ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

Summary

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Abstract

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Introduction

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

Protocol

הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כפופים לכללים והתקנות של ועדת UNC על טיפול בבעלי חיים בסטנדרטים NIH לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. הכנת ציפוי של נוירונים ניתק קורטיקלי

1. להרדים נשים בהריון בעיתוי משאיפת CO ₂ ואחריו נקע בצוואר הרחם. סר המוח כולו מן הגולגולות של 15.5 היום עוברי (E15.5) הקורטקס עכברי microdissect מן אונה כל. לקבלת הוראות מפורטות לגבי microdissection של קליפת עכבר עוברית עיין Viesselmann ואח ^8.
2. מניחים לא יותר מ -4 הקורטקס ב 1 מ"ל של התקשורת לנתח בתוך microtube 1.6 מ"ל סטרילי. להוסיף 120 μl של 10x טריפסין להפוך את הצינור 3 - 5 פעמים כדי לערבב.
3. באמצעות hemocytometer, לספור תאי זרע מנות תרבית תאים. הערה: 1 בחצי הכדור קליפת המוח מספק approximately שלוש מיליון תאים.
   1. עבור assay SDS עמיד המלכודת ביוכימיה המורכבת, צלחת שישה מיליון תאים לכל 35 צלחת מ"מ ולנצל שתי מנות לכל מצב. הערה: זו היא פשוטה באמצעות 6 צלחות גם כאשר משווים תנאים מרובים.
   2. עבור מבחני הסתעפות, נוירונים צלחת על חומצה חנקתית שטף coverslips עגול בצפיפות של 250,000 תאים לכל 35 מ"מ צלחת, הדמיה דסק"ש של צלחת הסתעפות האקסון בצפיפות של 150,000. צפיפויות אלו נמנעות צפיפות ולפשט ניתוח.
4. עבור מיקרוסקופיה TIRF תא חי, resuspend שני מיליון נוירונים לכל transfection בתמיסה nucleofection ב RT.
   1. הוספת 100 μl של ההשעיה התא microtube המכיל 10 מיקרוגרם של פלסמיד ביטוי VAMP2-pHlourin ו electroporate עם Nucleofector פי היצרן פרוטוקול ^9.
   2. לאחר transfections מייד להוסיף 500 μl של תקשורת מרווה טריפסין, להסיר השעיה מתא קובט הצליח ב מאורהצפיפות של 400,000 תאים לכל 35 מ"מ זכוכית PDL מצופה צלחת תחתית.
5. פלייט כל נוירונים בקליפת המוח ב 2 מ"ל של תקשורת חופשית בסרום.

2. מלכודת Assay גיבוש Complex

הערה: מתחמי SDS עמידי מלכודת עובדו ונותחו כמתואר במקור ¹⁰ בשינויים המפורטים להלן. עבור נוגדנים אלטרנטיבה תוקף לאלה המשמשים כאן, עיין בסעיף חומרים.

1. לעורר נוירונים בקליפת המוח E15.5 2 ימים במבחנה (DIV) עם 250 שליטה netrin-1 או אחיזת עיניים ng / ml עבור שעה 1 לפני תמוגה.
2. לפני דגימות עיבוד, צנטריפוגות מגניב 4 מעלות צלזיוס, והטמפרטורה באמבט מים מוגדר 37 מעלות צלזיוס, ואת גוש חום עד 100 מעלות צלזיוס.
3. הסר מנות תא מן החממה ומניח על קרח.
   1. התקשורת לשאוב מתאי, להחליף עם ~ 2 בופר פוספט קר מ"ל קרח (PBS) בעדינות 2 פעמים במשך 1 - 2 דקות לכל לשטוף.
   2. עבור assay זה, השתמש 2 בארות לכל מנצחition.
   3. לשאוב PBS מן הבאר הראשונה של מצב ולהחליף עם 250 חיץ המגון μl. השאר על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן באמצעות מרים תא, homogenize תא על קרח.
   4. לשאוב PBS מהבאר הבאה של אותו המצב ומוסיף את התערובת הומוגני לאחרונה אל הבאר. זה יגביר ריכוזי חלבון. חזור על הפעולה עבור כל תנאי.
   5. בסיום, פיפטה הומוגני פתרון microtube מראש מקורר 1.6 מ"ל על הקרח ולהוסיף 20% TritonX-100 כדי להגיע לריכוז סופי של 1% TritonX-100. Triturate לערבב 10 פעמים עם 1,000 פיפטה μl תוך מזעור בועות.
4. דגירת צינורות על קרח במשך 2 דקות כדי solubilize חלבונים. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 6,010 RCF ב 4 ° C עד גלולת חומר שאינו solubilized. הזז supernatant lysate לתוך צינור 1.6 מ"ל מקורר חדש על הקרח.
5. ביצוע ניתוח ריכוז חלבון באמצעות assay ברדפורד ¹¹ ו לדלל דגימות פינהריכוז l חלבון של 3 - 5 מ"ג / מ"ל ​​עם הנותרים חיץ המגון בתוספת 1% TritonX-100 לבין חיץ מדגם 5x בתוספת B-Mercaptethanol (BME).
6. מחלקים כל מדגם ניסיוני שווה ל -2 צינורות. דגירת מדגם אחד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מתחמי מלכודת), והשני ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (מונומרים מלכודת). היפוך צינורות לסירוגין לשמור דגימות בתמיסה.
7. להקפיא דגימות ב -20 ° C עד מוכן להפריד באמצעות SDS-PAGE. לפני הפעלת דגימות באמצעות אלקטרופורזה באמצעות טכניקות סטנדרטיות, להרתיח מחדש דגימות מבושלות בעבר במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס, אך להפשיר 37 ° C דגימות ב RT.
8. כפילויות הפעל של דגימות (30 - 40 מיקרוגרם חלבון לכל מדגם) משני 8% ו ג'ל 15%; 8% מספקים הפרדה אידיאלית של המתחם, ואילו 15% משמשים לכמת מונומרים חלבון מלכודת (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, syntaxin-1 ~ 35kDa). לשמור על מקור כוח ב 70 V עד קו הצבע הוא דרך stacהמלך ג'ל ומתח עליה כדי 90V. הפעל ג'לים עד לצבוע בורח.
9. כדי לשמר מונומרים, להעביר חלבונים 0.2 מיקרומטר קרום nitrocellulose על הקרח באמצעות חיץ העברת קר עם 20 מתנול% (MeOH) הוסיף, ב 70 V עבור 45 דקות.
10. קרום יבש בצלחת מכוסה במשך שעה 2 ל O / N ב RT (O / N מספק את התוצאות הטובות ביותר).
11. בלוק המלכודת ממברנות מורכבים ב 10% שור סרום אלבומין (BSA) במשך שעה 1 ב RT.
12. כן נוגדנים ראשוניים (הכרת רכיבים מורכבים ספציפיים מלכודת) בדילול של 1: 1,000 ו חללית O / N ב 4 ° C על שייקר רוטרי.
    1. לשטוף כתמים טריס בופר בתוספת 0.1% Tween-20 (TBS-T) 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
13. הכינו פתרונות נוגדנים משני ניאון בדילול של 1: 20,000 ב BSA 1% ב TBS-T ו- בדיקה עבור שעה 1, מכוסה ב RT. 2.12.1 חזור על שלב אחרי 1 hr.
14. כתמי תמונה על במכונת שיקוף פלואורסצנטי מצוידים חבילת תוכנות ולכמת הוא שיתוף חלבון המלכודתmplex (להקות immunoreactive מעל 40kDa) ולהקות מונומר (להקות immunoreactive ב 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa עבור SNAP-25, VAMP2 ו syntaxin-1, בהתאמה) באמצעות הוראות היצרן עבור ציור ROIs מלבני.

3 אירועים הדמיה Exocytic באמצעות מיקרוסקופית TIRF

הערה: פרוטוקול זה דורש ציוד מיקרוסקופיה מיוחד כולל בתא סביבתי כדי לשמור על טמפרטורה, לחות ו- CO _2, מיקרוסקופ TIRF הפוך מצויד תאורת epifluorescent, בהגדלה גבוהה / צמצם מספרי גבוה (NA) מטרת TIRF, שלב XYZ אוטומטי, ו מכשיר תשלום מצמידים רגיש (CCD) גלאי. פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ הפוך אוטומטי לחלוטין מצויד 100x 1.49NA TIRF מטרת ליזר מדינת 491 ננומטר מוצק ו CCD הכפלת אלקטרונים (EM-CCD). כל הציוד נשלטת על ידי תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת כוח פרוטוקול הדמיה על envirקאמרית, במת onmental, מנורה, מחשב, ואת המצלמה.

1. מטרה בחר בתוך תוכנת הדמיה. ברגע המטרה היא במקום, להדק את דוד המטרה מסביב לצווארון.
2. אשר המטרה כי הוא הוריד לגמרי לפני הבטחת החממה הבמה בחריץ הבמה. יוצקי מים מזוקקים לתוך פתחי כניסת חממת הבמה באופן שווה כדי למנוע דליפה.
3. הפעל את מערכת הדגירה. פתח את השסתום אל טנק CO ₂ ולאשר את הלחץ הוא מתאים למערכת לפי הוראות יצרן. אפשר קאמרי קצת זמן להגיע 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס. לפני הוספת מנת ההדמיה, למקם קערה ריקה בחממה כדי למנוע התעבות מים על המטרה.
4. כוח על מקור לייזר.
5. חממה במה פתוחה ולהוסיף שמן טבילה העדשה. מניחים מדגם באינקובטור ולייצב בזרועות יציבות או משקל המנה. הרם את המטרה עד שהשמן הופך במגע עם החלק התחתון של המדגם. switch כדי תאורת אור המועבר ולמצוא מישור מוקד עצבי דרך oculars.
6. התחל תוכנה לייזר ולהתחבר תוכנות שליטה לייזר. הגדר תאורה כדי widefield ובחר את המטרה בשימוש (1.49 100X NA TIRF מומלץ). מקדמים שבירת גדר של המדגם (תאים ~ 1.38). התאם עוצמת הלייזר על ידי ביטול הסימון "תקשורת" עבור לייזר 491 ננומטר. התאם את המחוון 100 ואז להביא אותה בחזרה למטה לערך בין 20 - 40%. בדוק שוב "TTL".
7. פוקוס על מדגם שוב תאורת אור מועברת. עבור אל תוכנת הדמיה ובחר 491 ננומטר תאורה לייזר תריס פתוח. פיין להתאים את נקודת המוקד של לייזר על התקרה ומרכז את הצבע על מרכז הסרעפת שדה סגור עם הקבל הסיר. מניח קבל במהופך על הספסל האופטי, כדי לא עדשה מאפסת.
8. חלף קבל וללכת תוכנת TIRF ועומק חדירה להגדיר (PD) ל -110 ננומטר. עבור מ- תאורה widefield כדי TIRF תאורה פנימיתמצב ination הדמיה.
9. מצא VAMP2-pHluorin לבטא בתאי דרך oculars באמצעות epifluorescence widefield עם מקור האור epifluorescent.
   1. להתאים את הפרמטרים הדמיה (זמן חשיפה, רווח וכוח לייזר) על מנת למקסם יחס אות לרעש וטווח דינמי באמצעות זמן חשיפה מינימלית עוצמת הלייזר כדי להפחית photobleaching ו phototoxicity (למשל: חשיפה בין 50 - 100 msec, עם -15 - 30 רוכש 30% כוח ליזר מרבי).
   2. פוקוס אוטומטי רציף גדר לכל תא. רכישה לרכוש תמונת timelapse משובצת המתרחשת כל 0.5 שניות למשך 5 דקות. עבור תנאי מגורה-1 netrin, להוסיף 500 netrin-1 ng / ml כדי צלחת של תאים במנדף זרימה למינרית ולהחזיר את התבשיל כדי בחממה במשך שעה 1 לפני הדמיה.
10. כדי לכמת את תדירות אירועי exocytic מנורמלים ליחידת שטח תא וזמן, ערימות תמונה פתוחות ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך החלון או מעבר אל הקובץ> פתח> שם קובץ (איור0; 2A הבלעה 1).
    1. כדי להסיר אותות ניאון יציבה שאינו מייצג אירועי איחוי שלפוחית, ליצור הקרנת z ממוצעת של הערימה כולה באמצעות תמונה> סטאק>-Project ת '> סוג הקרנה: עצמה ממוצעת. הפחת תמונה זה אומר מ לכל תמונה ב- timelapse באמצעות תהליך> מחשבון תמונה> Image1: מבצעת המחסנית שלך: נפחית Image2 הקרנת z ממוצע חדש שנוצרה. זה מדגיש אירועים exocytic (איור 2 א הבלעה 2 - 3).
    2. רוזן אירועי היתוך exocytic לפי עין. אירועים Exocytic מוגדרים כמו המראה של אות הקרינה מוגבל עקיפה, אשר מפזרת במהירות VAMP2-pHluorin מפזרת בתוך קרום התא (6 איור 2A הבלעה).
    3. השתמש בפקודת הסף כדי להדגיש את התמונה הראשונה באמצעות תמונה> התאם> סף> להתאים מחוון עד התא כולו הוא הדגיש סף (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
    4. תחת אנהlyze, לבחור SetMeasurements ולבדוק באזור ותווית התצוגה. בחר את אזור הסלולר thresholded שימוש באפשרות עקיבת שרביט ו 'מ' לחץ כדי למדוד (איור 2 א הבלעת 7 - 8).
    5. העברת שני האירועים היתוך exocytic לספור, המדידות שטח התא, והזמן שחלף הדמיה לגיליון אלקטרוני לחשב מספר אירועים exocytic / ² מ"מ / שעה (איור 2 א הבלעה 9).

4. התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) Timelapse מיקרוסקופית של אקסון מסעף

הערה: פרוטוקול מלא והדגמה עבור גישה כללית ההדמיה דסק"ש זמין ^12. בעוד פרוטוקול זה מנצל דסק"ש, שיטות מיקרוסקופיה אור מסורות אחרות עשויות לשמש לאותן מטרות (למשל: לעומת שלב).

1. בשעה 2 DIV, צלחת הדמיה תחתית זכוכית המקום המכיל נוירונים untransfected בתא מחומם מראש הסביבה לשמור על env לחironment עם 5% CO ₂ ו -37 מעלות צלזיוס. לנצל מיקרוסקופ מצויד עדשה אובייקטיבית 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA דסק"ש קבל NA גבוה עבור איכות תמונה הטובה ביותר ואת הפתרון.
2. התאם את מישור המוקד למצוא נוירונים דרך oculars באמצעות תאורת אור מועברת.
3. השימוש בפונקצית רכישת שטח רבה על תוכנת הדמיה, למצוא ולשמור את מיקומי XYZ של 6 תאים לפחות. מקם את הבמה כך נוירונים של לנכון עניין בתוך שדה הראייה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
   1. לגרות עם 250 ng / ml netrin-1 ולחץ על 'להתחיל רכישת שטח רב'. ברצף לרכוש תמונות בכל עמדה כל 20 שניות למשך 24 שעות, משתהה ברכישת refocusing לפי צורך.
4. בדוק את התמונות בתוכנת הדמיה באמצעות Apps> סקור Multi נתונים מימדי> שם קובץ פתוח. זהה סניפי האקסון יציבים (20 מיקרומטר ארוך) הטופס כי במהלך פגישת ההדמיה. השתמש בכלי קו תיקו למדוד stableaxon branch מן הבסיס ב האקסון אל קצה על מנת להבטיח את ההסמכה אורך 20 מיקרומטר הוא נפגש.
   1. בגיליון אלקטרוני, לרשום את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר בליטות קרום ליזום באזורים שבהם סניפים מאוחר יותר ליצור, כמו גם את מספר מסגרת לאחר גירוי netrin כאשר סניפים המתהווה להגיע ל -20 מיקרומטר באורך.
   2. להכפיל את מספר מסגרות בין בליטת היווצרות ענף ב -20 שניות כדי לחשב את זמן היווצרות לסניף.

5. מניפולציות הרעלן Immunofluoresence סלולרי קבוע

1. בשעה 2 DIV, לטפל נוירונים בתנאי ניסוי עם 250 ng / ml netrin-1 ו / או 10 ננומטר בוטולינום טוקסין (BoNTA), אשר וחותך את SNAP25 חלבון המלכודת וביעילות מעכב בתיווך המלכודת exocytosis ^13, בתוספת 250 ng / ml netrin- 1. השאר קבוצה אחת של נוירונים לא מטופל כמו מצב שליטה.
   זהירות: BoNTA מחייב שימוש עין להגנת נשימה בעת הכנה ושימושפתרונות. שמור את כל חומרים מזוהם כחומר חיטוי ביולוגי מסוכנים בהקדם האפשרי.
2. בשעה 3 DIV (טיפול פוסט 24 שעות) התקשורת לשאוב, ומיד להחליף עם לפחות 1 מ"ל של תיקון PHEM (ראה טבלה 1 לפרטים נוספים) חימם עד 37 מעלות צלזיוס. דגירה של 20 דקות בחושך ב RT.
3. לשטוף 3x עם PBS (עבור חותם לשימוש עתידי עם parafilm ולאחסן ב 4 ° C).
4. coverslips מקום בתא מכתים כהה, humidified ו permeabilize קרום התא למשך 10 דקות ב 0.2% TritonX-100 בדילול הטרי PBS (עשויות 10% TritonX-100 מניות).
5. הסר פתרון permeabilization ולשטוף עם 50 μl של 1x עם PBS. בלוק למשך 30 דקות ב ~ 50 μl של 10% שור סרום אלבומין PBS (BSA-PBS) או 10% מבושל דונקי סרום PBS ב RT.
6. לשטוף עם 1x PBS שוב. דגירת coverslips ב 50 μl של נוגדן ראשוני (1: טובולין βIII 1,000, כדי לאשר את זהות עצבית) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 ב RT, בחושך.
7. בצע 3x 5 שטיפות דקות ב PBS. דגירה coverslips ב 50 μl של נוגדנים משני-מובחנת ספקטרלית עבור טובולין (1: 400), ו phalloidin ניאון (משתנה בהתאם עירור: 488 phalloidin ב 1: 400, 647 phalloidin ב 1: 100) ב 1% BSA-PBS עבור שעה 1 .
8. לשטוף 3x 5 דקות 1x PBS ו הר coverslips על שקופיות במדיה גוברים.
9. תקשורת הרכבה עודפת אבק מן הקצוות של coverslip ואת החותם עם לק ברור.
10. איסוף תמונות epifluorescence widefield על מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה 40X 1.4NA, יכולות epifluorescent ו-CCD EM.
    1. ידני לנתח הסתעפות באמצעות ImageJ. ערימות פתח את התמונה ImageJ ידי גרירת הקובץ לתוך חלון או מעבר אל קובץ> פתח> שם הקובץ (הבלעה 4A איור 1).
    2. באמצעות קו> קו מקוטע, להתחקות אחר האקסון, מוגדר neurite הארוך המשתרע סומה (איור 4 א ההבלעה 2 - 3).
    3. שימוש לנתח> כלים> מנהל ROI, להציל את האקסון התחקות כאזור של עניין. עקבות ולשמור בכל סניף האקסון, המוגדר מיקרומטר neurite ≥20 באורך. כולל את מערך סניפים עיקריים בלבד (בצמחי הנבטה ישירות האקסון) ב (הבלעת 4A איור 3 - 4) ניתוח.
    4. 'מ' לחץ כדי למדוד את האזורים השמורים של עניין, ולהעביר אורכי בפיקסלים לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את האורך ב מיקרומטר.
    5. מחלקים את מספר הסניפים האקסון ≥20 מיקרומטר אורך, לפי אורך של האקסון מיקרומטר מחולק 100 כדי לקבל מספר הסניפים האקסון לכל אורך 100 מיקרומטר.

תוצאות

ניצול טכניקות ביוכימיות במבחנה assay את כמות מתחמי מלכודת עמידה SDS בקרב אוכלוסייה של נוירונים. איור 1 מציג את הכתם מערבי וכתוצאת ההשלמה הבאה של assay SDS העמיד המלכודת המורכבת תרה אחרת SNAP-25, syntaxin1A ו VAMP2.

Discussion

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011