בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

Abstract

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures.

Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.

Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Introduction

ביציות Antral גדלו באופן מלא (GV, שלפוחית ​​נבטי) מבודדות מתא Antral של השחלה משמשות באופן שיגרתי למטרות שונות כגון, למשל, המחקר של המנגנונים המולקולריים ותאיים מאחורי התבגרות במבחנה עד שלב Metaphase השני.

למרות ביציות המראה היפות שלהם Antral ביותר, אך לא כולם, הם מסוגלים להשלים מיוזה ולהגיע לשלב הבלסטוציסט; למעשה, במינים רבים של יונקים, כולל בני האדם ^1,2, כ -30% מהם לעצור את התפתחותם בשלב 2-התא, אם מתרחשת הפריה ^3-5. עד כה, כמה פרמטרים המשמשים להבחין בין ביציות יוכלו לקיים התפתחות העוברית מאלה שאינם מסוגלים לעשות זאת.

לדוגמא, מכתים Cresyl הכחול (BCB) הוא שיטה תקפה כדי למיין את הביציות המבוססים על הפעילות של גלוקוז-6-פוספט-דהידרוגנז למרות התועלת של שיטת מיון זו קשורה לBCB + או הכתמת BCB- היאעדיין מעבדה תלויה ^6-8.

שיטה נוספת מבוססת היטב מתגוררת בארגון הכרומטין: אם מוכתם בכל צבעי intercalating DNA (כמו Hoechst33342), 70% מביציות Antral להראות צבע חיובי טבעת סביב הגרעין, והם נקראים מוקף הגרעין (SN), בעוד שנותר 30% להראות אותות חיוביים מנוקדים יותר ונקראים גרעין אינו מוקף (NSN) ^3-5. לאחרונה הראו כי היעדר רשתות cytoplasmic ⁹ (הרב"טים, אתרי אחסון חשובים לmRNA נגזר אימהי והריבוזומים בשני ביציות ועוברי יונקים) ¹⁰ ומטה-הרגולציה של מאטר (חיונית להיווצרות רב"טים ^11), יחד עם הנוכחות של טיפות שומנים בcytoplasms ^9,12, יכולות להיות גורמים נוספים הקשורים לחוסר יכולת ביציות NSN כדי להמשיך מעבר לשלב 2-התא.

למרבה הצער, ניתן ליישם כמה טכניקות כדי למיין SN Antral וביציות NSN ו,מסיבה זו, הפיתוח של שיטה פחות פולשנית (ללא הכתמה גרעינית, נהלי קיבעון או מניפולציה עם טפטפות פה) יכול להיות מאוד חשוב כדי להגדיל את השיעורים של שני פיתוח עובר האדם ובעלי חיים.

במאמר זה, אנו פירוט הפרוטוקול הפשוט ומהיר המשמשים לSN סוג המודעה וביציות Antral NSN מנקבות עכברים לבודד והוא התייחס לכל המדענים מתעניינים במחקר של gametogenesis נקבה, הבשלת ביצית והתפתחות עובר.

Protocol

פרוטוקול זה נערך בהתאם לעקרונות המנחים של אירופה (האיחוד האירופי 63/2010) ו- (26/2014) חוקי הגנה האיטלקים בעלי חיים המשמשים למחקר מדעי. המתת חסד נקע בצוואר הרחם משמשת לבידוד השחלות וזה מתבצע על ידי מומחה ומיומן אנשים רשומים בפרוטוקול שאושר על כיסוי מחקר זה.

1. בעלי חיים

1. לשמור על מבוגרים 3 לנקבות עכברים 6 שבועות בן בחדר עם טמפרטורה מבוקרת ולחות (עם שלבים של 12L: 12D וכרצונך הפד).
2. הזרק עכברי intraperitoneally עם 2.5 IU של גונדוטרופין סרום סוסה בהריון (PMSG) כדי להמריץ את צמיחת זקיקים על ידי המחקה את ההשפעה של הורמון מגרה זקיק (FSH). לבודד את השחלות ל48hrs אוסף ביציות Antral מאוחר יותר. להרדים את נקבת העכבר הזריק בעבר עם PMSG, על פי ההנחיות מוסדיות שלך.
3. להסיר במהירות את השחלות מחלל הגוף ולהכניס אותם לתוך המשך צלחת פטריaining בינוני M2 לבידוד ביציות שלאחר מכן (ראה סעיף 3).
   1. עושה חתך בעור המכסה את דופן הבטן ואחריו חתך בהצפק באמצעות מספריים לנתיחה סטרילית. פתח את החתך על מנת לחשוף את הבטן, להזיז את האומץ בצד אחד באמצעות פינצטה סטרילי ולמקם את צינורות הרחם, ויוצר צורת V-החל משלפוחית ​​השתן.
   2. שים לב לשחלות ממוקמות מתחת לכליות. החזק כל צינור עם פינצטה סטרילי ולעשות חתך קטן בחלק התחתון של השחלות לשחרר אותם. העבר את שני השחלות בתחתית צלחת פטרי המכילה בינוני מראש equilibrated.

2. הורמון הכנה

1. לדלל PMSG (זמין בריכוזים שונים המניה) עם תמיסת מלח איזוטוני סטרילי כדי לקבל ריכוז עבודה של 2.5 הורמון IU ל0.1 מ"ל למתאימה עוצמת זריקה.
   הערה: פתרונות הורמון חייבים להיות aliquoted ב 0.5 מיליליטר צינורות ומאוחסנים ב -20 ° C עד ליום שימוש. אין להשאיר aliquots המדולל יותר משלושה חודשים ב -20 ° C. ברגע שהפשיר, אם זריקות סידוריים מבוצעות, לאחסן aliquots של פתרונות הורמון ב+4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בם בתוך 4 ימים.

בידוד 3. Antral ביציות

לבידוד ביציות תקין:

1. לאזן M2 בינוני ¹³ (M2) בשעת 5% CO ₂ ו- C ° 37 במשך שעה לפחות 1 לפני שתתחיל בהליך בידוד ביציות. הכן שתי צלחות פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ), אחד עם 1 מיליליטר של M2 לניקוב השחלה והשני עם טיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסה בשמן מינרלים (~ 1.5 מיליליטר) להעברת ביציות לאחר בידוד מ השחלה (ראה 3.4-3.6). לשמור על שני צלחות פטרי בחממה ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
2. השתמש בסטראו בנהלי בידוד ביציות.
3. הכן טפטפות זכוכית פה דקה כדי לאסוף את הביציות בסרטטפטפות פסטר זכוכית הינג המשיכה אופקית (מחזיקה את הקצוות של פיפטה בשתי הידיים), על אש אנכית המגיעה מהמבער בונזן (איור 1).
   1. ברגע שהכוס מתחילה להפשיר, לקחת את pipet מתוך הלהבה ולבצע תנועה מושכת מהירה כדי להשיג את פיפטה הרצויה. בתוקף לחתוך את הזכוכית העודפת קרובה לנקודה של פיפטה עם ציפורניים כדי להתאים את האורך והקוטר של הנימים הפנימיות הצרה. ודא שיש לו את הנימים דקות בקוטר פנימי של ~ 100 מיקרומטר, מעט גדול יותר מהקוטר של הביצית (~ 80 מיקרומטר).
   2. לפה פיפטה, חבר קצה אחד של צינור aspirator לפיפטה משכה באמצעות קצה מתאים ולמקם את הקצה השני בפה, המאבטח אותו עם השיניים.
4. לאסוף את השחלות באמצעות פינצטה סטרילית ולהפקיד אותם בתחתית צלחת פטרי תרבית תאים (35 מ"מ x 10 מ"מ). לכסות אותם עם 1 מיליליטר של M2 equilibrated בעבר על 37 מעלות צלזיוסו 5% CO ₂ (איור 2).
5. בעדינות לנקב את זקיקי Antral של השחלות עם מחט מזרק אינסולין סטרילי לשחרר ביציות Antral בM2 (איור 3).
6. בעדינות את הפה pipet הביציות באמצעות פיפטה פסטר צרה כדי להסיר תאי זקיק וכל פסולת אחרת אפשרית רקמה (איור 4 א) ולאחר מכן ליישב אותם בתחתית הטיפות קטנות (20 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים מתאים לתרבות עובר (בעבר הכין; איור 4).
   הערה: חשוב להסיר את כל תאי קומולוס המצורפים למעטפת השקופה של הביציות על ידי pipetting הרציף באמצעות מספר ושונה טיפות של M2. לבצע שלב זה מהר ככל האפשר, כדי למנוע שינויים ב- pH של המדיום.

4. Antral ביציות צביעה עם Hoechst33342

הערה: ביציות Antral ניתן להבחין בSN (גרעין מוקף), NSN (לא מוקף גרעין) אובכל צורת ביניים אחרת, המבוסס על ארגון הכרומטין לאחר צביעה עם ריכוז supravital של Hoechst33342 (או כל סמנים אחרים ספציפיים לבסיסים AT) ^14. למעשה, ביציות SN להראות טבעת Hoechst חיובית סביב הגרעין תוך NSN לא, ומכאן שמה.

עבור מכתים ביציות תקין:

1. מעבירים את הביציות באמצעות פיפטה פה לטיפין של Hoechst33342 (20 μl) בדילול מלא בM2 בריכוז supravital של 50 ng / μl עבור 10 דקות בחושך.
2. לאחר הדגירה עם Hoechst33342, להעביר את כל ביצית אחת עם טפטפת פה בחלק התחתון של טיפות קטנות (5 μl) של M2 מכוסים בשמן מינרלים, למיון המבוסס על ארגון הכרומטין (SN או NSN). השתמש בכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן Hoechst33342 (אורך גל פליטה 486 ננומטר) כדי להמחיש את תצורת הכרומטין של הביציות.
   הערה: בהתאם לסוג של מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש, אנילא יכול להיות הכרחי כדי להשתמש בצלחת פטרי זכוכית תחתונה לרכישת תמונה. מיקרוסקופיה confocal אולימפוס Fluoview Fv10i כשהוא מצויד בבעל דגימה במשך 35 צלחת מ"מ דורשת תחתונה מנות רק זכוכית לרכישת תמונה, עם עובי סטנדרטי 0.17 מ"מ וטווח 0.13-0.21 מ"מ מקובל.
3. Excite הביציות לא יותר מ 5-10 שניות, סביר להניח מספיק זמן כדי להמחיש את הנוכחות או היעדר טבעת סביב הגרעין (איור 5).
4. לאחר המיון, התרבות SN Antral וביציות NSN בM2 ב 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס כדי לגרום להבשלה חוץ גופייה או לשמור אותם במאגרים מתאימים לניתוחים מולקולריים או סלולריים.

תוצאות

התמונות הבאות מציגות את השיטה המשמשת כדי לבודד ביציות Antral משחלות עכבר, החל מהכנת טפטפות למיון 'הביציות באמצעות Hoechst33342. שיטה זו היא די פשוטה וניתן לבצעו בכל מעבדה מצוידת בחממה CO _2, סטראו ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסנן המתאים להתבוננות בHoe...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את השיטה המשמשת כדי לבודד ולסווג ביציות GV Antral העכבר. אין שלבים קריטיים במיוחד כדי להדגיש, עם כמה יוצאים מן הכלל. ראשון: הליך זה צריך להתבצע במהירות אפשרית ל: א) לשמור על החיוניות של הביציות וב) להימנע משינויי pH בטווח הבינוני בשימוש. שני: ביציות צריכה להי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PMSG	Sigma	G4527
EmbrioMax M2	Millipore	MR-015-PD
Hoechst33342	Thermo Scientific	62249
Mineral Oil	Sigma	M8410
Cell Culture Dish 35mmx10mm	Corning	430165
µ-Dish 35mm, high glass bottom	Ibidi	81158
Pipette Pasteur Borosilicate	Corning	7095D-9
Aspirator tube assemblies for calibrated micropillary pipettes	Sigma	A5177