La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Resumen

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Resumen

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introducción

La eliminación de células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en el tejido establecido, y hay una necesidad urgente de un método de eliminación de células en el campo de la ingeniería de tejidos. Hoy en día en el campo de la medicina regenerativa, cultivos de tejidos utilizando células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes (PSCs), o célula madre pluripotente inducida (iPS) son materiales prometedores ^{de 1 - 3.}

Aunque esta regeneración de tejidos es prometedor, la contaminación con células no deseadas es una preocupación importante. Por otra parte, hay un problema de seguridad de la tumorigenicidad después del trasplante ^4,5. Aunque muchos estudios se han centrado en estos temas para eliminar células específicas, sobre todo en la medicina regenerativa ^6-8, ningún método práctico se ha desarrollado.

photoimmunotherapy infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un tratamiento basado en un anticuerpo conjugat-fotoabsorbentee (APC). Una APC consiste en un anticuerpo específico de células monoclonal (mAb) y un fotoabsorbente, IR700. IR700 es un derivado de sílice-ftalocianina hidrofílica y no induce por sí mismo fototoxicidad ^9. IR700 está conjugado covalentemente al anticuerpo a través de los residuos de amida en la cadena lateral de moléculas de lisina. La APC se une moléculas diana en la membrana celular y luego se provoca necrosis celular casi inmediata después de la exposición a la luz NIR a 690 nm. Durante la exposición a la luz NIR, se rompe la membrana celular que conduce a la muerte ^{de 9} celdas ^{- 14.} NIR-PIT ha demostrado ser eficaz con múltiples anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, incluyendo anti-EGFR, anti-HER2, anti-PSMA, anti-CD25, anti-mesotelina, anti-GPC3, y anti-CEA ^15-21. Por lo tanto, NIR-PIT se puede utilizar contra una amplia variedad de moléculas diana. Por otra parte, NIR-PIT es un tratamiento bien controlado que permite el tratamiento selectivo de regiones específicas mediante la restricción de la NIR-light irradiación ^18,22.

A continuación, presentamos un método de eliminación de células específicas mediante NIR-PIT 3D a partir de cultivos mixtos.

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Protocolo

Nota: El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para eliminar las células específicas utilizando NIR-PIT. Controles y otros detalles acerca de NIR-PIT y la viabilidad celular se pueden encontrar en otro lugar ^18.

1. Conjugación del IR700 a anticuerpos monoclonales (mAb)

1. Preparar mAb de interés a 2-5 mg / ml en solución (pH 8,6) 0,1 M Na ₂ HPO _4.
2. Mezclar 6,8 nmol de mAb con 30,8 nmol de IR700 10 mM en M Na ₂ HPO ₄ solución 0,1 (pH 8,6) en un tubo de microcentrífuga y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr, cubierto con papel de aluminio.
3. Lavar la columna PD-10 (véase la Tabla de Materiales / Equipos) con 15 ml de PBS, dos veces. Cargar la muestra desde el paso 1.2.
4. Se purifica la mezcla a través de la columna de la PD-10 por PBS elución de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   Nota: En este caso, la elución fue a lo largo del color de la correa de IR700. Para una muestra de 300 l, fracción de elución de PBS es típicamente entre 2,5 ml a 4,4 ml.
5. Determina ella concentración de proteínas con la tinción de Coomassie mediante la medición de la absorción a 595 nm con un espectrofotómetro ^9. Determinar la concentración de IR700 con absorción a 689 nm para confirmar el número de moléculas de fluoróforo conjugados con cada molécula de mAb ^9.
   Nota: Es importante determinar un número óptimo de conjugación de moléculas IR700 en 1 mAb con un espectrofotómetro. Generalmente, alrededor de 3 moléculas IR700 en 1 molécula de mAb es óptimo para tanto in vitro como in vivo en el trabajo. métodos de HPLC y SDS-PAGE se pueden utilizar para confirmar si el MAB y IR700 están obligados o no.
6. Almacenar a 4 ° C después de la determinación de la concentración de proteína.

2. Preparación de Mixta cultivo celular 3D (Mixed esferoide)

1. Aplicar agua estéril (alrededor de 1 ml) a la sección de depósito de la placa de colgar placas de caída.
2. Preparar diversas proporciones de los tipos de células de interés - células A431-luc-GFP y células 3T3-RFP -con cada muestra que contiene 5.000 células totales, en suspensión en 50 l de medio de cultivo.
   Nota: Preparar 1: 100, 10: 100, 25: 100, 50: 100, etc. proporciones de tipos de células de interés en los medios de cultivo en función del tipo de célula.
3. Incubar la mezcla durante 5-7 días en el pozo colgar la placa de caída 96 en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono. Cambiar los medios de cultivo cada 2 días. Nota: Para que el esferoide 3D, precisamente, manejar suavemente la placa, en forma de gotas que contienen las células se caen fácilmente antes de la formación de formas 3D.
4. Observar la morfología y el tamaño de los esferoides utilizando un microscopio de campo claro invertida en 10X - 40X aumentos. Nota: Aunque depende de los tipos de células y el tamaño de gota colgante, asegurarse de que el diámetro del esferoide es de alrededor de 400 a 600 micras después de 7 días de incubación en el 96 así colgar la placa de caída.

3. En Vitro NIR-PIT para el cultivo celular mixto 3D

1. Cambiar el soporte de la HAnging placas gota a 10 g / ml conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (APC) medios que contienen, y se incuba durante 6 horas en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono.
2. Después de 6 horas de incubación, lavar el esferoide dos veces con medio de cultivo fresco (sin rojo fenol). transferir suavemente el esferoide a un plato con fondo de vidrio de 50 mm con 100 l de fenol fresco medio de cultivo libre de rojo utilizando una punta de pipeta de 200 l estéril con la punta cortada. Coloque un esferoide en cada plato.
3. Observe el esferoide con un microscopio de campo claro invertida para detectar el cambio de la morfología. Para observar los reporteros ópticos (por ejemplo, GFP y RFP) utiliza el microscopio de fluorescencia con los siguientes ajustes de filtro: GFP - filtro de excitación de 469 nm y de emisión de 525 nm; RFP - 559 nm filtro de excitación y 630 nm de emisión filtro.
4. Coloque el diodo emisor de luz (LED) por encima del plato con fondo de cristal para la irradiación.
   Nota: Los esferoides pueden estar expuestos a NIRla luz ya sea en el microscopio o en la campana laminar.
   1. Medir la densidad de potencia de la luz NIR con un medidor de potencia óptica ^9. De acuerdo con esta medida, irradiar luz NIR a través de diodos emisores de luz (LED) que emiten luz en longitudes de onda de 670 a 710 nm a 2 J / ^cm2.
      Nota: La luz del LED puede penetrar en la profundidad máxima de aproximadamente 5 pulgadas. Los efectos citotóxicos de NIR-PIT sólo depende de energía dada, independientemente de la densidad de potencia y duración de la exposición ^23.
5. Después de la irradiación, la transferencia de la esferoide en una nueva placa de gota colgante con 50 l de medio de cultivo fresco y se incuba durante 1 día en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono.
6. transferir suavemente el esferoide a un plato con fondo de vidrio con 100 l de medio de cultivo fresco (sin rojo fenol) usando una punta de pipeta de 200 l estéril con la punta cortada. Observar el esferoide con un microscopio de fluorescencia después de 1 día NIR-PIT usando filtro ajustes descritos en el paso 3.3.
   1. Detectar las células muertas mediante la adición de yoduro de propidio a los medios a una concentración final de 2 mg / ml, o por la pérdida de GFP-citoplasmática de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 2B) ^14,18,22.
7. Repita los pasos 3.1-3.6 si las células diana no se eliminan por completo.

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Resultados

Para monitorizar ópticamente el efecto de NIR-PIT, la línea celular A431, que sobreexpresa el EGFR, fue modificado genéticamente para expresar también GFP y luciferasa (luc-A431-GFP). Como que no son objeto de NIR-PIT, la línea de células Balb / 3T3 se modificó para expresar ópticamente RFP (3T3-RFP). La APC, panitumumab-IR700 (pan-IR700), se sintetizó. Esferoides mixtos, que se componen de diversas relaciones de células (A431-luc-GFP y 3T3-RFP) se fabricaron de acuerdo con est...

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Discusión

Se demuestra un método de eliminación de células específica de un cultivo celular mixto 3D sin daño a las células no diana mediante el uso de NIR-PIT. Hasta ahora, no hay ningún método práctico de eliminación de células una vez establecido el tejido o después del trasplante. Por lo tanto, NIR-PIT es un método prometedor para lograr esto. Esta técnica podría utilizarse también in vivo ^18,22, ya que las CPA muestran una farmacocinética similar a sí mismo mAb. El tipo...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N