Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

Riepilogo

Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.

Abstract

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Introduzione

Antrale ovociti completamente sviluppati (GV, vescicola germinale) isolati dal vano antrale dell'ovario sono abitualmente utilizzati per scopi diversi, come, per esempio, lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base maturazione in vitro fino metafase II.

Nonostante le loro bella apparenza oociti antrali più, ma non tutti, sono in grado di completare la meiosi e raggiungere lo stadio di blastocisti; infatti, in molte specie di mammiferi, compreso l'uomo ^1,2, circa il 30% del loro arresto loro sviluppo nella fase 2 cellule, se avviene la fecondazione ^3-5. Ad oggi, alcuni parametri sono utilizzati per distinguere tra gli ovociti in grado di sostenere lo sviluppo embrionale da quelli in grado di farlo.

Ad esempio, cresolo colorazione blu (BCB) è un valido metodo per ordinare gli ovociti basati sull'attività di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, sebbene l'utilità di questo metodo di ordinamento correlate a BCB + o colorazione è BCB-ancora dipendente ^6-8 laboratorio.

Un altro metodo consolidato risiede nella loro organizzazione della cromatina: se macchiata di eventuali coloranti intercalanti del DNA (come Hoechst33342), il 70% degli ovociti antrali mostrano un anello colorante positivo attorno al nucleolo e sono chiamati Circondato Nucleolo (SN), mentre il restante 30% mostrare un segnali positivi più maculati e sono chiamate Non Circondato Nucleolo (NSN) ^3-5. Recentemente abbiamo dimostrato che l'assenza di reticoli citoplasmatici ⁹ (CPL, siti di stoccaggio importanti per mRNA di origine materna e ribosomi sia in ovociti di mammiferi ed embrioni) ¹⁰ e la down-regolazione di MATER (essenziale per CPL formazione ^11), unitamente alla presenza di gocce lipidiche nei loro cytoplasms ^9,12, possono essere altre cause legate alla ovociti incapacità NSN a procedere oltre la fase 2 cellule.

Purtroppo, poche tecniche possono essere applicate per ordinare SN antrale e oociti NSN e,per questa ragione, lo sviluppo di un metodo meno invasivo (senza colorazione nucleare, le procedure di fissaggio o di manipolazione con pipette bocca) potrebbe diventare molto importante aumentare i tassi di entrambi sviluppo embrionale umano e animale.

In questo lavoro, abbiamo dettaglio il protocollo semplice e veloce utilizzato per isolare annuncio sorta SN e NSN oociti antrali di topi di sesso femminile e si rivolge a tutti gli scienziati interessati allo studio della gametogenesi femminile, la maturazione degli ovociti e sviluppo embrionale.

Protocollo

Questo protocollo è condotto in conformità con i principi ispiratori del Europea (UE 63/2010) e Italiano (26/2014) leggi che proteggono gli animali utilizzati per la ricerca scientifica. Cervicale dislocazione l'eutanasia viene utilizzato per l'isolamento ovaie ed è eseguita da esperti e soggetti elencati nel protocollo approvato che copre questo studio addestrato.

1. Gli animali

1. Mantenere adulti da 3 a 6 settimane di età topi femmina in una stanza a temperatura e umidità controllate (con fasi di 12L: 12D e alimentati ad libitum).
2. Iniettare topi per via intraperitoneale con 2.5 UI di gonadotropina del siero di cavalla incinta (PMSG) per stimolare la crescita follicolare imitando gli effetti dell'ormone follicolo-stimolante (FSH). Isolare le ovaie di ovociti antrali di raccolta 48 ore successive. Euthanize il mouse femminile precedentemente iniettato con PMSG, in base alle proprie linee guida istituzionali.
3. Rimuovere rapidamente le ovaie dalla cavità del corpo e metterli nel piatto cont Petriaining M2 mezzo per successivo isolamento ovociti (vedi sezione 3).
   1. Effettuare un'incisione sulla pelle che copre la parete addominale seguita da un'incisione nel peritoneo utilizzando forbici dissezione sterili. Aprire l'incisione per esporre l'addome, spostare le viscere da una parte con una pinzetta sterile e localizzare i tubi uterine, formando una forma a V a partire dalla vescica.
   2. Osservare le ovaie si trovano al di sotto dei reni. Tenere ogni tubo con pinzetta sterile e fare una piccola incisione nella parte inferiore delle ovaie a rilasciarli. Trasferire entrambe le ovaie nella parte inferiore di una piastra di Petri contenenti terreno pre-equilibrata.

2. Ormone Preparazione

1. Diluire PMSG (disponibile in diverse concentrazioni archivi) con soluzione salina isotonica sterile per ottenere una concentrazione di lavoro di 2,5 UI di ormone per 0,1 ml di un volume di iniezione appropriata.
   NOTA: Le soluzioni di ormoni devono essere aliquotati in provette da 0,5 ml e conservati a -20 ° C fino al giorno di utilizzo. Non tenere aliquote diluito superiori a tre mesi a -20 ° C. Una volta scongelato, se si eseguono iniezioni seriali, memorizzare le aliquote delle soluzioni ormonali a +4 ° C e utilizzare entro 4 giorni.

Isolamento 3. Antral Ovociti

Per un corretto isolamento ovociti:

1. Equilibrare M2 medio ¹³ (M2) al 5% di CO ₂ e 37 ° C per almeno 1 ora prima di avviare la procedura di isolamento oociti. Preparare due piastre di Petri (35 mm x 10 mm), una con 1 ml di m2 per punzonamento ovaie e la seconda con piccole gocce (20 ml) di M2 coperto con olio minerale (~ 1,5 ml) per il trasferimento ovociti dopo isolamento dal ovaia (vedi 3,4-3,6). Tenere entrambe le capsule di Petri in incubatore al 5% di CO ₂ e 37 ° C fino al momento di essere utilizzati.
2. Utilizzare uno stereomicroscopio durante le procedure di isolamento ovociti.
3. Preparare sottili pipette di vetro bocca per raccogliere gli ovociti stetchhing pipette Pasteur in vetro tenute orizzontalmente (tenendo le estremità della pipetta con entrambe le mani), a fiamma verticale proveniente dal bruciatore Bunsen (Figura 1).
   1. Una volta che il vetro inizia a fondere, prendere la pipetta della fiamma ed eseguire un movimento di trazione rapido avere la pipetta desiderata. Saldamente tagliare il vetro in eccesso vicino al punto stretto della pipetta con unghie per regolare la lunghezza e il diametro interno del capillare. Assicurarsi che il sottile capillare ha un diametro interno di ~ 100 micron, leggermente maggiore del diametro del ovocita (~ 80 micron).
   2. Per bocca pipetta, collegare un'estremità del tubo di aspirazione alla pipetta tirato utilizzando una punta appropriata e posizionare l'altra estremità in bocca, fissandolo con i denti.
4. Raccogliere ovaie usando pinzette sterili e depositarli sul fondo di un piatto di coltura cellulare di Petri (35 mm x 10 mm). Coprire con 1 ml di M2 precedentemente equilibrata a 37 ° Ce 5% CO ₂ (Figura 2).
5. Forare delicatamente i follicoli antrali delle ovaie con un ago sterile siringa da insulina per liberare oociti antrali a M2 (Figura 3).
6. Delicatamente bocca pipettare gli ovociti attraverso uno stretto pipetta Pasteur per rimuovere le cellule follicolari e qualsiasi altri detriti tessuto possibile (Figura 4A) e poi depositarsi sul fondo di piccole gocce (20 mL) di M2 coperti con olio minerale adatto a cultura dell'embrione (precedentemente preparati; Figura 4B).
   NOTA: E 'importante rimuovere tutte le cellule del cumulo collegati alla zona pellucida degli ovociti pipettando continuo attraverso diversi e diverse gocce di M2. Eseguire questo passaggio il più velocemente possibile per evitare alterazioni del pH del mezzo.

4. Antral ovociti colorazione con Hoechst33342

NOTA: ovociti Antral può essere distinta in SN (Circondato Nucleolo), NSN (Non Circondato Nucleolo) oin qualsiasi altra forma intermedia, in base alla loro organizzazione della cromatina dopo colorazione con concentrazione sopravitale di Hoechst33342 (o qualsiasi altro marker specifici per le basi AT) ^14. In effetti, gli ovociti SN mostrano un anello Hoechst-positivo attorno al nucleolo mentre la NSN non lo fanno, da qui il suo nome.

Per una corretta colorazione ovociti:

1. Trasferire gli ovociti usando una pipetta bocca in gocce di Hoechst33342 (20 ml) diluito in M2 alla concentrazione sopravitale di 50 ng / ml per 10 min in scuro.
2. Dopo l'incubazione con Hoechst33342, trasferire ogni singolo ovocita con una pipetta a bocca in fondo piccole gocce (5 mL) di M2 coperti con olio minerale, per l'ordinamento basato su organizzazione della cromatina (SN o NSN). Utilizzare qualsiasi microscopio a fluorescenza dotato di filtro Hoechst33342 (lunghezza d'onda di emissione 486 nm) per visualizzare la configurazione della cromatina degli ovociti.
   NOTA: A seconda del tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, it può diventare indispensabile utilizzare vetro Petri fondo per l'acquisizione delle immagini. La microscopia confocale Olympus Fluoview Fv10i quando dotata di supporto del campione per 35 millimetri piatto richiede solo vetro bottom-piatti per l'acquisizione di immagini, con spessore standard 0,17 millimetri e un range da 0,13 a 0,21 millimetri accettabili.
3. Eccitare gli ovociti per non più di 5-10 sec, probabilmente abbastanza tempo per visualizzare la presenza o l'assenza di un anello attorno al nucleolo (Figura 5).
4. Dopo la cernita, la cultura SN antrale e ovociti NSN in M2 al 5% di CO ₂ e 37 ° C per indurre la maturazione in vitro o tenerli in buffer appropriate per analisi molecolari e cellulari.

Risultati

Le seguenti immagini mostrano il metodo utilizzato per isolare oociti antrali da ovaie di topo, a partire dalle pipette preparazione alla selezione degli ovociti 'per mezzo di Hoechst33342. Questo metodo è molto semplice e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio dotato di CO ₂ incubatore, uno stereomicroscopio e un microscopio a fluorescenza equipaggiato con il filtro corretto per l'osservazione del Hoechst33342 Figura 1 mostra la fase iniziale ...

Discussione

Questo protocollo descrive il metodo utilizzato per isolare e classificare il mouse antrali GV ovociti. Non vi sono particolari passaggi critici per sottolineare, con poche eccezioni. Primo: questa procedura deve essere eseguita il più rapidamente possibile: a) mantenere la vitalità degli ovociti e b) evitare variazioni di pH del mezzo utilizzato. Secondo: gli ovociti devono essere brevemente eccitato (5-10 sec) per Hoechst33342 per evitare danni cromatina e la successiva morte degli ovociti, soprattutto se IVM e IVF ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177