핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

요약

여기에서 우리는 핵소체 조직을 기반으로 마우스의 전 정부 난자의 특성에 대한 프로토콜을 제시한다.

초록

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

서문

난소 전 정부 구획실로부터 분리 전 정부 완전히 자란 난자 (GV, 새싹 소포)는 일상적 같은 다른 목적을 위해 사용되는 예를 들면, 중기 II 단계까지 시험 관내 성숙 뒤에 분자 세포 메카니즘의 연구.

그들의 아름다운 외관에도 불구하고 대부분의 전 정부 난자, 전부는 아니지만, 감수 분열을 완료하고 포배기에 도달 할 수있다; 시비 ^{3-5 발생할} 경우 실제로 인간 ^1,2- 포함한 많은 포유류 종에서, 이들 중 약 30 %, 2 단계에서 셀들이 개발 체포. 현재까지, 몇몇 파라미터는 그렇게 할 수없는 것과 배아 발달을 유지할 수 난자를 구별하기 위해 사용된다.

예를 들어, 크레 실 블루 염색 (BCB)은 BCB + 또는 BCB- 염색 관련이 정렬 방법의 유용성이 있지만 글루코오스 -6- 포스페이트 탈수소 효소의 활성에 기초하여 난자를 정렬하는 방법으로서 유효한여전히 ^6-8 의존 실험실.

또 다른 잘 확립 된 방법은 염색질 조직에있는 (Hoechst33342 같은) 어떤 DNA의 인터 염료로 염색하는 경우, 전 정부 난자의 70 %가 핵소체 주위에 염료 긍정적 인 반지를 보여 핵소체 (SN)를 둘러싸인라고 30 %를 유지하면서 더 발견 긍정적 인 신호를 보여주고 (NSN) ^3-5하지 둘러싸인 핵소체라고합니다. 최근에 우리는 보여 주었다 세포질 그릴 ⁽⁹⁾ (CPLS, 포유류의 난자와 배아 모두 모계 유래의 mRNA와 리보솜에 중요한 저장 사이트)의 부재 ^(10)의 존재와 함께 (CPLS 형성 ^(11)에 대한 필수) 이잖아요의 하향 조절, 그들의 세포질 ^9,12- 지질 방울, 2 세포 단계 이상으로 진행 NSN 난자의 무능력과 관련된 다른 원인이 될 수 있습니다.

불행하게도, 몇몇 기술은 전 정부 SN과 NSN의 난자와 정렬을 적용 할 수 있습니다,이러한 이유로, (핵 염색, 정착 절차 또는 입 피펫으로 조작없이) 덜 침습적 방법의 개발이 모두 인간과 동물의 배아 발달의 속도를 높이기 위해 매우 중요해질 수있다.

본 논문에서는 세부 간단하고 빠른 프로토콜은 광고 정렬 SN과 여성의 생쥐에서 NSN 전 정부 난자를 격리하는 데 사용됩니다 그것은 여성 배우자, 난자의 성숙과 배아 개발의 연구에 관심이있는 모든 과학자들에게 해결됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 유럽의 원칙 (EU 2천10분의 63)과 과학 연구에 사용되는 동물을 보호하는 이탈리아어 (2천14분의 26) 법에 따라 수행된다. 경추 탈구 안락사는 난소 분리를 위해 사용되며, 이는 본 연구를 덮는 승인 프로토콜에 나열된 개인 전문가에 의해 수행되고 훈련된다.

1. 동물

1. 제어 온도와 습도 방에 6 주령의 암컷 마우스에 성인 3을 유지한다 (12L의 단계와 : 12D와 공급 임의로).
2. 난포 자극 호르몬 (FSH)의 효과를 모방하여 모낭의 성장을 자극하는 임신 한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬의 2.5 IU (PMSG) 마우스에 복강 주사. 이후 전 정부 난자 수집 48 시간의 난소를 분리합니다. 하여 기관 가이드 라인에 따라, 이전에 PMSG 주입 암컷 마우스를 안락사.
3. 신속 체강에서 난소를 제거하고 배양 접시의 계속에 그들을 배치후속 난자 격리를위한 M2 매체 aining (섹션 3 참조).
   1. 해부 멸균 가위를 사용하여 복막에 절개 하였다 복벽을 덮는 피부에 절개를. 방광에서 시작하여 V 자 모양을 형성, 복부를 노출 절개를 열고 멸균 핀셋을 사용하여 한쪽에 용기를 이동하고 자궁 튜브를 지역화.
   2. 신장 아래에있는 난소를 관찰한다. 멸균 트위터와 각 튜브를 잡고 그들을 해제 난소의 하단에 작은 절개를합니다. 미리 평형화 매체를 함유하는 페트리 접시의 하단 양쪽 난소를 전송.

2. 호르몬 준비

1. 적절한 주입 부피 0.1 mL의 2.5 IU 호르몬의 작용 농도를 얻기 위해 멸균 등​​장 성 식염수로 (다른 스톡 농도에서 사용 가능) PMSG 희석.
   참고 : 호르몬 솔루션은 0.5 ml의 튜브에 분주하고 저장해야합니다 -2사용 일까지 0 ° C. -20 ° C 3 개월 이상 희석 분취 량을 보관하지 마십시오. 해동 후에 직렬 주사를 수행하는 경우, +4 ℃에서 호르몬 용액의 분취 량을 저장 4 일 이내에이를 사용.

3. 전 정부 난 모세포 분리

적절한 난 모세포 분리의 경우 :

1. 난자 분리 절차를 시작하기 전에 최소한 1 시간 동안 5 % CO _2, 37 ℃에서 ¹³ M2 매체 (M2)를 평형. 두 개의 배양 접시 (35mm X 10mm), 난소 천공과에서 분리 한 후 난자 전송을 위해 미네랄 오일 (~ 1.5 ml)로 덮여 M2의 작은 방울과 두 번째 (20 μL)에 대한 (M2) 1 ml의 하나를 준비합니다 난소 (3.4-3.6 참조). 준비가 사용되는 때까지 5 % CO _2, 37 ° C에서 인큐베이터에서 모두 배양 접시를 유지합니다.
2. 난 모세포의 분리 과정에서 실체 현미경을 사용합니다.
3. 스트레치에 의한 난자를​​ 수집하는 얇은 입 유리 피펫을 준비힝 유리 파스퇴르 피펫은 분젠 버너에서 오는 수직 화염 (그림 1)을 통해, (두 손으로 피펫의 끝을 잡고) 수평으로 유지했다.
   1. 유리가 녹기 시작하면, 불꽃에서 피펫을 원하는 피펫을 얻기 위해 빠른 당기는 운동을 수행합니다. 단단히 길이와 내부 모세관의 직경을 조정 손톱으로 피펫의 좁은 점에 가까운 초과 유리를 잘라. 얇은 모세관은 난자의 직경보다 약간 큰 ~ 100 ㎛의 내부 직경을 가지고 있는지 확인합니다 (~ 80 μm의).
   2. 입 피펫, 적절한 팁을 이용하여 뽑아 피펫에 흡인기 관의 한쪽 끝을 연결하고 이빨을 확보 입 타단 장소.
4. 무균 핀셋을 사용하여, 난소를 수집하고 세포 배양 용 배양 접시 (35mm X 10mm)의 바닥에이를 증착. M2 1ml의 이전에 37 ℃에서 평형화 그들을 덮5 % CO ₂ (그림 2).
5. 부드럽게 M2 (그림 3)에서 전 정부 난자를 해제 멸균 인슐린 주사기 바늘로 난소의 난포에 구멍.
6. 부드럽게 입 여포 세포 및 다른 가능한 조직 파편 (도 4a)를 제거하고 이전 (배아 배양에 적합한 광유 덮여 M2의 작은 방울 (20 μL)의 하단에이를 정착 좁은 파스퇴르 피펫을 통해 난자를 피펫 준비도 4B).
   주 : (M2)의 여러 다른 방울을 통해 지속적으로 피펫 팅에 의한 난자의 투명대에 연결된 모든 난구 세포를 제거하는 것이 중요하다. 매질의 pH의 변화를 피하기 위해 가능한 한 빨리이 단계를 수행한다.

Hoechst33342 4. 전 정부 난 모세포 염색

참고 : 전 정부 난자는 SN (둘러싸인 핵소체), N​​SN (핵소체를 둘러싸인되지 않음) 또는 구별 할 수있다다른 중간 형태로, Hoechst33342의 supravital 농도 (또는 염기에 대한 구체적인 다른 마커 AT) ⁽¹⁴⁾ 염색 후 자신의 염색질 조직을 기반으로. NSN은 따라서,하지의 이름을하면서 사실, SN 난자는 핵소체 주위 헥스 양성 반지를 보여줍니다.

적절한 난자 염색의 경우 :

1. 어둠 속에서 10 분 동안 50 NG / μL의 supravital 농도 Hoechst33342 (20 μL) (M2)에 희석 방울로 입 피펫을 사용하여 난자를 전송합니다.
2. Hoechst33342 함께 배양 후, 조직 염색질 (SN 또는 NSN)에 기초한 정렬, 광유 덮여 M2의 작은 방울 (5 μL)의 바닥에 입을 피펫으로 각 단일 난자 옮긴다. 난자의 염색질 구성을 시각화 Hoechst33342 필터 (발광 파장 486 ㎚)을 갖추고있는 형광 현미경을 사용합니다.
   주 : 사용 된 형광 현미경의 종류에 따라, 난T는 이미지 수집을 위해 유리 바닥 배양 접시를 사용하는 것이 필수적 될 수 있습니다. 35mm 요리에 대한 시편 홀더를 장착 공 초점 현미경 올림푸스 Fluoview Fv10i는 0.17 mm의 표준 두께 허용 0.13 0.21 mm 정도의 범위와 이미지 수집에만 유리 바닥 요리가 필요합니다.
3. 아마도, 더 이상보다 5-10 초 동안 존재 핵소체 주위의 링 부재 (도 5)를 가시화하기에 충분한 시간을 난 모세포를 자극.
4. 체외 성숙을 유도 또는 분자 나 세포 분석을위한 적절한 버퍼에 보관 5 % CO _2, 37 ℃에서 (M2)에서, 문화 전 정부의 SN과 NSN 난자를 정렬 한 후.

결과

다음 이미지 Hoechst33342 의해 난자 '정렬에 피펫 준비부터 마우스 난소 전 정부로부터 난자를 분리하기 위해 사용 된 방법을 보여준다. 이 방법은 매우 간단하고, CO2 _{인큐베이터,} 실체 현미경과 Hoechst33342의 관측을위한 올바른 필터를 갖춘 형광 현미경에 장착 된 임의의 실험실에서 수행 될 수있다 (1) 수치는 피펫 제조의 초기 단계를 보여준다. 유리 ?...

토론

이 프로토콜은 분리 및 마우스 전 정부 GV 난자를 분류하기 위해 사용 된 방법을 설명한다. 몇 가지 예외를 제외하고, 밑줄 특별히 중요한 단계가 없습니다. ) 난자의 활력을 유지하고 b)에 사용되는 배지에서 pH 변화를 방지 : 첫째 :이 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 둘째 : 난자는 IVM과 체외 수정은 다음 단계는 특히, 염색질 손상 및 난자의 후속 죽음을 피하기 위해 Hoechst33342에 (5 ~ 10 초) ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177