عزل وتوصيف ماوس الغارية البويضات واستنادا إلى منظمة ونين نويي

Summary

هنا نقدم بروتوكول لتوصيف البويضات غاري الماوس على أساس تنظيم نويي.

Abstract

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Introduction

وتستخدم غاري البويضات نمت بشكل كامل (GV، الحويصلة الجرثومية) معزولة عن مقصورة الغارية من المبيض بشكل روتيني لأغراض مختلفة مثل، على سبيل المثال، ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية وراء في المختبر النضج حتى مرحلة الطورية II.

وعلى الرغم من ظهور البويضات الأكثر الغارية جميلة، ولكن ليس كل شيء، هي قادرة على استكمال الانقسام الاختزالي والوصول إلى مرحلة الكيسة الأريمية. في الواقع، في كثير من أنواع الثدييات، بما في ذلك البشر ^1،2، ما يقرب من 30٪ منهم تعتقل تنميتها في المرحلة 2-الخلية، في حالة حدوث الإخصاب ^3-5. حتى الآن، تستخدم بعض المعلمات للتمييز بين البويضات قادرة على الحفاظ على التطور الجنيني من أولئك الذين لا يستطيعون القيام بذلك.

على سبيل المثال، الكريزيل تلطيخ الأزرق (BCB) هو وسيلة صالحة لفرز البويضات على أساس النشاط الجلوكوز 6 فوسفات نازعة-على الرغم من أن فائدة هذه الطريقة فرز المتعلقة BCB + أو تلطيخ BCB- هيلا يزال المختبرات تعتمد ^6-8.

يوجد طريقة أخرى راسخة في المؤسسة لونين بها: إذا ملطخة أي الأصباغ الإقحام الحمض النووي (مثل Hoechst33342)، و 70٪ من البويضات الغارية تظهر حلقة صبغ إيجابي حول نوية وتسمى تحيط نوية (SN) في حين أن 30٪ المتبقية تظهر إشارات إيجابية أكثر رصدت وتسمى ليس تحيط نوية (NSN) ^3-5. أظهرنا مؤخرا أن غياب السياج حشوية ⁹ (CPLs، مواقع تخزين هامة لمرنا وريبوسوم المستمدة أمهات في كل من البويضات في الثدييات والأجنة) ^{(10) وأسفل} تنظيم MATER (ضروري لتشكيل CPLs ^11)، جنبا إلى جنب مع وجود قطرات الدهون في cytoplasms من ^9،12، يمكن أن يكون لأسباب أخرى تتعلق البويضات عدم NSN المضي قدما إلى ما بعد مرحلة 2-الخلية.

للأسف، عدد من التقنيات يمكن تطبيقها على فرز SN الغار والبويضات NSN و،لهذا السبب، يمكن تطوير أسلوب أقل الغازية (دون تلطيخ النووي، إجراءات تثبيت أو التلاعب مع ماصات الفم) أصبحت مهمة جدا لزيادة معدلات كلا تطور الجنين الإنسان والحيوان.

في هذه الورقة، ونحن بالتفصيل بروتوكول بسيطة وسريعة تستخدم لعزل الإعلان نوع SN وNSN البويضات الغارية من إناث الفئران وموجهة الى جميع العلماء المهتمين في دراسة عملية تكوين الأمشاج الإناث، نضوج البويضة وتطور الجنين.

Protocol

ويجري هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية لالأوروبي (EU 63/2010) والإيطالية (26/2014) قوانين حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي. يستخدم عنق الرحم التفكك القتل الرحيم لالمبايض العزلة، ويتم تنفيذها من قبل الخبراء والأفراد المدرجة في بروتوكول المعتمد تغطي هذه الدراسة تدريب.

1. الحيوانات

1. الحفاظ على الكبار 3- لإناث الفئران عمره 6 أسابيع في غرفة مع درجة الحرارة للرقابة والرطوبة (مع مراحل 12L: 12D وبالمال وبالشهرة أيضا إعلان البنك المركزي الامريكي).
2. حقن الفئران داخل الصفاق مع 2.5 وحدة دولية من الحوامل موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس (PMSG) لتحفيز النمو الجريبي عن طريق محاكاة آثار هرمون تحفيز الجريبات (FSH). عزل المبيضين البويضات لالغارية 48hrs جمع في وقت لاحق. الموت ببطء الماوس الإناث حقن سابقا مع PMSG، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخاصة بك.
3. بسرعة إزالة المبيضين من تجويف الجسم ووضعها في طبق بتري تابعaining M2 المتوسطة لاحقة عزل البويضات (انظر القسم 3).
   1. إجراء شق في الجلد الذي يغطي جدار البطن تليها شق في الغشاء البريتوني باستخدام مقص تشريح العقيمة. فتح شق لكشف البطن، نقل الشجاعة على جانب واحد باستخدام الملقط معقمة وتوطين أنابيب الرحم، وتشكيل شكل V بدءا من المثانة.
   2. مراقبة المبايض تقع تحت الكلى. عقد كل أنبوب مع منتاش معقم وإجراء شق صغير في الجزء السفلي من المبيض للافراج عنهم. نقل كلا المبيضين في الجزء السفلي من طبق بتري تحتوي على المتوسط ​​قبل معايرتها.

2. إعداد هرمون

1. تمييع PMSG (متوفر في تركيزات مختلفة الأسهم) مع محلول معقم المالحة متساوي التوتر للحصول على تركيز العمل من 2.5 وحدة دولية الهرمون في 0.1 مل لحجم الحقن المناسب.
   يجب aliquoted حلول هرمون في 0.5 مل الأنابيب وتخزينها في -2: ملاحظة0 درجة مئوية حتى اليوم من الاستخدام. لا تبقي قسامات المخفف أطول من ثلاثة أشهر في -20 ° C. إذابة مرة واحدة، إذا تم إجراء حقن المسلسل، وتخزين aliquots من الحلول الهرمون في +4 درجة مئوية واستخدامها في غضون 4 أيام.

3. الغارية البويضات عزل

لعزل البويضات السليمة:

1. تتوازن M2 المتوسطة ¹³ (M2) في CO ₂ و 37 ° C 5٪ لا يقل عن 1 ساعة قبل البدء في إجراء البويضات العزلة. إعداد طبقين بتري (35 مم × 10 مم)، واحدة مع 1 مل من M2 لتعطيب المبيض والثانية مع قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية (~ 1.5 مل) لنقل البويضات بعد بمعزل عن المبيض (انظر 3،4-3،6). تبقي على حد سواء أطباق بتري في حاضنة في 5٪ CO _{2 و} 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
2. استخدام stereomicroscope خلال إجراءات عزل البويضات.
3. إعداد رقيقة الماصات الزجاجية الفم لجمع البويضات تمتد لفيلمأبقى هينج الزجاج الماصات باستور أفقيا (عقد ينتهي من ماصة بكلتا يديه)، فوق لهب العمودي القادمة من موقد بنسن (الشكل 1).
   1. بمجرد أن يبدأ الزجاج في الذوبان، واتخاذ الماصة للخروج من اللهب وإجراء حركة سحب سريعة للحصول على ماصة المطلوب. قطع بحزم الزجاج الزائد على مقربة من نقطة ضيقة من ماصة مع الأظافر لضبط طول وقطر الشعرية الداخلي. ضمان الشعرية رقيقة لديه القطر الداخلي لل~ 100 ميكرون، أكبر قليلا من قطر البويضة ل(~ 80 ميكرون).
   2. إلى الفم ماصة، قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب الشافطة لماصة سحبت باستخدام طرف المناسب ووضع الطرف الآخر في الفم، وتأمين ذلك مع الأسنان.
4. جمع المبايض باستخدام الملقط معقمة وإيداعها في الجزء السفلي من طبق خلية ثقافة بتري (35 ملم × 10 ملم). غطاء لهم مع 1 مل من M2 سبق معايرتها عند 37 ° Cو 5٪ CO ₂ (الشكل 2).
5. ثقب بلطف الجريبات الغارية المبيضين مع العقيمة إبرة حقنة الانسولين لاطلاق سراح البويضات الغارية في M2 (الشكل 3).
6. بلطف الفم الماصة البويضات من خلال ماصة باستور الضيقة لإزالة خلايا بصيلات وأي حطام الأنسجة المحتمل الآخر (الشكل 4A) ومن ثم تسويتها في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (20 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية مناسبة للثقافة الجنين (سابقا إعداد؛ الشكل 4B).
   ملاحظة: من المهم لإزالة جميع الخلايا الركامية التي تعلق على المنطقة الشفافة من البويضات قبل pipetting المستمر من خلال عدة ومختلفة قطرات من M2. تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لتجنب التغيرات في الرقم الهيدروجيني للمتوسط.

4. الغارية البويضات تلطيخ مع Hoechst33342

ملاحظة: البويضات الغارية ويمكن التمييز في SN (تحيط نوية)، NSN (لا تحيط نوية) أوفي أي شكل وسيط آخر، استنادا إلى منظمة ونين بهم بعد تلطيخ مع تركيز فوق حيوي من Hoechst33342 (أو أي علامات أخرى محددة لقواعد AT) ^14. في الواقع، تظهر البويضات SN حلقة هويشت إيجابية حول نوية في حين أن NSN لا، ومن هنا اسمها.

لتلطيخ البويضات السليم:

1. نقل البويضات باستخدام ماصة الفم إلى قطرات من Hoechst33342 (20 ميكرولتر) المخفف في M2 في تركيز فوق حيوي من 50 نانوغرام / ميكرولتر لمدة 10 دقيقة في الظلام.
2. بعد الحضانة مع Hoechst33342، ونقل كل بويضة واحدة مع ماصة الفم في الجزء السفلي من قطرات صغيرة (5 ميكرولتر) من M2 مغطاة الزيوت المعدنية، والفرز على أساس تنظيم لونين (SN أو NSN). استخدام أي المجهر مضان مجهزة مرشح Hoechst33342 (الطول الموجي انبعاث 486 نانومتر) لتصور التكوين لونين من البويضات.
   ملاحظة: اعتمادا على نوع المجهر مضان المستخدمة، طر قد يصبح من الضروري استخدام الزجاج طبق بتري أسفل لالتقاط صور. المجهري متحد البؤر أوليمبوس Fluoview Fv10i عندما مجهزة حامل العينة لمدة 35 ملم طبق يتطلب الزجاج الوحيدة أسفل أطباق لالتقاط صور مع 0.17 مم القياسية ومجموعة 0،13-0،21 مم مقبولة.
3. تثير البويضات لمدة لا تزيد 5-10 ثانية، من المحتمل ما يكفي من الوقت لتصور وجود أو عدم وجود حلقة حول نوية (الشكل 5).
4. بعد الفرز، وثقافة SN غاري والبويضات NSN في M2 في 5٪ CO ₂ و 37 ° C للحث في المختبر النضج أو الاحتفاظ بها في مخازن مناسبة للالتحليلات الجزيئية أو الخلوية.

النتائج

وتظهر الصور التالية الطريقة المستخدمة لعزل البويضات الغارية من المبيض الماوس، بدءا من إعداد الماصات لفرز البويضات عن طريق وسائل Hoechst33342. هذا الأسلوب هو بسيط جدا ويمكن أن يؤديها في أي مختبر مجهز حاضنة CO _2، stereomicroscope والمجهر مضان مجهزة مرشح الصحي...

Discussion

يصف هذا البروتوكول الطريقة المستخدمة لعزل وتصنيف الماوس غاري البويضات GV. لا توجد خطوات حاسمة خاصة أن نؤكد، مع استثناءات قليلة. أولا: يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء في أسرع وقت ممكن بما يلي: أ) الحفاظ على حيوية البويضات وب) تجنب التغييرات درجة الحموضة في الوسيلة المستخدم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177