JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

القضاء على خلايا معينة دون الإضرار خلايا أخرى أمر صعب للغاية، وخاصة في الأنسجة المعمول بها، وهناك حاجة ملحة لطريقة القضاء خلية في الحقل هندسة الأنسجة. في الوقت الحاضر في مجال الطب التجديدي، مزارع الأنسجة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ES)، والخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية الخاصة)، أو الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (آي بي إس) هي مواد واعدة 1-3.

على الرغم من أن هذا تجديد الأنسجة واعد، وتلوث مع الخلايا غير المرغوب فيه هو مصدر قلق كبير. وعلاوة على ذلك، هناك قلق سلامة tumorigenicity بعد زرع 4،5. وعلى الرغم من العديد من الدراسات التي تركز على هذه القضايا للقضاء على خلايا معينة، وخاصة في مجال الطب التجديدي 6-8، ولم تستحدث طريقة عملي.

photoimmunotherapy الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد الوطني PIT) هو علاج يقوم على conjugat الأجسام المضادة photoabsorberه (APC). يتكون من APC من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة خلية محددة (ماب) وphotoabsorber، IR700. IR700 هو ماء السيليكا فثالوسيانين مشتق ولا يسبب الضيائية في حد ذاته 9. ومترافق IR700 تساهميا إلى الضد عبر بقايا أميد على الجانب سلسلة من الجزيئات يسين. آسيا والمحيط الهادئ تربط الجزيئات المستهدفة على غشاء الخلية ومن ثم يدفع نخر خلية فوري تقريبا بعد التعرض لضوء الجرد الوطني في 690 نانومتر. خلال التعرض لقوائم الجرد الوطنية للضوء، وتمزق الغشاء الخلوي مما يؤدي إلى موت الخلايا 9-14. وقد ثبت الجرد الوطني حفرة لتكون فعالة مع الأجسام المضادة متعددة أو شظايا الأجسام المضادة، بما في ذلك مكافحة EGFR، ومكافحة HER2، ومكافحة PSMA، ومكافحة CD25، ومكافحة mesothelin، ومكافحة GPC3، ومكافحة CEA 15-21. لذلك، الجرد الوطني PIT يمكن استخدامها ضد طائفة واسعة من الجزيئات المستهدفة. وعلاوة على ذلك، الجرد الوطني PIT هو علاج جيد للرقابة التي تسمح المعاملة الانتقائية من مناطق معينة عن طريق تقييد الجرد الوطني من lighر التشعيع 18،22.

هنا، فإننا نقدم وسيلة للقضاء خلية معينة باستخدام الجرد الوطني حفرة من الثقافات 3D المختلطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: يصف بروتوكول التالي الخطوات اللازمة للقضاء على خلايا محددة باستخدام الجرد الوطني حفرة. الضوابط وغيرها من التفاصيل حول الجرد الوطني حفرة وبقاء الخلية يمكن العثور عليها في أي مكان آخر (18).

1. الإقتران من IR700 إلى وحيدة النسيلة الأجسام المضادة (ماب)

  1. إعداد خريطة موقع من الفائدة في 2-5 ملغ / مل في 0.1 م نا 2 هبو 4 (درجة الحموضة 8.6) حل.
  2. خلط 6.8 نانومول من ماب مع 30.8 نانومول من 10 ملي IR700 في 0.1 M نا 2 هبو 4 الحل (درجة الحموضة 8.6) في أنبوب microcentrifuge واحتضان في RT لمدة 1 ساعة، مغطاة بورق الألومنيوم.
  3. غسل العمود PD-10 (انظر جدول المواد / المعدات) مع 15 مل PBS، مرتين. تحميل عينة من الخطوة 1.2.
  4. تنقية خليط عبر العمود PD-10 بواسطة برنامج تلفزيوني شطف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: وهنا، كان شطف طول اللون عصابة من IR700. للحصول على نموذج 300 ميكرولتر، PBS شطف جزء عادة بين 2.5 مل إلى 4.4 مل.
  5. تحديدتركيز البروتين مع Coomassie تلطيخ عن طريق قياس امتصاص عند 595 نانومتر مع معمل 9. تحديد تركيز IR700 مع امتصاص عند 689 نانومتر إلى تأكيد عدد من الجزيئات fluorophore مترافق إلى كل جزيء ماب 9.
    ملاحظة: من المهم تحديد عدد الاقتران الأمثل للجزيئات IR700 في 1 ماب مع معمل. عموما، حوالي 3 جزيئات IR700 في 1 ماب جزيء هو الأمثل لكل من في المختبر وعمل الجسم الحي. طرق HPLC وSDS-PAGE يمكن استخدامها لتأكيد ما إذا كان ماب وIR700 ملزمة أم لا.
  6. تخزين عند 4 درجات مئوية بعد تحديد تركيز البروتين.

2. إعداد المختلطة خلية الثقافة 3D (المختلطة الجسم الشبه الكروي)

  1. تطبيق الماء المعقم (حوالي 1 مل) في القسم خزان لوحة من لوحات معلقة الهبوط.
  2. إعداد نسب مختلفة من أنواع الخلايا من الفائدة - خلايا A431-لوك-GFP والخلايا 3T3-طلب تقديم العروض -مع كل عينة تحتوي على 5000 خلايا الكلية، وعلقت في 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة.
    ملاحظة: إعداد 1: 100، 10: 100، 25: 100، 50: 100، الخ نسب الخلايا أنواع من الاهتمام في وسائل الإعلام ثقافة تبعا لنوع الخلية.
  3. احتضان هذا المزيج لمدة 5-7 أيام في شنقا جيدا لوحة انخفاض 96 في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل يوم 2. ملاحظة: لجعل كروي في 3D على وجه التحديد، والتعامل مع لوحة بلطف، وقطرات تحتوي على خلايا تسقط بسهولة قبل تشكيل الأشكال 3D.
  4. مراقبة الصرف وحجم الكروية باستخدام المجهر brightfield مقلوب في 10X - 40X التكبير. ملاحظة: على الرغم من أنه يعتمد على أنواع الخلايا وحجم القطرة المعلقة، تأكد من أن قطر كروي حوالي 400-600 ميكرون بعد 7 أيام من الحضانة في ال 96 جيدا شنقا انخفاض لوحة.

3. في المختبر الجرد الوطني حفرة لالمختلطة خلية الثقافة 3D

  1. تغيير وسائل الإعلام للهكتارnging لوحات قطرة إلى 10 ميكروغرام / مل الأجسام المضادة photoabsorber المترافقة (APC) التي تحتوي على وسائل الإعلام، واحتضان لمدة 6 ساعات في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  2. بعد 6 ساعات الحضانة، وغسل كروي مرتين مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة (الفينول الحمراء الحرة). نقل بلطف كروي على طبق القاع الزجاجي 50 ملم مع 100 ميكرولتر الفينول الطازجة وسائل الإعلام الثقافة الحرة الأحمر باستخدام معقم 200 ميكرولتر ماصة مع قطع قبالة الطرف. وضع كروي واحد في كل طبق.
  3. مراقبة كروي مع المجهر brightfield مقلوب للكشف عن تغيير التشكل. لمراقبة الصحفيين البصرية (على سبيل المثال، GFP وطلب تقديم العروض) استخدام المجهر مضان مع إعدادات التصفية التالية: GFP - 469 نانومتر تصفية الإثارة، وتصفية الانبعاثات 525 نانومتر. طلب تقديم العروض - 559 مرشح نانومتر الإثارة، و 630 مرشح الانبعاثات نانومتر.
  4. وضع الصمام الثنائي الباعثة للضوء (LED) فوق طبق القاع الزجاجي للإشعاع.
    ملاحظة: الأجسام الشبه الكروية يمكن أن يتعرض لقوائم الجرد الوطنيةالضوء إما على المجهر أو في غطاء محرك السيارة الصفحي.
    1. قياس كثافة الطاقة من نير الضوء مع السلطة متر البصرية 9. ووفقا لهذا القياس، أشرق نير الضوء عبر الثنائيات الباعثة للضوء (المصابيح) والتي تنبعث منها الضوء بأطوال موجية من 670-710 نانومتر في 2 J / سم 2.
      ملاحظة: ضوء LED يمكن ان تخترق أقصى عمق حوالي 5 بوصات. الآثار السامة للخلايا من الجرد الوطني حفرة تعتمد فقط على الطاقة نظرا بغض النظر عن كثافة القوة ومدة التعرض 23.
  5. بعد التشعيع، ونقل كروي إلى قطرة شنقا لوحة جديدة مع 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة جديدة واحتضان لمدة 1 يوم في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
  6. نقل بلطف كروي على طبق القاع الزجاجي مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة جديدة (أحمر الفينول مجاني) باستخدام معقم 200 ميكرولتر ماصة مع طرف قطع. مراقبة كروي مع مضان المجهر 1 يوم بعد الجرد الوطني حفرة باستخدام فايإعدادات lter هو موضح في الخطوة 3.3.
    1. كشف الخلايا الميتة عن طريق إضافة يوديد propidium إلى وسائل الإعلام بتركيز نهائي من 2 ميكروغرام / مل، أو فقدان حشوية GFP مضان باستخدام المجهر مضان (الشكل 2B) 14،18،22.
  7. كرر الخطوات من 3.1-3.6 إذا لم يتم القضاء على الخلايا المستهدفة تماما.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لمراقبة بصريا تأثير الجرد الوطني حفرة، خط الخلية A431، التي overexpresses EGFR، والمعدلة وراثيا للتعبير أيضا GFP ووسيفيراز (A431-لوك-GFP). باعتباره غير المستهدفة من نير-حفرة، تم تعديل خط خلية BALB / 3T3 بصريا للتعبير عن طلب تقديم العروض (3T3-RFP). آسيا والمحيط الهادئ، panitumuma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ونحن لشرح طريقة القضاء على خلية معينة من ثقافة خلية 3D المختلطة دون تلف خلايا غير المستهدفة باستخدام الجرد الوطني حفرة. حتى الآن، ليس هناك طريقة عملية لإزالة الخلايا مرة واحدة يتم تأسيس الأنسجة أو بعد الزرع. وهكذا، الجرد الوطني PIT هو وسيلة واعدة لتحقيق ذلك. ويمكن أيضا ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث من قبل برنامج جماعية البحوث في المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
IRDye 700DX Ester Infrared DyeLI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011
Na2HPO4SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)S9763
Sephadex G25 column (PD-10) GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assayThermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)HDP1096-8
Optical power meterThorlabs (Newton, NJ, USA)PM100
LED: L690-66-60Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)L690-66-60
Vectibix (panitumumab)Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mmCellvis (Mountain View, CA, USA)D35-10-0-N

References

  1. Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
  2. Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
  3. Birchall, M. A., Seifalian, A. M. Tissue engineering's green shoots of disruptive innovation. Lancet. 6736 (14), 11-12 (2014).
  4. Ben-David, U., Benvenisty, N. The tumorigenicity of human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nat. Rev. Cancer. 11 (4), 268-277 (2011).
  5. Hanna, J. H., Saha, K., Jaenisch, R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues. Cell. 143 (4), 508-525 (2010).
  6. Lee, M. -O., Moon, S. H., et al. Inhibition of pluripotent stem cell-derived teratoma formation by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (35), 3281-3290 (2013).
  7. Miura, K., Okada, Y., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
  8. Tang, C., Lee, A. S., et al. An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells. Nat. Biotechnol. 29 (9), 829-834 (2011).
  9. Mitsunaga, M., Ogawa, M., Kosaka, N., Rosenblum, L. T., Choyke, P. L. Cancer cell - selective in vivo near infrared photoimmunotherapy targeting specific membrane molecules. Nat. Med. 17 (12), 1685-1691 (2011).
  10. Mitsunaga, M., Nakajima, T., Sano, K., Kramer-Marek, G., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Immediate in vivo target-specific cancer cell death after near infrared photoimmunotherapy. BMC Cancer. 12 (1), 345(2012).
  11. Nakajima, T., Sano, K., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Real-time monitoring of in vivo acute necrotic cancer cell death induced by near infrared photoimmunotherapy using fluorescence lifetime imaging. Cancer Res. 72 (18), 4622-4628 (2012).
  12. Sano, K., Mitsunaga, M., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Acute cytotoxic effects of photoimmunotherapy assessed by 18F-FDG PET. J. Nucl. Med. 54 (5), 770-775 (2013).
  13. Sato, K., Watanabe, R., et al. Photoimmunotherapy: Comparative effectiveness of two monoclonal antibodies targeting the epidermal growth factor receptor. Mol. Oncol. 8 (3), 620-632 (2014).
  14. Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases. Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).
  15. Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer. Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).
  16. Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model. PloS one. 9 (11), 113276(2014).
  17. Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience. Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).
  18. Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine. RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).
  19. Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies. J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).
  20. Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model. Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).
  21. Shirasu, N., Yamada, H. Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy. Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).
  22. Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model. Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).
  23. Nakajima, T., Sato, K., et al. The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity. BMC cancer. 14 (1), 389(2014).
  24. Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications. Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).
  25. Burmester, G. R., Feist, E., Dörner, T. Emerging cell and cytokine targets in rheumatoid arthritis. Nat. Rev. Rheumatol. 10 (2), 77-88 (2014).
  26. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

109 3D photoimmunotherapy

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved