2 microlitri / min per 1-3 min.
4. Quench il processo di digestione proteolitica risciacquando il microreattore con una soluzione acquosa acidificata di TFA (0,01% v / v) in H ₂ O / CH ₃ CN (98: 2 v / v) a 2 ml / min per 5 min; utilizzare una siringa 250 microlitri.
5. Avviare eluendo la proteina digerire dal microreattore infondendo una soluzione organica acidificato di TFA (0,01%v / v) in H ₂ O / CH ₃ CN (50:50 v / v) a 300 Nl / min.
6. Accendere il processo di acquisizione dei dati MS e la tensione ESI (~ 2.000 V); acquisire i dati MS utilizzando i parametri di acquisizione dati forniti al punto 3.8; osservare l'eluizione dei peptidi trittico.

6. Elaborazione dati

1. Elaborare i dati in tandem MS con un motore di ricerca compatibile con il formato di dati di MS crudo.
   1. Elaborare i file RAW LTQ-MS utilizzando un organismo specifico database di proteine ​​minimamente ridondante; caricare i dati grezzi nel motore di ricerca, impostare le tolleranze di massa genitore e ioni frammento di 2 e 1 Da rispettivamente, e utilizzare frammenti completamente solo triptici con un massimo di due perse spaccature per la ricerca; non consentono modifiche post-; fissare i tassi di rilevamento di alta e media fiducia falsi (FDR) a 1% e il 3%, rispettivamente, e non consentono modifiche post-traduzionali.
2. Filtrare i dati per selezionare solo di alta fiduciapeptide corrisponde alle proteine ​​presenti nel database; valutare i risultati proteine ​​e livello peptide.

Risultati

Un risultato rappresentativo di un processo di digestione proteolitica eseguito contemporaneamente su una miscela di proteine, con le microreattori sopra descritti (figure 1 e 2), è fornita in Tabella 1. La tabella comprende le sequenze peptidiche uniche che identificano una proteina particolare, la croce punteggio correlazione (Xcorr) (ossia, un punteggio che caratterizza la qualità della partita sperimentale-to-teorico per lo spettro di mass...

Discussione

Il microreattore descritto in questo lavoro fornisce un facile da implementare apparato sperimentale per mineralizzazione enzimatica delle proteine ​​per permettere l'analisi MS e identificazione in meno di 30 min. I vantaggi di questo sistema, rispetto agli approcci convenzionali, comprendono semplicità, velocità, basso consumo di reagenti e bassi costi. In particolare, non vi è alcuna necessità di costosi perline tripsina immobilizzati e cartucce. La preparazione del microreattore capillare è semplice

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion trap ESI-MS	Thermo Electron	LTQ	The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data
XYZ stage	Newport	Multiple parts	The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems
Stereo microscope	Edmund optics	G81-278	The microscope is used to observe the microreactor packing process
Analytical balance/Metler	VWR	46600-204	The balance is used to weigh the protein samples
Ultrasonic bath/Branson	VWR	33995-540	The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry
Syringe pump 22	Harvard Apparatus	552222	The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor
Milli-Q ultrapure water system	EMD Millipore	ZD5311595	The MilliQ water system is used to prepare purified DI water
Pipettor/Eppendorf (1,000 µl)	VWR	53513-410	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (100 µl)	VWR	53513-406	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Pipettor/Eppendorf (10 µl)	VWR	53513-402	The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions
Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP100375	This capillary is used for the fabrication of the microreactor
Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP020090	This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter
Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD)	Polymicro Technologies	TSP050375	This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor
Glass capillary cleaver	Supelco	23740-U	This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length
Glue	Eclectic Products	E6000 Craft	This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip
Epoxy glue	Epo-Tek	353NDT	This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded
Reversed phase C18 particles (5 µm)	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18	These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent
Syringe/glass (250 µl)	Hamilton	81130-1725RN	The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor
Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”)	Valco	ZRU1.5FPK	This union is used to connect the 250 µl syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry
Stainless steel union (1/16”)	Valco	ZU1XC	The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary
Microvolume PEEK Tee connector (1/32”)	Valco	MT.5XCPK	The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire
Tee connector (light weight)	Valco	C-NTXFPK	This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line
Pt wire (0.404 mm)	VWR	66260-126	The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply
PTFE tubing (1/16” OD)	Valco	TTF115-10FT	The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union
PEEK tubing (0.015” ID x 1/16” OD)	Upchurch Scientific	1565	The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary
PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD)	Valco	TPK.515-25	The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee
Clean-cut polymer tubing cutter	Valco	JR-797	This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length
Amber vial (2 ml)	Agilent	HP-5183-2069	The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry
Amber vial (4 ml)	VWR	66011-948	The vials are used to prepare sample solutions
Polypropylene tube (15 ml)	Fisher	12-565-286D	The vials are used to prepare buffer solutions
Cylinder (100 ml)	VWR	24710-463	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Cylinder (10 ml)	VWR	24710-441	The cylinder is used to measure volumes of solvent
Pipette tips (1,000 µl)	VWR	83007-386	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (100 µl)	VWR	53503-781	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Pipette tips (10 µl)	VWR	53511-681	The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions
Glass substrates	Nanofilm	B270 white crown, 3” x 3”	These are glass substrates for microchip fabrication
Male nut fitting (1/16”)	Upchurch	P203X	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Nanoport assembly	Upchurch	N-122H	This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip
Protein standards	Sigma	Multiple #
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher	A955
Methanol, HPLC grade	Fisher	A452
Isopropanol, HPLC grade	Sigma	650447
Trifluoroacetic acid	Sigma	302031
Ammonium bicarbonate	Aldrich	A6141
Trypsin, sequencing grade	Promega	V5111