Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Zusammenfassung

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Zusammenfassung

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Einleitung

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

Protokoll

Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche Tiere hierin unterliegen den Regeln und Vorschriften des UNC - Ausschusses für Tierpflege und NIH - Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren detailliert beteiligt sind .

1. Herstellung und Beschichtung von Dissociated kortikalen Neuronen

1. Euthanize timed-trächtige Weibchen durch CO ₂ Inhalation durch Genickbruch folgte. Entfernen Sie ganze Gehirn aus den Schädeln embryonaler Tag 15.5 (E15.5) Mäuse und microdissect Rinden von jeder Hemisphäre. Eine ausführliche Anleitung über die Mikrodissektion von embryonalen Maus Kortex bitte Viesselmann et al ⁸ zu sehen.
2. Legen nicht mehr als 4 cortices in 1 ml Sezieren Medien in einem sterilen 1,6 ml Microtube. In 120 ul 10x Trypsin und wird das Röhrchen 3 bis 5-mal zu mischen.
3. Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen Zellen Zellkulturschalen auf Saatgut. Anmerkung: 1 kortikalen Hemisphäre liefert ca.oximately drei Millionen Zellen.
   1. Für die SDS-resistenten SNARE-Komplex Biochemie Assay Platte sechs Millionen Zellen pro 35 mm-Schale und verwenden zwei Gerichte pro Zustand. Hinweis: Dies wird durch Verwendung von 6-Well-Platten wird vereinfacht, wenn mehrere Bedingungen zu vergleichen.
   2. Für Verzweigungs Assays Platte Neuronen auf Salpetersäure gewaschen Kreisdeck bei einer Dichte von 250.000 Zellen pro 35 mm-Schale, für die DIC-Bildgebung von Axon Verzweigung Platte mit einer Dichte von 150.000. Diese Dichten vermeiden Übervölkerung und Analyse zu vereinfachen.
4. Für die Live-Zelle TIRF Mikroskopie, resuspendieren zwei Millionen Neurone pro Transfektion in Nukleofektion Lösung bei RT.
   1. Zugabe von 100 ul Zellsuspension zu Microtube 10 ug VAMP2-pHlourin Expressionsplasmid enthält , und mit einem elektroporieren Nucleofector nach Herstellerprotokoll ^9.
   2. Nach Transfektionen sofort 500 ul Trypsin Löschmedium hinzufügen, entfernen Suspension von Küvetten und Platte Zellen in einer Höhlesität von 400.000 Zellen pro 35 mm PDL-beschichtete Glasbodenschale.
5. Platte alle kortikalen Neuronen in 2 ml Serum-freien Medien.

2. SNARE-Komplexbildung Assay

Hinweis: SDS-resistenten SNARE - Komplexe wurden verarbeitet und analysiert , wie ursprünglich ¹⁰ beschrieben mit den Änderungen , die nachstehend beschrieben. Für validierte alternative Antikörper gegen die hier verwendet wird, finden Sie im Abschnitt Materialien.

1. Stimulieren E15.5 kortikalen Neuronen 2 Tage in vitro (DIV) mit 250 ng / ml Netrin-1 oder Schein - Kontrolle für 1 Stunde vor der Lyse.
2. Vor der Verarbeitung von Proben, kühle Zentrifuge bis 4 ° C, und setzen Wasserbadtemperatur auf 37 ° C und Wärmeblock auf 100 ° C.
3. Entfernen Sie Zelle Gerichte aus Inkubator und auf Eis.
   1. Absaugen Medien aus Zellen, ersetzen mit ~ 2 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) sanft 2 mal mit 1 - 2 min pro Wasch.
   2. Für diesen Test verwenden zwei Vertiefungen pro Ltgition.
   3. Absaugen PBS aus der ersten Vertiefung einer Bedingung und ersetzen mit 250 ul Homogenisierungspuffers. Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann eine Zelle Lifter, homogenisieren Zellen auf Eis.
   4. Saugen Sie das PBS aus dem nächsten gut von den gleichen Bedingungen und zu der auch die vor kurzem homogenisierte Mischung. Dies wird die Proteinkonzentrationen erhöhen. Wiederholen Sie dies für alle Bedingungen.
   5. Nach der Fertigstellung homogenisiert Pipettenlösung auf ein vorgekühltes 1,6 ml Mikroröhrchen auf Eis und füge 20% TritonX-100 auf eine Endkonzentration von 1% TritonX-100 zu erreichen. 10-mal mit 1000 ul Pipette Man reibt mischen, während Blasen zu minimieren.
4. Die Röhrchen auf Eis für 2 min, um Proteine ​​zu solubilisieren. Nach der Inkubation Zentrifuge für 10 min bei 6010 rcf bei 4 ° C pelletiert nicht-solubilisierten Material. Bewegen Sie Lysatüberstand in neue gekühlte 1,6-ml-Röhrchen auf Eis.
5. Führen Proteinkonzentration Analyse unter Verwendung von Bradford - Test ¹¹ und verdünnten Proben auf eine final Proteinkonzentration von 3 bis 5 mg / ml mit Puffer-Rest Homogenisieren, supplementiert mit 1% TritonX-100 und 5-fach Probenpuffer, ergänzt mit B-Mercaptethanol (BME).
6. Teilen Sie jede experimentelle Probe gleichmäßig in zwei Röhren. Inkubieren einer Probe bei 37 ° C für 30 min (SNARE-Komplexe), und das andere bei 100 ° C für 30 min (SNARE Monomere). Invert Röhren intermittierend Proben in Lösung zu halten.
7. Frieren Proben bei -20 ° C bis bereit, über SDS-PAGE zu trennen. Vor der Proben mittels Elektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden, Aufkochen vorher gekochten Proben für 5 min bei 100 ° C, aber auftauen 37 ° C Proben bei RT.
8. Führen Sie Duplikate der Proben (30 - 40 & mgr; g Protein pro Probe) sowohl auf einem 8% und 15% Gel; die 8% bietet ideale Abtrennung des Komplexes, während die 15% verwendet wird SNARE-Protein-Monomere (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, Syntaxin-1 ~ 35 kDa) zu quantifizieren. Pflegen Stromquelle bei 70 V bis der Farbstoff Linie durch die stac istKönig Gel und Erhöhung Spannung 90V. Führen Sie Gele, bis der Farbstoff abläuft.
9. Um Monomere zu erhalten, übertragen Proteine ​​bis 0,2 um Nitrocellulosemembran auf Eis mit kaltem Transferpuffer mit 20% Methanol (MeOH) zugegeben, bei 70 V für 45 min.
10. Dry Membran in einer Schale mit Deckel für 2 Stunden auf O / N bei RT (O / N liefert die besten Ergebnisse).
11. Block SNARE-Komplex-Membranen in 10% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei RT.
12. Bereiten Sie primäre Antikörper (Erkennung spezifischer SNARE-Komplex-Komponenten) in einer Verdünnung von 1: 1000 und Sonde O / N bei 4 ° C auf einem Rotationsschüttler.
    1. Spülen Blots in Tris-gepufferter Salzlösung plus 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 mal für jeweils 5 Minuten.
13. Bereiten Sie fluoreszierenden sekundären Antikörperlösungen in einer Verdünnung von 1: 20.000 in 1% BSA in TBS-T und Sonde für 1 Stunde bei RT abgedeckt. Wiederholen Sie Schritt 2.12.1 nach 1 Stunde.
14. Bild Flecken auf einem fluoreszierenden Scan-Maschine mit Software Suite ausgestattet und zu quantifizieren, sowohl die SNARE-Protein complex (immunoreaktive Banden oberhalb 40 kDa) und Monomer Bänder (immunoreaktive Banden bei 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa für SNAP-25, Syntaxin und VAMP2-1 bezeichnet) unter Verwendung von Anweisungen des Herstellers zum Zeichnen rechteckigen ROIs.

3. Imaging Exozytose-Events über TIRF Mikroskopie

Hinweis: Dieses Protokoll erfordert spezielle Mikroskopie Ausrüstung einschließlich einer Klimakammer Temperatur, Feuchtigkeit und CO _2, ein umgekehrtes TIRF - Mikroskop ausgestattet mit einer epifluoreszenten Beleuchtung, hoher Vergrößerung / hoher numerischer Apertur (NA) TIRF Ziel, eine automatisierte XYZ - Plattform zu halten und ein empfindliches Charge Coupled Device (CCD) -Detektor. Dieses Protokoll verwendet einen vollständig inverses Mikroskop mit einem 100x 1.49NA TIRF Ziel einen festen Zustand 491-nm-Laser und einem Elektronenvervielfachungs CCD (EM-CCD) ausgestattet automatisiert. Alle Geräte werden durch Bildgebung und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Beginn der Bildgebungsprotokoll Leistung auf der environmental Kammer, Bühne, Lampe, Computer und Kamera.

1. Wählen Sie Ziel innerhalb Imaging-Software. Sobald das Ziel vorhanden ist, befestigen Sie den Objektivheizer um den Kragen.
2. Bestätigen Sie, dass Ziel abgesenkt wird vollständig, bevor die Bühne Inkubator in der Stufe Schlitz zu sichern. Gießen Sie destilliertes Wasser in die Stufe Inkubator Einlässe gleichmäßig Spill zu verhindern.
3. Schalten Sie das Inkubationssystems. Öffnen Sie das Ventil in die CO ₂ Tank und bestätigen der Druck für das System den Anweisungen des Herstellers geeignet ist. Warten Sie einige Zeit Kammer zu erreichen , 5% CO ₂ und 37 ° C. Vor der Zugabe des Abbildungsschale, legen Sie eine leere Schale in den Inkubator Kondensation von Wasser auf dem Ziel zu vermeiden.
4. Einschalten der Laserquelle.
5. Offene Bühne Inkubator und Sionsöl auf die Linse hinzuzufügen. Legen Probe in Inkubator und zu stabilisieren, mit Stabilität Armen oder einem Teller Gewicht. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit dem Boden der Probe macht. switch Durchlichtbeleuchtung und neuronale Fokusebene durch die Okulare finden.
6. Starten Lasersoftware und eine Verbindung mit dem Lasersteuerungssoftware. Set Beleuchtung Weitfeld ein und wählen Sie das Ziel verwendet wird (100X 1,49 NA TIRF wird empfohlen). Eingestellt Brechungsindex der Probe (Zellen ~ 1,38). Passen Laserintensität von "TTL" für die 491-nm-Laser deaktivieren. Stellen Sie den Schieberegler auf 100 dann bringen sie zurück nach unten auf einen Wert zwischen 20 bis 40%. Überprüfen Sie nochmals "TTL".
7. Konzentrieren Sie sich auf Probe wieder in Durchlichtbeleuchtung. Zum Imaging-Software und wählen Sie 491-nm-Laserbeleuchtung und offener Blende. Die Feineinstellung der Brennpunkt des Lasers an der Decke und in der Mitte den Punkt zu der Mitte des geschlossenen Feldblende mit dem Kühler entfernt. Legen Kondensator Oberseite nach unten auf der optischen Bank, um nicht zu kratzen Objektiv.
8. Ersetzen Kondensator und gehen Sie zu TIRF-Software und stellen Eindringtiefe (PD) bis 110 nm. Wechseln Sie von Weitfeld-Beleuchtung zu TIRF illumination Modus für die Bildgebung.
9. Finden VAMP2-phluorin Zellen durch die Okulare mit Weitfeld- Epifluoreszenz mit epifluoreszenten Lichtquelle zum Ausdruck.
   1. Justieren Sie Bildparameter (Belichtungszeit, Verstärkung und Laserleistung) zu maximieren Signal-Rausch-Verhältnis und der Dynamikbereich Intensität die minimale Belichtungszeit und Laser Photobleaching und Phototoxizität zu reduzieren (zum Beispiel: Exposition zwischen 50 bis 100 ms, mit einem 15 - 30 bei 30% gewinnen maximale Laserleistung).
   2. Stellen Sie den Serienautofokus pro Zelle. Erwerben Sie ein Timelapse Bild gesetzt mit dem Erwerb alle 0,5 Sekunden für 5 Minuten auftreten. Für die Netrin-1 stimuliert Zustand, 500 ng / ml Netrin-1 zu Schale von Zellen in einer Laminar-Flow-Haube und Rück die Schale in den Inkubator für 1 Stunde vor der Bildgebung.
10. Die Häufigkeit der Exozytose - Ereignisse pro Zelle Fläche und der Zeit, offen Bildstapel in ImageJ , indem Sie die Datei in das Fenster oder gehen Sie zu Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung normalisiert zu quantifizieren0; 2A Inset 1).
    1. Durchschnittliche Intensität: Um eine stabile Fluoreszenzsignale zu entfernen, die eine durchschnittliche z Projektion des gesamten Stapels mit Bild> Stapel> Z-Projekt> Projektionstyp nicht Vesikelfusion Ereignisse darstellen, erstellen. Subtrahieren dieses mittlere Bild von jedem Bild im Timelapse mit Prozess> Bild Rechner> Bild1: Ihr Stack-Betrieb: subtrahieren Image2 neu geschaffenen Durchschnitt z Projektion. Dies unterstreicht Exozytose - Ereignisse (2A Inset 2 - 3).
    2. Graf Exozytose-Fusionsereignisse mit dem Auge. Exozytose - Ereignisse werden als das Auftreten eines beugungsbegrenzten Fluoreszenzsignal definiert , das schnell diffundiert als VAMP2-phluorin diffundiert innerhalb der Plasmamembran (2A Inset 6).
    3. Verwenden Sie den Befehl Schwellenwert das erste Bild unter Verwendung von Bild zu markieren> Anpassen> Schwelle> einstellen Regler , bis die gesamte Zelle Schwelle markiert (2A Inset 7 - 8).
    4. Unter AnaLyze, wählen SetMeasurements und überprüfen Bereich und Anzeige Etikett. Wählen Sie den schwellenZellBereich mit dem Zauberstab - Tracing - Tool und klicken Sie auf 'm' zu messen (2A Inset 7 - 8).
    5. Transfer - sowohl die Exozytose - Fusionsereignisse zählen, die Zellbereichsmessungen und die verstrichene Abbildungszeit in ein Tabellenkalkulations Anzahl von Exozytose - Ereignisse / mm ² / Zeit (2A Inset 9) zu berechnen.

4. Differentialinterferenzkontrast (DIC) Timelapse Mikroskopie von Axon Branching

Hinweis: Eine vollständige Protokoll und Demonstration für einen allgemeinen Ansatz zur DIC - Bildgebung ¹² zur Verfügung steht. Während dieses Protokoll DIC nutzt, andere Durchlichtmikroskopie Methoden für die gleichen Zwecke werden können (: Phasenkontrast zum Beispiel) verwendet.

1. Bei 2 DIV, Ort Glasboden Bildgebung Schale untransfizierten Neuronen in vorgewärmten Klimakammer, die eine feuchte env zu haltenironment mit 5% CO ₂ und 37 ° C. Nutzen Sie ein Mikroskop mit einem 60x Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC Objektivlinse und hoher NA Kondensator für beste Bildqualität und Auflösung.
2. Stellen Sie die Fokusebene zu finden Neuronen durch die Okulare Durchlichtbeleuchtung verwendet wird.
3. Mit Hilfe der Multizonen-Erfassungsfunktion auf Imaging-Software, zu finden und die XYZ-Positionen von mindestens 6 Zellen speichern. Positionieren Sie die Bühne, so dass Neuronen von Interesse passen in das Sichtfeld für die besten Ergebnisse.
   1. Stimulieren Sie mit 250 ng / ml Netrin-1 und drücken Sie "Start Multizonen-Akquisition". alle 20 s für 24 Stunden erwerben Sequenziell Bilder an jeder Position, pausieren Erwerb und Refokussierung wie nötig.
4. Überprüfen Sie Bilder in Imaging-Software Apps verwenden> Überprüfen Sie Multi Dimensional Daten> öffnen Dateinamen. Identifizieren stabiler Axon Zweige (20 & mgr; m lang), dass Form während der Imaging-Sitzung. Verwenden Sie die Linienzeichenwerkzeug eine stableaxon branc zu messenh von der Basis an der Axon an der Spitze, um sicherzustellen, die 20 & mgr; m Länge Qualifikation erfüllt ist.
   1. In einer Tabelle, die Rahmennummer nach Netrin Stimulation aufzuzeichnen, wenn Membranausstülpungen in Bereichen initiieren, wo Äste später sowie die Rahmennummer nach Netrin Stimulation bilden, wenn sie im Entstehen begriffenen Zweige 20 & mgr; m in der Länge erreichen.
   2. Multiplizieren Sie die Anzahl der Frames zwischen Vorsprung und Zweigbildung um 20 sec die Bildungszeit pro Zweig zu berechnen.

5. Toxin Manipulations und fixierte Zell Immunofluoreszenz

1. Bei 2 DIV, behandeln Neuronen in Versuchsbedingungen mit 250 ng / ml Netrin-1 und / oder 10 nM Botulinum A - Toxin (BoNT), die spaltet die SNARE - Protein SNAP25 und SNARE wirksam hemmt Exozytose ^13, plus 250 ng / ml netrin- 1. Lassen Sie eine Reihe von unbehandelten Neuronen als Kontrollbedingung.
   ACHTUNG: BoNTA erfordert den Einsatz von Augen und Atemschutz bei Herstellung und VerwendungLösungen. Pflegen Sie alle kontaminierten Materialien als infektiöses Material und Autoklaven so schnell wie möglich.
2. Bei 3 DIV (24 Stunden nach der Behandlung) absaugen Medien und sofort mit mindestens 1 ml PHEM fix (siehe Tabelle 1 für weitere Details) ersetzen erwärmt auf 37 ° C. Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei RT.
3. Spülen Sie 3x mit PBS (für die zukünftige Verwendung Dichtung mit Parafilm und lagern bei 4 ° C).
4. Ort Deckgläser in dunklen, befeuchteten Färbung Kammer und Permeabilisierung der Zellmembranen für 10 min in frisch verdünnten 0,2% TritonX-100 in PBS (hergestellt aus 10% TritonX-100-Lager).
5. Entfernen Permeabilisierung Lösung und Spülen mit 50 ul 1x mit PBS. Block für 30 min in ~ 50 & mgr; l von 10% Rinderserumalbumin in PBS (BSA-PBS) oder 10% Gekochte Eselserum in PBS bei RT.
6. Spülen Sie mit 1x PBS wieder. Inkubieren Deckgläser in 50 & mgr; l des primären Antikörpers: in 1% BSA-PBS für 1 h bei RT (1 1.000 βIII Tubulin, neuronale Identität zu bestätigen), im Dunkeln.
7. Führen Sie 3x 5 min Waschen in PBS. Inkubieren Deckgläser in 50 ul spektral unterschiedliche Sekundärantikörper für Tubulin (1: 400), und Fluoreszenz Phalloidin (je nach Anregung: 488 Phalloidin bei 1: 400, 647 Phalloidin bei 1: 100) in 1% BSA-PBS für 1 Stunde .
8. Waschen 3x 5 min in 1x PBS und montieren Deck auf Objektträger in Montage Medien.
9. Vakuum überschüssige Eindeckmedien von den Rändern des Deckglases und Dichtung mit klarem Nagellack.
10. Sammeln Sie Weitfeld- Epifluoreszenz- Bilder auf einem inversen Mikroskop mit einem 40x 1.4NA Ziel, epifluoreszenten Fähigkeiten und EM-CCD.
    1. Manuell analysieren ImageJ Verzweigung verwenden. Öffnen Bildstapel in ImageJ indem Sie die Datei in das Fenster ziehen oder auf Datei> Öffnen> Dateiname (Abbildung 4A Einschub 1).
    2. Mit line> segmentierte Linie, verfolgen Sie die Axon, als die längste Neuriten erstreckt definiert von der soma (4A Einschub 2 - 3).
    3. Mit Analysieren> Tools> ROI-Manager, speichern Sie die Axon als eine Region von Interesse zu verfolgen. Trace und jedes Axon Zweig speichern, definiert als Neuriten ≥20 & mgr; m in der Länge. Nur primäre Zweige (Auswüchse direkt aus dem Axon sprießen) in der Analyse (Abbildung 4A Einsatz von 3 bis 4).
    4. Drücken Sie 'm' die gespeicherten Bereiche von Interesse zu messen und übertragen Längen in Pixeln in eine Tabelle, die Länge in & mgr; m zu berechnen.
    5. Unterteilen, die Anzahl der Zweige axon ≥20 um in der Länge, um die Länge des Axons in & mgr; m geteilt durch 100 Anzahl der Axon Verzweigungen pro 100 & mgr; m Länge erhalten.

Ergebnisse

Verwendung in vitro biochemischen Techniken , um die Menge von SDS-resistenten SNARE - Komplexe in einer Population von Neuronen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt die resultierende Western - Blot nach Beendigung der SDS-resistenten SNARE - Komplex Assay für SNAP-25 sondiert, syntaxin1A und VAMP2.

TIRF - Mikroskopie an der basalen Zellmembran liefert hochauflösende Bilder von einzelnen Exozytose - Fu...

Diskussion

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011