Выделение и характеристика Mouse антрального ооцитов на основе организации хроматина ядрышка

Резюме

Здесь мы приводим протокол для характеристики мыши антральных ооцитов, основанных на ядрышек организации.

Аннотация

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Введение

Антральных полностью выращенные ооциты (GV, зародышевый пузырек), выделенные из антрального отделения яичника обычно используются для различных целей, таких как, например, изучение молекулярных и клеточных механизмов за созревание в пробирке до стадии II Метафаза.

Несмотря на их красивый внешний вид наиболее антральных ооцитов, но не все, могут завершить мейоза и достичь стадии бластоцисты; В самом деле, во многих видов млекопитающих, включая человека ^1,2, примерно 30% из них задержать их развитие на этапе 2-клеточной, если происходит оплодотворение ^3-5. На сегодняшний день, несколько параметров используются для различения между ооцитов, способных выдержать эмбрионального развития от тех, кто не сделать.

Например, Cresyl синий окрашивание (BCB) является допустимым методом для сортировки ооциты на основе активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, хотя-полезность этого метода сортировки, связанные с BCB + или BCB- окрашиванияпо-прежнему зависит ^6-8 лаборатория.

Другой хорошо признанным методом заключается в их организации хроматина: если окрашивали либо интеркалирующих ДНК красителей (как Hoechst33342), 70% из антральных ооцитов показать кольцо красителя-положительных вокруг ядрышка и называются окружении ядрышка (SN), а оставшиеся 30% показать более пятнистых позитивные сигналы и называются не окружены Ядрышка (NSN) ^3-5. Недавно мы показали, что отсутствие цитоплазматических решеток ^{9 (CPLS,} важных мест хранения матерински полученных мРНК и рибосом в обоих ооцитов млекопитающих и эмбрионов) ^{10 и} вниз регулирование MATER (важно для формирования CPLS ^11), вместе с наличием липидов капли в цитоплазме их ^9,12, могут быть и другие причины, связанные с невозможностью ооцитов NSN, чтобы продолжить за пределы стадии 2-клеток.

К сожалению, мало методы могут быть применены для сортировки антрального SN и NSN ооцитов и,по этой причине, развитие менее инвазивных методов (без ядерного окрашивания, процедуры фиксации или манипуляции с рот пипетками) может стать очень важно повысить ставки как эмбрионального развития человека и животных.

В этой статье мы подробно простой и быстрый протокол, используемый для выделения объявления сортировки SN и NSN антральных ооцитов из самок мышей и оно адресовано всем заинтересованным ученым в изучении женской гаметы, созревание яйцеклетки и развития зародыша.

протокол

Этот протокол ведется в соответствии с руководящими принципами европейской (ЕС 63/2010) и итальянских (26/2014) законов, защищающих животных, используемых для научных исследований. Шейки дислокации эвтаназия используется для изоляции яичников и осуществляется экспертом и обучение лиц, перечисленных в утвержденном протоколе, охватывающий это исследование.

1. Животные

1. Поддержание взрослый 3- до 6-недельных самок мышей в комнате с регулируемой температурой и влажностью (с фазами 12L: 12D и кормили вволю).
2. Вводите мышей внутрибрюшинно 2,5 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG), чтобы стимулировать рост фолликулов, имитируя эффект фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Изолировать яичники для антральных ооцитов сбора 48 часов позже. Эвтаназии женский мышь ранее введенный с ГСЖК, в соответствии с вашими институциональных принципов.
3. Быстро удалить яичники из полости тела и поместить их в чашку Петри продолжениеAining M2 среду для последующего выделения ооцитов (раздел 3).
   1. Сделать надрез на коже покрывающей брюшную стенку с последующим разрез в брюшной полости с помощью ножниц рассечение стерильные. Откройте разрез, чтобы обнажить живот, двигаться кишки на одной стороне с использованием стерильных пинцетов и локализовать маточные трубы, образуя V-образную форму, начиная от мочевого пузыря.
   2. Соблюдайте яичники, расположенные ниже почек. Удерживайте каждую трубку стерильной пинцета и сделать небольшой надрез в нижней части яичников, чтобы освободить их. Передача обоих яичников в нижней части чашку Петри, содержащую предварительно уравновешенную среду.

2. Гормон Подготовка

1. Развести PMSG (доступный в различных концентрациях фондовых) с стерильного раствора изотонический солевой раствор, чтобы получить рабочую концентрацию 2,5 МЕ гормона в 0,1 мл в течение соответствующего объема впрыска.
   Примечание: Гормон растворы должны быть аликвоты в 0,5 мл пробирки и хранили при -20 ° С до дня применения. Не держите разводненной аликвоты дольше, чем три месяца при -20 ° C. После оттаивания, если выполняются последовательные инъекции, хранить аликвоты гормонов решений при +4 ° С и использовать их в течение 4 дней.

3. Антраль Ооциты Изоляция

Для правильной изоляции ооцитов:

1. Равновесие M2 среду ¹³ (М2) в 5% CO ₂ и 37 ° C в течение не менее 1 часа перед началом процедуры выделения ооцитов. Приготовьте два чашки Петри (35 мм х 10 мм), в одной из 1 мл м2 для яичников прокалывания и второй с мелких капель (20 мкл) М2, покрытого минеральным маслом (~ 1,5 мл) для передачи ооцитов после выделения из яичников (см 3,4-3,6). Держите обе чашки Петри в термостате при 5% CO ₂ и 37 ° С до готовности, которые будут использоваться.
2. Используйте стереомикроскопа во время процедуры изоляции ооцитов.
3. Подготовка тонких стеклянных пипеток рот, чтобы собрать ооциты стретчHing стекла пипетки Пастера хранится в горизонтальном (удерживая концы пипетки с обеих рук), по вертикальной пламени, выходящего из горелкой Бунзена (рисунок 1).
   1. После того, как стекло начинает плавиться, принимать пипетки из пламени и выполнять быстрое движение вытягивания, чтобы получить желаемый пипетки. Плотно сократить избыточное стекло близко к узкой точки пипетки с ногтями, чтобы отрегулировать длину и диаметр внутренней капилляра. Убедитесь, что тонкая капиллярная имеет внутренний диаметр ~ 100 мкм, несколько большую, чем диаметр ооцита (~ 80 мкм).
   2. Для рот пипеткой, подключите один конец трубки аспиратора в выдвинутом пипетки с помощью соответствующего наконечник и поместите другой конец в рот, закрепив его с зубами.
4. Сбор яичников с использованием стерильных пинцетов и хранение их на дне для культивирования клеток Петри (35 мм х 10 мм). Покрытие их с 1 мл М2, предварительно уравновешенную при 37 ° Си 5% СО ₂ (рисунок 2).
5. Осторожно проколоть антральных фолликулов яичников с помощью стерильного шприца инсулина иглы, чтобы освободить антральных ооцитов в М2 (рис 3).
6. Осторожно рот пипеткой ооциты через узкий пипетки Пастера, чтобы удалить фолликулярных клеток и любую другую возможную мусора тканей (фиг.4А) и затем разрешать их в нижней части мелких капель (20 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, подходящей для культивирования эмбрионов (ранее подготовлен; 4В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы удалить все кучевые клетки, прикрепленные к пеллюцида ооцитов непрерывным отбором через несколько различных и капель М2. Выполните этот шаг как можно быстрее, чтобы избежать изменения в рН среды.

4. Антраль Ооциты Окрашивание Hoechst33342

ПРИМЕЧАНИЕ: антрального ооциты можно выделить SN (Окруженный ядрышка), NSN (не окружен ядрышко) илив любой другой форме промежуточного, на основе их организации хроматина после окрашивания прижизненной концентрации Hoechst33342 (или любой другой маркеров, специфических для баз в) ^14. В самом деле, ооциты SN показывают Hoechst-положительный кольцо вокруг ядрышек, а не НСН, следовательно, его имя.

Для правильной окрашивания ооцитов:

1. Передача ооцитов с использованием рот пипеткой в ​​капли Hoechst33342 (20 мкл) разводили в М2 в прижизненной концентрации 50 нг / мкл в течение 10 мин в темноте.
2. После инкубации с Hoechst33342, передавать каждый отдельный ооцит с рот пипеткой в ​​нижней части мелких капель (5 мкл) М2, покрытых минеральным маслом, для сортировки основан на организации хроматина (SN или НСН). Используйте любой флуоресцентный микроскоп, оснащенный фильтром Hoechst33342 (длина волны излучения 486 нм), чтобы визуализировать конфигурацию хроматина ооцитов.
   Примечание: В зависимости от типа используемого флуоресцентного микроскопа, ят может стать обязательным для использования со стеклянным дном чашки Петри для получения изображения. Конфокальная микроскопии Olympus Fluoview Fv10i, оснащена держателем образцов для 35 мм блюдо требует только стекло снизу блюда на приобретение изображений, с толщиной 0,17 стандартного мм и в диапазоне от 0,13 до 0,21 мм приемлемых.
3. Excite ооциты не более чем на 5-10 сек, вероятно, достаточно времени, чтобы визуализировать наличие или отсутствие кольца вокруг ядрышка (рис 5).
4. После сортировки, культура антральный SN и NSN ооцитов в М2 в 5% СО ₂ и 37 ° C, чтобы вызвать созревание в пробирке или держать их в соответствующих буферов для молекулярных или клеточных анализов.

Результаты

Следующие фотографии показывают метод, используемый для выделения ооцитов антральных из яичников мышей, начиная от подготовки к пипетки сортировки ооцитов »с помощью Hoechst33342. Этот метод достаточно прост и может быть выполнена в любой лаборатории, оборудованной _СО<...

Обсуждение

Этот протокол описывает метод, используемый, чтобы изолировать и классифицировать мыши антральных GV ооцитов. Там нет особых важных шагов, чтобы подчеркнуть, с несколькими исключениями. Во-первых: эта процедура должна быть выполнена как можно быстрее, чтобы: а) поддерживать жизнеспособ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177