軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

要約

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

要約

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

概要

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

プロトコル

研究倫理の声明 ：本明細書に詳述動物に関わる全ての実験は、動物管理上および実験動物の管理と使用のためのNIHの基準にルールやUNC委員会の規制の対象となっています。

1.準備と解離皮質ニューロンのメッキ

1. 頸椎脱臼に続いてCO ₂吸入によって時限妊娠雌を安楽死させます。各半球から胎生15.5（E15.5）マウスと顕微解剖皮質の頭蓋骨から全脳を削除してください。マウス胎児皮質の顕微解剖に関する詳細な手順についてはViesselmann ら ^8を参照^してください。
2. 滅菌1.6ミリリットルマイクロチューブに解剖培地1mlには4つ以上の皮質を置きません。 10倍のトリプシンの120μlを添加して、チューブを3反転 - 混合するために5回。
3. 血球計数器を用いて、細胞を細胞培養皿に播種するために数えます。注：1皮質半球が提供するAPPRoximately300万細胞。
   1. SDS耐性SNARE複雑な生化学アッセイのために、35mmディッシュあたり600万細胞をプレーし、条件ごとに2つの皿を利用しています。注：これは、複数の条件を比較する場合、6ウェルプレートを使用することによって簡略化されます。
   2. 分岐アッセイのために、硝酸のプレートニューロン150,000の密度で軸索分岐プレートのDICイメージングのために、35mmディッシュ当たり250,000細胞の密度で、円形のカバースリップを洗浄しました。これらの密度が過密状態を回避し、分析を簡素化します。
4. 生細胞TIRF顕微鏡検査のために、室温でヌクレオ溶液中にトランスフェクションあたり200万ニューロンを再懸濁します。
   1. メーカープロトコル⁹に記載^のヌクレオとVAMP2-pHlourin発現プラスミドおよびエレクトロポレーションの10μgのを含むマイクロチューブに100μlの細胞懸濁液を追加します。
   2. トランスフェクションは、すぐにトリプシン焼入れメディアの500μlのを追加した後、書斎でキュベットやプレートの細胞からサスペンションを削除35ミリメートルPDLでコーティングされたガラスボトムディッシュ40万セルのsity。
5. プレート無血清培地2ml中のすべての皮質ニューロン。

2. SNARE複合体形成アッセイ

注：SDS耐性SNARE複合体を処理し、元々以下に詳述する変更を加えて^10に記載のように分析しました。ここで使用されるものに検証代替抗体について、材料のセクションを参照してください。

1. E15.5皮質ニューロンを溶解の前に1時間250 ngの/ mlのネトリン-1または偽制御を用いたin vitro（DIV）で 2日間を刺激します。
2. 処理サンプルを、37℃に4℃に冷却し、遠心分離し、設定した水浴温度、100℃に加熱ブロックの前に。
3. インキュベーターから細胞皿を削除し、氷上に置きます。
   1. 吸引細胞からの培地、〜2ミリリットルの氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1のためのやさしく2回交換してください - 洗浄あたり2分。
   2. このアッセイのためには、condにつき2つのウェルを使用ition。
   3. 条件の最初のウェルから吸引し、PBSおよび250μlの均質化緩衝液と交換してください。氷上で5分間のままにして、[セルリフターを使用して、氷上で細胞を均質化。
   4. 同じ条件の次のウェルからPBSを吸引し、ウェルに最近均質化し、混合物を追加します。これは、タンパク質濃度を増加させます。すべての条件のために繰り返します。
   5. 完了時に、ピペットは氷上で予め冷却した1.6 mlのマイクロチューブに溶液を均質化し、1％トリトンX-100の最終濃度に達するように、20％トリトンX-100を加えます。気泡を最小限に抑えながら、1,000μlのピペットで10回混合粉砕します。
4. タンパク質を可溶化するために2分間氷上でチューブをインキュベートします。非可溶化物質をペレット化するためのインキュベーション、4℃で6010 RCFで10分間遠心分離に続いて。氷の上に新しいチルド1.6ミリリットルチューブに溶解物上清を移動します。
5. Bradfordアッセイ^11を使用して^、タンパク質濃度分析を行い、FINAにサンプルを希釈します1％トリトンX-100およびB-メルカプトエタノール（BME）を補充した5×試料緩衝液を補充した均質化緩衝液を残りとmlの5ミリグラム/ - 3のLタンパク質濃度。
6. 2チューブに均等に各実験サンプルを分割します。 30分（SNAREモノマー）を100℃で1 30分間37℃でサンプル（SNARE複合体）、および他のインキュベート。溶液中でサンプルを維持するために断続的にチューブを反転。
7. SDS-PAGEを介して分離する準備ができるまで-20℃でサンプルを凍結します。 100℃で5分間煮沸し、以前のサンプルリボイル、標準的な技術を用いて、電気泳動を介してサンプルを実行する前に、ただし室温で37°Cのサンプルを解凍。
8. サンプル（30 - サンプルあたり40μgのタンパク質）の複製を実行し、8％、15％ゲルの両方で。 15％がSNAREタンパク質モノマー（SNAP-25〜25kDa、VAMP2〜18kDa、シンタキシン-1〜35kDa）を定量化するために使用されるのに対し、8％は、複合体の理想的な分離を提供します。染料ラインがSTAC経由になるまで70 Vで電源を維持します王ゲルと90Vに電圧を増加させます。色素がオフに実行されるまでゲルを実行します。
9. モノマーを維持するために、45分間70 Vで、20％のメタノール（MeOH）で追加されたとコールド転送バッファを使用して氷の上に0.2μmのニトロセルロース膜にタンパク質を移します。
10. 室温でO / N（O / Nが最良の結果を提供します）に2時間覆われた皿の中で乾燥した膜。
11. RTで1時間、10％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックSNARE複合膜。
12. ロータリーシェーカー上で4℃で1,000プローブO / N：1の希釈で（特定のSNARE複合体の構成要素を認識する）一次抗体を準備します。
    1. トリス緩衝生理食塩水+ 0.1％のTween-20（TBS-T）で5分間3回ずつでブロットを洗浄します。
13. RTで覆われて1時間、のためのTBS-Tとプローブ20,000 1％のBSA：1の希釈で蛍光二次抗体溶液を準備します。 1時間後に繰り返し、ステップ2.12.1。
14. 蛍光スキャニングマシン上の画像ブロットは、ソフトウェアスイートを搭載し、SNAREタンパク質の共同の両方を定量化矩形のROIを描画するための製造元の指示を使用して（それぞれ25キロダルトン、18キロダルトン、SNAP-25、VAMP2のための35キロダルトンでの免疫反応性バンドとシンタキシン-1、）mplex（40kDaの上記免疫反応性バンド）とモノマーバンド。

TIRF顕微鏡を介した3イメージングエキソサイトーシスのイベント

注：このプロトコルは、温度、湿度、CO _2を維持するための環境室を含む特殊な顕微鏡装置、落射蛍光照明を装備した倒立TIRF顕微鏡、高倍率/高開口数（NA）TIRF対物、自動化されたXYZステージを必要とし、敏感な電荷結合素子（CCD）検出器。このプロトコルは、100×1.49NA TIRF目的ソリッドステート491 nmのレーザー、電子増倍CCD（EM-CCD）を搭載した完全自動化倒立顕微鏡を使用しています。すべての装置は、撮像及びレーザ制御ソフトウェアにより制御されます。開始前にENVIR上の撮影プロトコルのパワーonmental室、ステージ、ランプ、コンピュータ、およびカメラ。

1. イメージングソフトウェア内で目的を選択します。目的が配置されると、襟周り客観ヒーターを固定します。
2. その目的は、ステージスロットにステージインキュベーターを固定する前に完全に低下させることを確認します。流出を防ぐために均等にステージインキュベーターインレットに蒸留水を注ぎます。
3. インキュベーションシステムの電源をオンにします。 CO ₂タンクにバルブを開き、圧力を製造者の指示に従ってシステムに適していることを確認します。チャンバーを5％CO _2、37℃に到達するためにいくつかの時間を許可します。イメージング皿を追加する前に、客観的に水の凝縮を避けるために、インキュベーターで、空の皿を置きます。
4. レーザ光源の電源をオンにします。
5. オープンステージインキュベーターやレンズにイマージョンオイルを追加します。インキュベーターでサンプルを置き、安定性の腕や皿の重量で安定化させます。油はサンプルの底部に接触するまで目的を上げます。 Switc透過光照明に時間と接眼レンズを介して神経細胞の焦点面を見つけます。
6. レーザーソフトウェアを起動し、レーザ制御ソフトウェアに接続します。広視野と目的が使用されているselectする照明を設定します（100×1.49 NA TIRFが推奨されます）。試料の屈折率（〜1.38細胞）を設定します。 491 nmレーザーのための「TTL」をオフにして、レーザ強度​​を調整します。 40％ - 20の間の値までそれを持ち帰るその後100にスライダーを調整します。 「TTL」を再確認してください。
7. 透過光照明で再びサンプルに焦点を当てています。イメージングソフトウェアに移動し、491 nmのレーザー照射とオープンシャッターを選択します。ファイン天井にレーザーの焦点を調整し、除去冷却器を備えた閉じた視野絞りの中心にポイントを中央に配置します。光学ベンチ上で逆さまに凝縮器を置き、ない傷レンズのように。
8. コンデンサーを交換し、110 nmのTIRFソフトウェアと設定浸透深さ（PD）にアクセスしてください。 TIRFイルミネーションに広視野照明からの切り替えイメージングのためネーションモード。
9. 落射蛍光光源と広視野落射蛍光を使用して、接眼レンズを通して発現細胞VAMP2-phluorinを探します。
   1. 光退色を低減するために、最小限の露光時間及びレーザ強度​​を使用して、ノイズ比とダイナミックレンジに信号を最大化するために、撮像パラメータ（露光時間、ゲインおよびレーザパワー）を調整し、光毒性（例：50の間に露出 - 30から15と100ミリ秒、 30％、最大レーザー出力での利得）。
   2. セル当たりの連続オートフォーカスを設定します。 5分ごとに0.5秒を発生買収で設定タイムラプス画像を取得。ネトリン-1の場合は層流フード内で細胞の皿に500 ngの/ mlのネトリン1を追加し、イメージングの前に1時間インキュベーターに皿を返し、条件を刺激しました。
10. 、ImageJので開い画像スタック> [開く]> [ファイル名（ 図をウィンドウにファイルをドラッグするか、ファイルに行くことによって、セル領域および時間当たりに標準化エキソサイトーシス事象の頻度を定量化するために、0; 2A挿入図1）。
    1. 平均強度：小胞融合事​​象を表すものではありません安定した蛍光シグナルを削除するには、イメージ>スタック> Z-プロジェクト>投影タイプを使用してスタック全体の平均zの投影を作成します。画像1>これはプロセス>イメージ電卓を使用して、微速度撮影で各画像から画像を意味減算：あなたのスタック操作：画像2新しく作成された平均zの投影を引きます。これは、エキソサイトーシス事象（ - 3図2A挿入図2）を強調しています。
    2. 目でエキソサイトーシス融合イベントをカウントします。エキソサイトーシスイベントはVAMP2-phluorinが原形質膜（ 図2A挿入図6）内に拡散するように急速に拡散する回折限界の蛍光シグナルの出現として定義されます。
    3. 全細胞は、しきい値が（ - 8図2A挿入図7）をハイライト表示されるまでスライダーを調整>しきい値>調整>画像を使用して最初の画像を強調表示するしきい値コマンドを使用します。
    4. アナの下でlyze、SetMeasurementsを選択し、エリアと表示ラベルを確認してください。 （ - 8図2A挿入図7）を測定するために杖トレースツールとプレス'M'を使用して閾値処理の細胞領域を選択します。
    5. 両方のエキソサイトーシス融合事象カウント転送、スプレッドシートのセルの面積の測定、および経過撮像時間はエキソサイトーシスイベント/ ² /時間の数（ 図2A挿入図9）を算出します。

4.微分干渉コントラスト（DIC）軸索分岐のタイムラプス顕微鏡

注：DICイメージングへの一般的なアプローチのための完全なプロトコルとデモは¹²利用可能です。このプロトコルは、DICを利用しながら、他の透過光顕微鏡法は、（例：位相コントラスト）を同じ目的のために使用することができます。

1. 2 DIV、多湿のenvを維持するために、予め温めておいた環境室でトランスフェクトしていないニューロンを含む場所のガラスボトムイメージング皿で5％CO _2、37℃でironment。 60Xプラン・アポクロマート、1.4 NA DIC対物レンズと最高の画質と解像度のための高NA凝縮器を備えた顕微鏡を利用しています。
2. 透過光照明を用いた接眼レンズを介して神経細胞を見つけるために、焦点面を調整します。
3. イメージングソフトウェア上のマルチ領域取得機能を使用して、少なくとも6個の細胞のXYZの場所を見つけて、保存します。最良の結果を得るための視野内の関心のフィットのニューロンようにステージを配置します。
   1. 「多領域取得を開始」の250ng / mlのネトリン1を押して刺激します。順次、必​​要に応じて取得し、リフォーカスを一時停止し、24時間、それぞれの位置で20秒ごとに画像を取得します。
4. 多次元データ>開いているファイル名を確認します>アプリケーションを使用して、イメージングソフトウェアで画像を確認します。イメージングセッションの間に形成安定した軸索の枝（長さ20μm）を特定します。 stableaxonのbrancを測定するために、ライン描画ツールを使用します先端に軸索の塩基からhが20μmの長の資格を満たしていることを確認します。
   1. 膜突起が発生期の枝の長さは20ミクロンに達したときに枝が後だけでなく、ネトリン刺激後のフレーム番号を形成する領域で開始すると、スプレッドシートでは、ネトリン刺激後のフレーム番号を記録します。
   2. 枝あたりの形成時間を計算するために20秒によって突起部と分岐形成との間のフレーム数を掛けます。

5.毒素操作および固定細胞の免疫蛍光

1. 2 DIVで、切断するSNAREタンパク質SNAP25、250 ngの/ mlのネトリン-1および/ ​​または10 nMのボツリヌス毒素（BONTA）と実験条件でニューロンを治療し、効果的にSNARE媒介エキソサイトーシス^13、プラス250 ngの/ mlのnetrin-を阻害します1。制御条件として、未処理のニューロンの1組にしておきます。
   注意：準備と使用しているときBONTAが目や呼吸保護具を使用する必要がありますソリューション。できるだけ早くバイオハザード材料、オートクレーブなど、すべての汚染物質を維持します。
2. 3 DIV（24時間後の治療）培地を吸引し、直ちにPHEMの修正（詳細は表1を参照）の少なくとも1ミリリットルと交換し、37℃に温めました。室温で暗所で20分間インキュベートします。
3. （4℃でパラフィルムや店舗での将来の使用のシール用）をPBSで3回洗浄します。
4. 場所の暗い加湿染色チャンバ内のカバースリップと（10％トリトンX-100ストックから作られる）、PBS中の新たに希釈し、0.2％トリトンX-100で10分間、細胞膜を透過性。
5. 透過性溶液を除去し、PBSで1×50μlのですすいでください。で30分間ブロック〜PBS（BSA-PBS）中の10％ウシ血清アルブミンの50μlあるいは10％を室温でPBS中にロバ血清を煮。
6. 再び1×PBSですすいでください。 RTで1時間、1％BSA-PBSで：（ニューロンの身元を確認するために千βIIIチューブリン、1）一次抗体50μlの中でカバースリップをインキュベート、 暗闇で。
7. PBS中で3×5分の洗浄を行います。チューブリン（1：400）のためのスペクトル的に別個の二次抗体50μlのカバースリップをインキュベートし、蛍光ファロイジン（励起によって異なります：100 1で488ファロイジン：400、647ファロイジン1時）1時間1％BSA-PBSで。
8. 1×PBSで洗浄3×5分とメディアのマウントにスライド上にカバースリップをマウントします。
9. 明確なマニキュアでカバーガラスとシールの縁からメディアをマウント真空過剰。
10. 40X 1.4NAの対物レンズ、落射蛍光機能とEM-CCDと倒立顕微鏡に広視野落射蛍光画像を収集します。
    1. 手動でのImageJを使用して分岐分析します。ウィンドウにファイルをドラッグするか、> [開く]> [ファイル名（ 図4A挿入図1）をファイルに行くことによってImageJので開く画像スタック。
    2. ライン>セグメント化ラインを使用すると、ソーマ（ - 3、図4Aの挿入図2）から延びる最も長い神経突起のように定義された軸索を、トレースします。
    3. 分析>ツール> ROI Managerを使用して、関心領域としてトレース軸索を保存します。長さの神経突起≥20μmのように定義された各軸索の枝を、トレースして保存します。分析（ - 4図4Aの挿入図3）中の（直接軸索から発芽増殖物）のみの一次枝が含まれます。
    4. 押して「m」は、目的の保存された領域を測定し、マイクロメートルの長さを計算するためにスプレッドシートに画素の長さを転送します。
    5. 100μmの長さ当たりの軸索分岐の数を取得するために、100で割ったμm単位の軸索の長さで、長さが≥20μmの軸索分岐の数を割ります。

結果

神経細胞の集団におけるSDS耐性SNARE複合体の量を測定するためにインビトロ生化学的手法に活用。 図1は、SNAP-25、syntaxin1AとVAMP2についてプローブSDS耐性SNARE複合体アッセイの完了後、得られたウエスタンブロットを示しています。

基底細胞膜にTIRF顕微鏡法は、単一のセル内の個々のエキソサイト?...

ディスカッション

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011