الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

Summary

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Abstract

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Introduction

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

Protocol

بيان من أخلاقيات البحث: جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات بالتفصيل هنا ويخضع للقواعد والأنظمة المعمول بها في لجنة قيادة الأمم المتحدة في رعاية الحيوان ومعايير المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام حيوانات المختبر.

1. إعداد وطلاء من فصل العصبونات القشرية

1. الموت ببطء توقيت الحامل الإناث من CO ₂ استنشاق تليها خلع عنق الرحم. إزالة العقول كلها من جماجم الجنينية يوم 15.5 (E15.5) الفئران وmicrodissect القشور من كل نصف الكرة الغربي. للحصول على إرشادات مفصلة عن تسليخ مجهري من القشرة الماوس الجنينية يرجى الاطلاع Viesselmann آخرون ^8.
2. وضع لا يزيد عن 4 القشور في 1 مل من وسائل الاعلام تشريح في معقم 1.6 مل microtube. إضافة 120 ميكرولتر من 10X التربسين وعكس الأنبوب 3-5 مرات لخلط.
3. باستخدام عدادة الكريات، عد الخلايا البذور أطباق زراعة الخلايا. ملاحظة: توفر 1 نصف الكرة القشرية approximately ثلاثة ملايين الخلايا.
   1. لمقاومة للSDS كمين فحص الكيمياء الحيوية المعقدة، لوحة ستة ملايين الخلايا في 35 طبق مم والاستفادة من طبقين لكل حالة. ملاحظة: يتم تبسيط هذه باستخدام 6 لوحات جيدا عند مقارنة شروط متعددة.
   2. لفحوصات المتفرعة، تغسل الخلايا العصبية لوحة على حمض النيتريك coverslips دائرية في مناطق ذات كثافة من 250000 خلية لكل 35 مم طبق، لمدينة دبي للإنترنت التصوير من محور عصبي المتفرعة لوحة في مناطق ذات كثافة من 150،000. هذه الكثافة تجنب الاكتظاظ وتبسيط التحليل.
4. ليعيش المجهر خلية TIRF، و resuspend مليوني الخلايا العصبية في ترنسفكأيشن في nucleofection حل في RT.
   1. إضافة 100 ميكرولتر من خلية إلى تعليق microtube تحتوي على 10 ميكروغرام من VAMP2-pHlourin التعبير البلازميد وelectroporate مع nucleofector وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ^9.
   2. بعد تعداء إضافة على الفور 500 ميكرولتر من التربسين التبريد وسائل الإعلام، وإزالة تعليق من خلايا كفيت ولوحة في دنSITY من 400000 خلية لكل 35 مم الزجاج المطلي PDL طبق السفلي.
5. لوحة جميع الخلايا العصبية القشرية في 2 مل من الإعلام الحر في الدم.

2. كمين تشكيل مجمع الفحص

ملاحظة: تم تجهيز المجمعات كمين المقاومة للSDS وتحليلها كما هو موضح في الأصل ¹⁰ مع التعديلات المفصلة أدناه. عن الأجسام المضادة بديلة التحقق من صحة لتلك المستخدمة هنا، راجع قسم المواد.

1. تحفيز الخلايا العصبية القشرية E15.5 2 أيام في المختبر (DIV) مع 250 نانوغرام مل netrin-1 أو صورية التحكم / لمدة 1 ساعة قبل تحلل.
2. قبل تجهيز العينات، الطرد المركزي بارد إلى 4 درجات مئوية، وضبط درجة الحرارة حمام الماء إلى 37 درجة مئوية، وكتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
3. إزالة الأطباق خلية من الحاضنة ومكان على الجليد.
   1. وسائل الإعلام نضح من الخلايا، تحل محل مع ~ 2 مل الجليد الفوسفات الباردة مخزنة المالحة (PBS) بلطف 2 مرات عن 1-2 دقائق لكل يغسل.
   2. لهذا الاختبار، استخدام 2 آبار في كوندition.
   3. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر الأول من شرط واستبدالها مع 250 العازلة التجانس ميكرولتر. ترك على الجليد لمدة 5 دقائق، ثم باستخدام رافع الخلية، والتجانس الخلايا على الجليد.
   4. نضح في برنامج تلفزيوني من البئر المقبل للحالة نفسها وإضافة الخليط المتجانس في الآونة الأخيرة إلى البئر. سيؤدي هذا إلى زيادة تركيزات البروتين. أكرر لجميع الظروف.
   5. عند الانتهاء، ماصة يتجانس الخليط حل لتبرد قبل 1.6 مل microtube على الجليد وإضافة 20٪ TritonX-100 من أجل التوصل إلى تركيز النهائي من 1٪ TritonX-100. يسحن خلط 10 مرات مع 1000 ميكرولتر ماصة مع التقليل من الفقاعات.
4. احتضان أنابيب على الجليد لمدة 2 دقيقة لإذابة البروتينات. بعد الحضانة، الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 6010 إطار التعاون الإقليمي في 4 درجات مئوية لتكوير المواد غير بالفاعلات. نقل طاف المحللة في المبرد أنبوب 1.6 مل جديد على الجليد.
5. لتحليل تركيز البروتين باستخدام برادفورد فحص ¹¹ وتمييع عينات إلى الاتحاد الدولي للسباحةلتر تركيز البروتين من 3-5 ملغ / مل مع العازلة التجانس تستكمل مع 1٪ TritonX-100 وعينة العازلة 5X تستكمل مع B-Mercaptethanol (BME) المتبقية.
6. تقسيم كل عينة تجريبية بالتساوي في 2 الأنابيب. احتضان عينة واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (المجمعات الفخ)، والآخر في 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (أحادية الفخ). عكس الأنابيب بشكل متقطع للحفاظ على عينات في الحل.
7. تجميد العينات عند -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة لفصل عبر SDS-PAGE. قبل تشغيل عينات عن طريق الكهربائي باستخدام تقنيات القياسية، reboil عينات المغلي سابقا لمدة 5 دقائق في 100 درجة مئوية، ولكن ذوبان الجليد 37 ° C عينات في RT.
8. التكرارات تشغيل العينات (30 - 40 ميكروغرام من البروتين لكل عينة) على كل من 8٪ ومادة هلامية بنسبة 15٪. توفر 8٪ الفصل المثالي للمجمع، في حين يتم استخدام 15٪ لتحديد أحادية البروتين الفخ (SNAP-25 ~ 25kDa، VAMP2 ~ 18kDa، syntaxin-1 ~ 35kDa). الحفاظ على مصدر الطاقة في 70 V حتى خط صبغ هو من خلال STACالملك جل وزيادة الجهد 90V. تشغيل المواد الهلامية حتى يعمل صبغ خارج.
9. للحفاظ على أحادية، ونقل البروتينات إلى 0.2 ميكرومتر غشاء النيتروسليلوز على الجليد باستخدام عازلة نقل البارد مع 20٪ ميثانول (MeOH) وأضاف، في 70 V لمدة 45 دقيقة.
10. غشاء الجافة في طبق مغطى لمدة 2 ساعة إلى O / N في RT (O / N يوفر أفضل النتائج).
11. كتلة كمين الأغشية المعقدة في 10٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) لمدة 1 ساعة على RT.
12. إعداد الأجسام المضادة الأولية (الاعتراف مكونات محددة كمين مجمع) في التخفيف من 1: 1000 والتحقيق O / N عند 4 درجات مئوية على شاكر دوارة.
    1. شطف البقع في تريس مخزنة المالحة بالإضافة إلى 0.1٪ توين 20 (TBS-T) 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
13. إعداد حلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في التخفيف من 1: 20،000 في 1٪ BSA في TBS-T والتحقيق لمدة 1 ساعة، وغطت في RT. كرر 2.12.1 الخطوة بعد 1 ساعة.
14. البقع الصورة على جهاز المسح الفلورسنت مجهزة برمجيات وتحديد كل من شارك البروتين الفخmplex (عصابات مناعيا فوق 40kDa) وشرائح مونومر (عصابات مناعيا في 25 كيلو دالتون، 18 كيلو دالتون، 35 كيلو دالتون لSNAP-25، VAMP2 وsyntaxin-1، على التوالي) باستخدام تعليمات الشركة الصانعة لرسم رويس مستطيلة.

3. التصوير Exocytic الأحداث عبر TIRF المجهري

ملاحظة: هذا البروتوكول يتطلب معدات المجهر المتخصصة بما في ذلك غرفة البيئية للحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون _2، مجهر TIRF المقلوب مجهزة الإضاءة epifluorescent، وارتفاع التكبير / ارتفاع الفتحة العددية (NA) هدف TIRF، مرحلة XYZ الآلي، و حساس تهمة جانب جهاز (CCD) كاشف. يستخدم هذا البروتوكول المجهر المقلوب مؤتمتة بالكامل مجهزة 100X 1.49NA TIRF الموضوعي الحالة الصلبة 491 نانومتر ليزر والكترون ضرب اتفاقية مكافحة التصحر (EM-CCD). ويسيطر على كل المعدات من قبل التصوير والمراقبة ليزر البرمجيات. قبل بداية قوة بروتوكول التصوير على عضو هيئة الجائزة مديرonmental غرفة، المرحلة، مصباح، والكمبيوتر، وكاميرا.

1. حدد الهدف في برامج التصوير. وبمجرد أن الهدف من ذلك هو في مكان، وربط سخان موضوعية حول العنق.
2. تأكيد يخفض هذا الهدف تماما قبل تأمين حاضنة مرحلة في فتحة المرحلة. صب الماء المقطر في مداخل مرحلة حاضنة بالتساوي لمنع التسرب.
3. تشغيل نظام الحضانة. فتح صمام خزان CO ₂ والتأكد من الضغط المناسب لنظام فقا لتعليمات الشركة الصانعة. السماح للغرفة بعض الوقت ليصل إلى 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية. قبل إضافة الطبق التصوير، ووضع صحن فارغ في الحاضنة لتجنب تكثيف الماء على الهدف.
4. الطاقة على مصدر الليزر.
5. فتح حاضنة المرحلة، وإضافة زيت الغمر للعدسة. وضع العينة في الحاضنة واستقرار مع الأسلحة الاستقرار أو وزن الطبق. رفع الهدف حتى يجعل النفط اتصال مع الجزء السفلي من العينة. Switcساعة إلى الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق والعثور على طائرة الوصل العصبية من خلال oculars.
6. بدء برنامج الليزر والاتصال إلى برنامج حاسوبي لمراقبة الليزر. تعيين الإضاءة إلى widefield وتحديد الهدف تستخدم (ينصح 100X 1.49 NA TIRF). تعيين معامل الانكسار من العينة (خلايا ~ 1.38). ضبط كثافة الليزر عن طريق إلغاء "TTL" ليزر 491 نانومتر. ضبط شريط التمرير إلى 100 ثم جعله يتراجع إلى قيمة تتراوح بين 20 - 40٪. إعادة فحص "TTL".
7. التركيز على عينة مرة أخرى في الإضاءة الخفيفة التي تنتقل عن طريق. الذهاب إلى برامج التصوير واختيار إضاءة ليزر 491 نانومتر، ومصراع مفتوحة. غرامة ضبط بؤرة ليزر على السقف ومركز نقطة إلى مركز الحجاب الحاجز الحقل مغلقة مع المكثف إزالتها. وضع مكثف رأسا على عقب على مقاعد البدلاء البصرية، حتى لا عدسة الصفر.
8. استبدال المكثف والذهاب إلى البرنامج TIRF وتحديد عمق الاختراق (PD) إلى 110 نانومتر. التحول من الإضاءة widefield إلى ILLUM TIRFوضع ination للتصوير.
9. البحث VAMP2-phluorin معربا عن الخلايا خلال oculars باستخدام epifluorescence widefield مع مصدر الضوء epifluorescent.
   1. ضبط المعلمات التصوير (زمن التعرض، وزيادة وقوة الليزر) لتعظيم إشارة إلى نسبة الضوضاء والنطاق الديناميكي باستخدام وقت التعرض الحد الأدنى من وحدة ليزر للحد من photobleaching من والضيائية (على سبيل المثال: التعرض بين 50-100 ميللي ثانية، مع 15-30 الحصول على 30٪ أقصى قوة الليزر).
   2. تعيين أوتوفوكس المستمر لكل خلية. الحصول على صورة لقطات متتابعة مع مجموعة اكتساب يحدث كل 0.5 ثانية لمدة 5 دقائق. للشرط netrin-1 حفز، إضافة 500 نانوغرام netrin-1 / مل على طبق من الخلايا في غطاء تدفق الصفحي وإعادة الإناء إلى الحاضنة لمدة 1 ساعة قبل التصوير.
10. لتحديد وتيرة الأحداث exocytic تطبيع في مجال الخلايا والوقت، وفتح مداخن صورة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل0؛ 2A أقحم 1).
    1. لإزالة إشارات فلوري المستقرة التي لا تمثل الأحداث حويصلة الانصهار، إنشاء متوسط ​​ض الإسقاط من كومة بأكمله باستخدام صورة> المكدس> Z-مشروع> نوع الإسقاط: متوسط ​​الكثافة. طرح هذا يعني صورة من كل صورة في لقطات متتابعة باستخدام عملية> صورة حاسبة> Image1 و: عملية الكدسة: طرح Image2 تم إنشاؤها حديثا متوسط ​​ض الإسقاط. وهذا يؤكد الأحداث exocytic (الشكل 2A أقحم 2-3).
    2. عدد الأحداث الانصهار exocytic بالعين. يتم تعريف الأحداث Exocytic مثل ظهور إشارة مضان محدودة الحيود، الذي ينشر بسرعة كما ينشر VAMP2-phluorin داخل غشاء البلازما (الشكل 2A أقحم 6).
    3. استخدام الأمر عتبة لتسليط الضوء على الصورة الأولى باستخدام صورة> ضبط> العتبة> ضبط المنزلق حتى الخلية كلها أبرزت عتبة (الشكل 2A أقحم 7-8).
    4. تحت آناينحل، اختر SetMeasurements وتحقق من المنطقة والتسمية العرض. حدد منطقة الخلوية thresholded باستخدام أداة العصا تتبع واضغط على "م" لقياس (الشكل 2A أقحم 7-8).
    5. نقل كل من أحداث الانصهار exocytic الفرز، القياسات مساحة الخلية، ووقت التصوير المنقضي إلى جدول بيانات لحساب عدد من exocytic الأحداث / مم ² / الساعة (الشكل 2A أقحم 9).

4. التفاضلية التدخل التباين (DIC) لقطات متتابعة المجهر من أكسون التشعب

ملاحظة: بروتوكول كامل ومظاهرة للنهج عام لتصوير مدينة دبي للإنترنت متاح ^12. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم مدينة دبي للإنترنت، ويمكن استخدام أساليب المجهر الخفيفة التي تنتقل عن طريق أخرى لنفس الأغراض (على سبيل المثال: النقيض من المرحلة).

1. في 2 DIV، مكان الزجاج طبق التصوير السفلي تحتوي على الخلايا العصبية untransfected في غرفة البيئية قبل تحسنت للحفاظ على الحياة الفطرية الرطبةironment مع 5٪ CO ₂ و 37 درجة مئوية. استخدام المجهر مجهزة 60X خطة-امزيغ، 1.4 NA مدينة دبي للإنترنت عدسة موضوعية وارتفاع المكثف NA حصول على أفضل جودة الصورة والقرار.
2. ضبط البؤري للعثور على الخلايا العصبية من خلال oculars باستخدام تنتقل الإضاءة الخفيفة.
3. باستخدام وظيفة اكتساب منطقة متعددة في برامج التصوير، والعثور على وحفظ المواقع XYZ لا يقل عن 6 خلايا. ضع مرحلة بحيث الخلايا العصبية من صالح المصالح داخل مجال الرؤية حصول على أفضل النتائج.
   1. حفز مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 ثم اضغط على "بدء اكتساب منطقة متعددة. بالتتابع الحصول على صور في كل موقف كل 20 ثانية لمدة 24 ساعة، والتوقف الاستحواذ وإعادة تركيز عند الضرورة.
4. استعراض الصور في برامج التصوير باستخدام تطبيقات> مراجعة متعدد الأبعاد البيانات> اسم الملف المفتوح. تحديد فروع محور عصبي مستقرة (20 ميكرون طويل) هذا الشكل خلال الدورة التصوير. استخدام أداة التعادل خط لقياس الفروع الخارجية stableaxonح من القاعدة في محور عصبي إلى طرف لضمان أن يتحقق طول تأهيل 20 ميكرون.
   1. في جدول بيانات، تسجيل رقم الإطار بعد التحفيز netrin عند الشروع نتوءات غشاء في المناطق التي تشكل فروع في وقت لاحق وكذلك رقم الإطار بعد التحفيز netrin عندما تصل فروع الوليدة 20 ميكرون في الطول.
   2. ضرب عدد من الإطارات بين بروز وتشكيل فرع بنسبة 20 ثانية لحساب الوقت تشكيل لكل فرع.

5. التلاعب السمية والثابتة Immunofluoresence خلية

1. في 2 DIV، علاج الخلايا العصبية في ظروف تجريبية مع 250 نانوغرام / مل netrin-1 و / أو 10 نانومتر البوتولينوم توكسين (BONTA)، الذي يشق على SNAP25 البروتين الفخ ويمنع بشكل فعال كمين بوساطة إيماس ^13، بالإضافة إلى 250 نانوغرام / مل netrin- 1. ترك مجموعة واحدة من الخلايا العصبية غير المعالجة كشرط السيطرة.
   تنبيه: BONTA يتطلب استخدام العين وحماية الجهاز التنفسي عند إعداد واستخدامالحلول. الحفاظ على جميع المواد الملوثة والمواد biohazardous والأوتوكلاف في أقرب وقت ممكن.
2. في 3 DIV (24 ساعة بعد العلاج) وسائل الاعلام نضح، واستبدال مباشرة مع 1 مل على الأقل من الإصلاح PHEM (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل) تحسنت إلى 37 درجة مئوية. احتضان لمدة 20 دقيقة في الظلام في RT.
3. شطف 3X مع برنامج تلفزيوني (لختم استخدامها في المستقبل مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجة مئوية).
4. مكان coverslips في الظلام، غرفة تلطيخ مرطب وpermeabilize أغشية الخلايا لمدة 10 دقيقة في المخفف الطازج بنسبة 0.2٪ TritonX-100 في برنامج تلفزيوني (مصنوعة من 10٪ الأسهم TritonX-100).
5. إزالة حل permeabilization وشطف مع 50 ميكرولتر من 1X مع برنامج تلفزيوني. كتلة لمدة 30 دقيقة في ~ 50 ميكرولتر من 10٪ الأبقار مصل الزلال في برنامج تلفزيوني (BSA-PBS) أو 10٪ المغلي حمار المصل في برنامج تلفزيوني في RT.
6. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X مرة أخرى. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (1: 1000 βIII تويولين، لتأكيد هوية الخلايا العصبية) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT، في الظلام.
7. أداء 3X 5 يغسل دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان coverslips في 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية طيفيا-مميز للتويولين (1: 400)، وphalloidin فلوري (يختلف حسب الإثارة: 488 phalloidin في 1: 400، 647 phalloidin في 1: 100) في 1٪ BSA-برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة .
8. غسل 3X 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X وجبل coverslips على الشرائح في وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.
9. فراغ زيادة وسائل الإعلام متزايدة من حواف ساترة وختم مع طلاء الأظافر واضحة.
10. جمع الصور epifluorescence widefield على مجهر مقلوب مع هدف 40X 1.4NA، وقدرات epifluorescent وEM-CCD.
    1. تحليل يدويا المتفرعة باستخدام يماغيج. مداخن صورة مفتوحة في ImageJ عن طريق سحب الملف إلى نافذة أو الذهاب إلى ملف> فتح> اسم الملف (الشكل 4A أقحم 1).
    2. باستخدام خط> خط مجزأة، وتتبع محور عصبي، الذي يعرف بأنه أطول محوار تمتد من سوما (الشكل 4A أقحم 2-3).
    3. عن طريق تحليل> أدوات> مدير العائد على الاستثمار، وتوفير محور عصبي تتبع كمنطقة ذات الاهتمام. تعقب وحفظ كل فرع محور عصبي، الذي يعرف بأنه محوار ≥20 ميكرون في الطول. تشمل فروع فقط الابتدائية (الامتداد تنتشر مباشرة من محور عصبي) في التحليل (الشكل 4A أقحم 3-4).
    4. اضغط على "م" لقياس المناطق المحفوظة في المصالح، ونقل أطوال بالبكسل إلى جدول بيانات لحساب طول في ميكرون.
    5. تقسيم عدد من فروع محور عصبي ≥20 ميكرون في الطول، بسبب طول محور عصبي في ميكرون مقسوما على 100 للحصول على عدد من فروع محور عصبي في 100 طول ميكرون.

النتائج

استخدام في المختبر التقنيات الحيوية لفحص كمية من المجمعات كمين المقاومة للSDS في عدد السكان من الخلايا العصبية. ويبين الشكل (1) ومما أدى لطخة غربية في أعقاب الانتهاء من الفخ فحص معقد مقاومة للSDS بحثها عن SNAP-25، syntaxin1A وVAMP2.

Discussion

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011