从混合三维培养使用近红外Photoimmunotherapy技术选择性细胞消除

摘要

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

摘要

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

引言

消除特定细胞而不损害其他细胞是非常困难的，特别是在建立组织，并且存在用于在组织工程领域中的细胞消除方法的迫切需要。现今在再生医学领域中，使用胚胎干细胞（ES），多能干细胞（的PSCs），或诱导的多能干细胞（IPS）的组织培养物是有前途的材料^{1 - 3。}

虽然这个组织再生是有前途的，具有不需要的细胞污染是一个大问题。此外，有移植^4,5-之后致瘤性的安全问题。虽然许多研究都集中在这些问题上，以消除特定细胞，尤其是在再生医学^{6 - 8，}没有实际的方法已被开发出来。

近红外photoimmunotherapy（NIR-PIT）是一种基于抗体 - 光吸收剂conjugat的处理E（APC）。一个APC由细胞特异性单克隆抗体（mAb）和光吸收剂，IR700的。 IR700是亲水性二氧化硅的酞菁衍生物和本身并不⁹诱发光毒性。 IR700是通过赖氨酸分子的侧链酰胺残基共价结合到抗体上。 APC的结合细胞膜上的靶分子，然后诱导暴露于NIR光在690纳米的近后立即细胞坏死。在暴露于近红外光，细胞膜破裂，导致细胞死亡^{9 - 14。} NIR-PIT已被证明是具有多个抗体或抗体片段，其中包括抗EGFR，抗HER2，抗PSMA，抗CD25，抗间皮素，抗GPC3，和抗CEA ¹⁵有效^{- 21。}因此，近红外PIT可对多种靶分子使用。此外，近红外PIT是良好控制的治疗，通过限制近红外二极管灯允许特定区域的选择性治疗ŧ照射^18,22。

这里，我们目前采用NIR-PIT从混合3D文化特异性细胞清除的方法。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

注意:以下协议描述必要的步骤来消除使用NIR-PIT特定细胞。控制和有关NIR-PIT和细胞活力等细节可以在其他地方¹⁸中找到。

1.共轭IR700，以单克隆抗体（MAB）

1. 在2-5毫克/毫升的0.1M _的 Na ₂ HPO _4（pH为8.6）的溶液制备的兴趣的mAb。
2. 混合mAb的6.8纳摩尔用10mM IR700 30.8纳摩尔在0.1M _的 Na ₂ HPO ₄在微量离心管中液（pH 8.6），并在室温孵育1小时，用铝箔覆盖。
3. 用15ml的PBS洗涤PD-10柱（参见材料/设备的数据表），两次。从步骤1.2装载样品。
4. 根据制造商的说明通过PBS洗脱纯化经由PD-10柱的混合物。
   注:在这里，洗脱沿IR700的带颜色。对于300微升样品，PBS洗脱分数毫升〜4.4毫升通常为2.5之间。
5. 确定蛋白质浓度用考马斯染色，通过测量在595nm处的吸收用分光光度计^9。确定IR700与吸收的浓度在689纳米到确认缀合每种mAb分子⁹荧光团分子的数目。
   注意:确定在1单抗IR700分子的最佳偶联次数用分光光度计是很重要的。通常，在1单抗分子约3 IR700分子是最适用于在体外和体内的工作。 HPLC和SDS-PAGE方法可以用于确认单抗和IR700是否可能会或没有。
6. 测定蛋白质浓度后储存于4℃。

2.准备混合3D细胞培养（混合球体）

1. 应用无菌水（约1ml）中成悬滴板的板储部分。
2. 制备的细胞类型的利益的各种比例 - A431-LUC-GFP细胞和3T3-RFP细胞 -用含有5,000个细胞总数，悬浮于50μl培养基的每一个样品。
   注意:根据细胞类型的培养基中的细胞类型的兴趣的比率100 等 :准备1:100，10:100; 25:100，50。
3. 在37℃和5％二氧化碳孵育在96孔悬滴板5-7天的混合物在加湿培养箱中。改变培养基，每2天。注:为了使3D球体准确，轻拿轻放盘，如含有细胞滴形成3D形状之前，容易脱落。
4. 40X放大率 - 使用倒置亮视野显微镜在10倍观察球体的形态和尺寸。注意:尽管这取决于细胞类型和悬滴的大小，确保该球体的直径后，在96孵育7天后的孔悬滴板周围400-600微米。

3. 在体外 NIR-PIT混合3D细胞培养

1. 更改HA媒体nging滴板，以10微克/毫升抗体 - 光吸收剂结合物（APC）含有介质，并且在37℃和5％二氧化碳的潮湿培养箱孵育6小时。
2. 后6小时温育后，用新鲜的培养基（无酚红）洗球体的两倍。轻轻球体用100微升新鲜无酚红培养基用无菌200微升枪头，转移到玻璃底50毫米菜尖切断。放在每道菜1球体。
3. 观察球体用倒置明显微镜检测形态的变化。观察光学记者（如 GFP和RFP）使用具有以下过滤器设置荧光显微镜:GFP - 469 nm激发过滤器和525 nm发射滤波器; RFP - 559 nm的激发滤光片和630nm的发射滤光器。
4. 放置照射玻璃底培养皿上方的发光二极管（LED）。
   注:球体​​可以接触到近红外光无论是在显微镜或在层流罩。
   1. 测量近红外光的功率密度与光功率计^9。根据该测定，通过发光二极管（LED），其在在2J / cm ²的670至710纳米的波长的发射光照射近红外光。
      注:LED灯可以穿透大约5英寸最大深度。不管功率密度和曝光²³的持续时间的近红外PIT的细胞毒性作用是只依赖于给定的能量。
5. 照射后，转移球体到一个新的悬滴板用50μl新鲜培养基，并在37℃和5％二氧化碳的潮湿培养箱孵育1天。
6. 轻轻球体用100微升使用带切断尖端无菌200微升枪头，新鲜培养基（无酚红）的转移到玻璃底菜。观察与NIR-PIT使用网络连接后，荧光显微镜1天球体在步骤3.3说明过滤器设置。
   1. 通过，或通过使用荧光显微镜（ 图^{2B）14,18,22}细胞质的GFP荧光的损失以2微克/毫升的最终浓度加入碘化丙啶至媒体检测死细胞。
7. 如果靶细胞没有完全消除重复步骤3.1-3.6。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

以光学监控NIR-PIT中，A431细胞系，其过表达EGFR的效果，被遗传修饰以也表达GFP和荧光素酶（A431-LUC-GFP）。作为近红外PIT的一个非目标，所述的Balb / 3T3细胞系的光学修饰以表达RFP（3T3-RFP）。 APC的，帕尼单抗-IR700（泛IR700），合成。混合球状体，其中分别组成细胞（A431-LUC-GFP和3T3-RFP）的各种比例的是按照此协议（ 图1）制成。反复NIR-PIT与泛IR700（参见图2A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

我们证明特定细胞消除从混合三维细胞培养物的方法，而不使用近红外-PIT损害对非靶细胞。到目前为止，存在一旦组织被建立或细胞消除无实际方法移植后。因此，NIR-PIT是实现这个很有前途的方法。这种技术也可在体内 ^18,22利用，因为的APCs显示出类似的药代动力学为单克隆抗体本身。靶细胞类型可适于与各种的APC。各种抗体或抗体片段，其中包括抗EGFR，抗PSMA，抗间皮素和...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35 mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 10 mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N