근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

요약

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

초록

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

서문

다른 세포에 손상을주지 않고 특정 세포를 제거하는 것은 특히 설립 조직에서는 매우 곤란하며, 조직 공학 분야에서 세포 제거 방법이 절실히 요구되고있다. ^{3 -} 현재 재생 의학 분야에서, 배아 줄기 세포 (ES), 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPS)를 이용하여 조직 배양 유망한 재료 ^1이다.

이러한 조직 재생 유망하지만, 원치 않는 세포 오염의 주요 관심사이다. 또한, 이식 ^4,5 후 종양 유발의 안전 우려가있다. 많은 연구는 이러한 문제에 집중하고 있지만, 특히 재생 의료 ^6, 특정 세포를 제거 ^{- (8)} 실제적인 방법이 개발되지 않았다.

근적외선 photoimmunotherapy (NIR-PIT)는 항체 - photoabsorber의 conjugat에 따라 치료E (APC). APC는 세포 특이 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 photoabsorber, IR700로 구성되어 있습니다. IR700은 친수성 실리카 - 프탈로시아닌 유도체이며, 자체 ⁹ 광독성을 유발하지 않습니다. IR700는 공유 라이신 분자의 측쇄상의 아미드 잔기를 통해 항체에 접합된다. APC는 세포막을 표적 분자에 결합하고 690 nm에서 NIR 광에 노출 후 거의 즉각적으로 세포 괴사를 유도한다. ^{14 -} NIR 광, 세포 사멸 ^(9)에 이르는 세포 멤브레인 파열로 노광시. ^{21 -} NIR-PIT는 항 EGFR, 항 HER2, PSMA 방지, 항 CD25, 항 mesothelin, 항 GPC3 및 안티 CEA ^(15)를 포함한 다수의 항체 또는 항체 단편으로 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, NIR-PIT는 표적 분자의 다양한 대해 사용될 수있다. 또한, NIR-PIT은 NIR-조명 관리를 제한하여 특정 지역의 선택적 치료를 할 수있는 잘 조절 치료입니다t 조사 ^{18, 22.}

여기서는 3D 혼합 배양에서 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 방법을 제시한다.

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프로토콜

참고 : 다음 프로토콜은 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 컨트롤 및 NIR-PIT 및 세포 생존에 대한 기타 세부 사항은 다른 곳에서 ¹⁸ 찾을 수 있습니다.

단일 클론 항체에 IR700 1. 활용 (단클론 항체)

1. 2-5 밀리그램 / 0.1 M 나 ₂ HPO ₄ (PH 8.6) 용액 ㎖의이자의 단클론 항체를 준비합니다.
2. microcentrifuge 관에 0.1 M 나 ₂ HPO ₄ 용액 (PH 8.6)에 10 mM의 IR700의 30.8 nmol의와 단클론 항체의 6.8 nmol의 혼합과 알루미늄 호일로 덮여 1 시간, 실온에서 품어.
3. 두 번, 15 ml의 PBS와 PD-10 컬럼 (자재 / 장비의 표 참조) 씻으십시오. 단계 1.2에서 샘플을로드합니다.
4. 제조업체의 지시에 따라 PBS 용출하여 PD-10 컬럼을 통해 정제하여 혼합물.
   참고 : 여기에, 용출 IR700의 밴드 색깔을 따라했다. 300 ㎕의 샘플의 경우, PBS 용출 분획을 4.4 ml를 전형적으로 2.5 ㎖의 사이이다.
5. 결정분광 광도계 ⁽⁹⁾ 595 nm에서 흡광도를 측정하여 쿠마시 염색으로 단백질 농도. 각각의 단클론 항체 분자에 접합 ^구 형광 분자의 수를 확인하는 689 nm에서의 흡수율 IR700의 농도를 결정한다.
   주 : 분광 한 단클론 항체에 IR700 분자 최적 접합 수를 결정하는 것이 중요하다. 일반적으로, 1 단클론 항체 분자의 3 주위 IR700 분자는 모두 생체 외 및 생체 작업에 최적입니다. HPLC 및 SDS-PAGE 방법은 단클론 항체 및 IR700가 결합 여부를 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
6. 단백질 농도를 측정 한 후 4 ℃에서 보관하십시오.

혼합 된 3 차원 세포 배양 2. 준비 (회전 타원체 혼합)

1. 드롭 플레이트 매달려의 판 저수지 섹션에 멸균 수 (약 1 ml)에 적용합니다.
2. A431-루크-GFP 세포와 3T3-RFP 세포 - 다양한 관심의 세포 유형의 비율을 준비 -배지를 50 μL에 현탁 총 5000 세포를 포함하는 각 샘플.
   참고 : 문화 미디어에 대한 관심의 세포 유형의 비율이 세포 유형에 따라 등 100, 100, 10 : 100, 25 : 100, 50 (1)을 준비합니다.
3. 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 96 웰 플레이트에 매달려 드롭 5-7 일간 인큐베이션 믹스. 매 2 일 문화 매체를 변경합니다. 참고 : 세포를 포함하는 상품으로, 3D 정밀하게 회전 타원체 수 있도록 부드럽게 판을 처리하기 위해 3 차원 형상을 형성하기 전에 쉽게 떨어져.
4. 40X 배율 - 10 배에서 반전 시야 현미경을 사용하여 회전 타원체의 형태와 크기를 관찰한다. 참고 : 세포 유형과 매달려 드롭의 크기에 따라 다르지만, 구형의 직경도 감소 플레이트 매달려 96 7 일간 배양 한 후, 약 400 내지 600 ㎛의 것을 보장한다.

혼합 된 3 차원 세포 배양을위한 체외 NIR-PIT 3.

1. 헥타르의 미디어 변경10 μg의 / ㎖ 항체 photoabsorber 복합체 (APC)를 포함하는 미디어 드롭 플레이트 플 레이어, 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 6 시간 동안 배양한다.
2. 6 시간 배양 한 후, 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료)로 두 번 회전 타원체를 씻는다. 끝이 절단 부드럽게 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 100 ㎕의 신선한 페놀 레드 무료 문화 매체와 유리 바닥 50mm 접시에 회전 타원체를 전송합니다. 각각의 접시에 한 회전 타원체를 놓습니다.
3. 형태의 변화를 검출하는 반전 시야 현미경 타원체를 관찰한다. 다음 필터 설정을 형광 현미경을 사용하여 광 기자 (예 : GFP 및 RFP)를 관찰 : GFP - 469 nm의 여기 필터, 525 nm의 방출 필터; RFP - 559 nm의 여기 필터, 630 nm의 방출 필터.
4. 사출 용 유리 - 바닥 접시 위에 발광 다이오드 (LED)를 배치했다.
   주 : 타원체는 NIR에 노출 될 수있다현미경 또는 층류 후드에 하나 켜집니다.
   1. 광 파워 미터 ⁽⁹⁾ 근적외선 광의 파워 밀도를 측정한다. 본 측정에 따르면, 2 J / cm ^2에서의 670 내지 710의 파장에서 광을 방출하는 발광 다이오드 (LED)를 통해 근적외선 광을 조사한다.
      참고 : LED 조명은 약 5 인치 최대 깊이 침투 할 수 있습니다. NIR-PIT의 세포 독성 효과에 관계없이 전력 밀도와 노출 ²³ 시간 만 주어진 에너지에 의존한다.
5. 조사 후, 신선한 배지를 50 μL로 새로운 매달아 놓기 플레이트에 회전 타원체를 전송하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 하루 동안 배양한다.
6. 조심스럽게 잘라 끝 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료) 100 ㎕와 유리 바닥 접시에 회전 타원체를 전송합니다. NIR-PIT 사용 Fi를 한 후 형광 현미경 일일으로 회전 타원체를 관찰LTER 설정 단계 3.3에 기재된.
   1. 또는 형광 현미경 (도 ^2B)를 이용하여 세포질 ^14,18,22 GFP 형광의 감소에 의해 2 μg / ML의 최종 농도에서 미디어 프로피 듐 요오다 이드를 첨가함으로써 사균을 검출한다.
7. 표적 세포가 완전히 제거되지 않은 경우 반복 3.1-3.6 단계를 반복합니다.

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결과

광학 EGFR 과발현 NIR-PIT, A431 세포주의 효과를 모니터링하기 위해 유전자 또한 GFP와 루시 페라 제 (A431 뤽-GFP)을 표현하기 위해 수정되었습니다. NIR-PIT의 비 표적으로의 Balb / 3T3 세포주 광학적 RFP (3T3-RFP)를 표현하기 위해 변경되었다. APC, panitumumab-IR700 (팬-IR700)를 합성 하였다. 세포 (A431 뤽-GFP 및 3T3-RFP)의 다양한 비율로 구성 된 혼합 타원체는이 프로토콜 (그림 1)에

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토론

우리는 NIR-PIT를 사용하여 비 - 표적 세포의 손상없이 혼합 3D 세포 배양으로부터 특정 세포를 제거하는 방법을 보여준다. 지금까지 실제적인 세포 제거 방법 조직이 설립되면 또는 이식 후가 없습니다. 따라서, NIR-PIT이 작업을 수행 할 수있는 유망한 방법이다. 장갑차는 단클론 항체 자체와 유사한 약물 동태를 보여 때문에이 기술은도 ^{18, 22} 생체 내에서 이용 될 수있다. 표적 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N