Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Resumen

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Resumen

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Introducción

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

Protocolo

Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento están sujetos a las reglas y regulaciones del Comité de Cuidado de Animales UNC y con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación y revestimiento del disociada de las neuronas corticales

1. La eutanasia a las mujeres embarazadas oportunas por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical. Retire todo el cerebro de los cráneos de embriones día 15.5 (E15.5) ratones y microdissect cortezas de cada hemisferio. Para obtener instrucciones detalladas relativas a la microdisección de la corteza de embriones de ratón consulte Viesselmann et al ^8.
2. Colocar no más de 4 cortezas en 1 ml de medio de disección estéril en un microtubo de 1,6 ml. Añadir 120 l de 10x tripsina y se invierte el tubo de 3 - 5 veces para mezclar.
3. El uso de un hemocitómetro, contar las células para sembrar placas de cultivo celular. Nota: 1 hemisferio cortical proporciona aproximately tres millones de células.
   1. Para el ensayo de la bioquímica complejo SNARE SDS-resistente, placa de seis millones de células por placa de 35 mm y utilizar dos platos por condición. Nota: Esto se simplifica mediante el uso de placas de 6 pocillos al comparar varias condiciones.
   2. Para los ensayos de ramificación, las neuronas de placas en ácido nítrico lavaron los cubreobjetos circulares a una densidad de 250.000 células por placa de 35 mm, por DIC imágenes de axón de ramificación placa a una densidad de 150.000. Estas densidades de evitar el hacinamiento y simplificar el análisis.
4. Para la microscopía TIRF vivo de células, volver a suspender dos millones de neuronas por transfección en nucleofection solución a temperatura ambiente.
   1. Añadir 100 l de suspensión celular a microtubo que contiene 10 g de VAMP2-pHlourin plásmido de expresión y electroporación con un nucleofector acuerdo con el protocolo del fabricante ^9.
   2. Después de transfecciones añadir inmediatamente 500 l de tripsina temple medios, anular la suspensión de células cubetas y placas en una cuevasidad de 400.000 células por 35 mm de vidrio recubierta con PDL plato inferior.
5. Plate todas las neuronas corticales en 2 ml de medio libre de suero.

2. SNARE Ensayo de Formación de complejos

Nota: los complejos SNARE SDS-resistentes fueron procesados ​​y analizados como se describe originalmente ¹⁰ con las modificaciones que se detallan a continuación. Para los anticuerpos validados alternativos a los que se usan aquí, consulte la sección de materiales.

1. Estimular las neuronas corticales E15.5 2 días in vitro (DIV) con 250 netrina-1 o simulada de control ng / ml durante 1 hora antes de la lisis.
2. Antes de procesamiento de muestras, centrífuga fría a 4 ° C, y ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C, y el bloque de calor a 100 ° C.
3. Sacar los recipientes de células de la incubadora y colocar en hielo.
   1. Aspirar los medios de comunicación a partir de células, reemplazan solución salina tamponada con ~ 2 ml de hielo frío de fosfato (PBS) suavemente 2 veces para 1 - 2 min por lavado.
   2. Para este ensayo, utilizar 2 pocillos por condition.
   3. Aspirar PBS desde el primer pocillo de una condición y reemplazar con 250 l tampón de homogeneización. Deja en hielo durante 5 min, y a continuación, utilizando un elevador de células, homogeneizar las células en hielo.
   4. Aspirar el PBS del siguiente pozo de la misma condición y añadir la mezcla homogeneizada recientemente al pozo. Esto aumentará las concentraciones de proteína. Repita este procedimiento para todas las condiciones.
   5. Al finalizar, la pipeta solución a un pre-enfriado 1,6 ml microtubo homogeneizó en hielo y añadir 20% Triton X-100 para llegar a una concentración final de 1% Triton X-100. Se tritura la mezcla 10 veces con una pipeta 1.000 l minimizando al mismo tiempo las burbujas.
4. Incubar los tubos en hielo durante 2 min para solubilizar proteínas. Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar el material no solubilizado. Mueva sobrenadante lisado en un nuevo tubo de 1,6 ml enfriado en hielo.
5. Realizar un análisis de la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford ¹¹ y diluir las muestras a una final concentración de proteína de 3-5 mg / ml con tampón de homogeneización suplementado con 1% Triton X-100 y 5x tampón de muestra suplementado con B-Mercaptethanol (BME) restante.
6. Divide cada muestra experimental uniformemente en 2 tubos. Incubar una muestra a 37 ° C durante 30 min (complejos SNARE), y el otro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Invertir los tubos de forma intermitente para mantener las muestras en solución.
7. Congelar las muestras a -20 ° C hasta el momento de separar por medio de SDS-PAGE. Antes de ejecutar muestras mediante electroforesis usando técnicas estándar, re-ebullición muestras previamente hervida durante 5 minutos a 100 ° C, pero descongelar 37 ° C las muestras a temperatura ambiente.
8. duplicados serie de muestras (30 - 40 g de proteína por muestra) tanto en un 8% y un 15% en gel; el 8% proporciona la separación ideal del complejo, mientras que el 15% se utiliza para cuantificar monómeros de proteínas SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Mantener la fuente de alimentación a 70 V hasta que la línea de tinte es a través del STACgel de rey y aumento de tensión a 90V. Correr geles hasta que el colorante se escapa.
9. Para preservar monómeros, transferir las proteínas a 0,2 micras membrana de nitrocelulosa en hielo usando tampón de transferencia en frío con 20% de metanol (MeOH) añadido, a 70 V durante 45 min.
10. membrana seca en un recipiente cubierto durante 2 horas a O / N a TA (O / N proporciona los mejores resultados).
11. Bloquear SNARE membranas complejos en 10% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hora a RT.
12. Preparar anticuerpos primarios (que reconocen componentes específicos complejos SNARE) a una dilución de 1: 1000 y la sonda de O / N a 4 ° C en un agitador rotatorio.
    1. Enjuague borrones en Tris Buffered Saline más 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 veces durante 5 min cada uno.
13. Preparar soluciones de anticuerpos secundarios fluorescentes a una dilución de 1: 20.000 en 1% de BSA en TBS-T y la sonda para 1 hr, cubierto a TA. Repita el paso 2.12.1 Después de 1 hora.
14. Las transferencias de imagen en una máquina de escaneo fluorescente equipados con la suite de software y cuantificar tanto la co proteínas SNAREmplex (bandas inmunorreactivas por encima de 40 kDa) y bandas de monómero (bandas inmunorreactivas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para la SNAP-25, VAMP2 y sintaxina-1, respectivamente) utilizando las instrucciones del fabricante para la elaboración de ROI rectangular.

3. Imaging exocytic eventos mediante microscopía TIRF

Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado incluyendo una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y CO _2, un microscopio TIRF invertido equipado con una iluminación epifluorescente, una gran ampliación / alta apertura numérica (NA) objetivo TIRF, una etapa XYZ automatizado, y un detector sensible dispositivo de carga acoplada (CCD). Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado con un objetivo de un sólido de estado 491 nm láser 100x 1.49NA TIRF y un CCD multiplicador de electrones (EM-CCD). Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser. Antes del comienzo del poder protocolo de formación de imágenes en el medio amben materia de medio de cámara, el escenario, la lámpara, el ordenador y la cámara.

1. Elija un objetivo en el software de imágenes. Una vez que el objetivo está en su lugar, fijar el calentador objetivo alrededor del collar.
2. Confirmar que el objetivo es bajado por completo antes de asegurar la incubadora etapa en la ranura etapa. Vierta agua destilada en las entradas de la etapa de la incubadora de manera uniforme para evitar derrames.
3. Encienda el sistema de incubación. Abrir la válvula al depósito de CO ₂ y confirme la presión es adecuado para el sistema según las instrucciones del fabricante. Permitir cámara de un cierto tiempo para alcanzar el 5% de _CO2 y 37 ° C. Antes de añadir el plato de imagen, coloque un plato vacío en la incubadora para evitar la condensación de agua en el objetivo.
4. Energía de la fuente de láser.
5. incubadora de carga abierta y añadir aceite de inmersión de la lente. Coloque la muestra en la incubadora y estabilizar con los brazos de estabilidad o un peso plato. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la parte inferior de la muestra. switch de iluminación de luz transmitida y encontrar plano focal neuronal a través de los oculares.
6. Iniciar el software de láser y conectar con el software de control de láser. iluminación de campo amplio y seleccionar el objetivo que se usa set (100X 1.49 NA TIRF se recomienda). Cambiar el índice de refracción de la muestra (células ~ 1,38). Ajustar la intensidad del láser desmarcando "TTL" para el láser de 491 nm. Ajuste el control deslizante a 100 y luego traerlo de vuelta a un valor entre 20 - 40%. Vuelva a revisar "TTL".
7. Centrarse en la muestra de nuevo en la iluminación de luz transmitida. Ir al software de imagen y seleccione iluminación láser 491 nm y obturador abierto. Fine ajustar el punto focal del láser en el techo y centrar el punto al centro del diafragma campo cerrado con el condensador eliminado. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico, de manera que no lente de cero.
8. Reemplazar el condensador y vaya al software TIRF y establecer la profundidad de penetración (PD) a 110 nm. Interruptor de la iluminación de campo amplio de Illum TIRFmodo minación para formación de imágenes.
9. Encuentra VAMP2-pHluorin las células que expresan a través de los oculares de campo amplio uso de epifluorescencia con fuente de luz de epifluorescencia.
   1. Ajustar los parámetros de imagen (tiempo de exposición, la ganancia y la potencia del láser) para maximizar la relación señal-ruido y rango dinámico utilizando el tiempo de exposición mínima y la intensidad del láser para reducir photobleaching y fototoxicidad (por ejemplo: una exposición de entre 50 - 100 ms, con un 15 - 30 obtener al 30% como máximo la potencia del láser).
   2. Ajuste de enfoque automático continuo por célula. Adquirir una imagen de conjunto con Timelapse de adquisición se produce cada 0,5 segundos durante 5 minutos. Para la condición de netrina-1 estimulada, añadir 500 netrina-1 ng / ml a placa de células en una campana de flujo laminar y devolver el plato a la incubadora durante 1 h antes de la formación de imágenes.
10. Para cuantificar la frecuencia de eventos exocytic normalizados por área de la celda y el tiempo, las pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura0; 2A recuadro 1).
    1. Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, cree una proyección promedio z de toda la pila usando Imagen> Pila> Z-Proyecto> Tipo de proyección: Intensidad Media. Restar esta imagen media de cada imagen en el timelapse usando procesos> Calculadora de imágenes> Imagen1: Operación su pila: restar Image2 proyección z promedio de nueva creación. Esto pone de relieve los acontecimientos exocytic (Figura 2A de la inserción 2 - 3).
    2. Contar los eventos de fusión exocytic por ojo. Eventos exocytic se definen como la aparición de una señal de fluorescencia de difracción limitada, que se difunde rápidamente como VAMP2-pHluorin se difunde dentro de la membrana plasmática (Figura 2A recuadro 6).
    3. Utilice el comando Umbral para resaltar la primera imagen usando Imagen> Ajustar> Umbral> ajustar el control deslizante hasta que toda la célula es resaltada umbral (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
    4. bajo Analizar, seleccionar y comprobar SetMeasurements área y etiqueta de visualización. Seleccione el área celular de umbral utilizando la herramienta varita rastreo y presione 'm' para medir (Figura 2A Recuadro 7 - 8).
    5. Mezclar las dos cuentan los eventos de fusión exocytic, las mediciones de área celular, y el tiempo transcurrido de imágenes a una hoja de cálculo para calcular el número de eventos exocytic / ^mm2 / hora (Figura 2A recuadro 9).

4. contraste de interferencia diferencial (DIC) Timelapse Microscopía de Axon ramificación

Nota: Un protocolo completo y demostración de un enfoque general de formación de imágenes DIC está disponible ^12. Mientras que este protocolo utiliza DIC, otros métodos de microscopía de luz transmitida pueden utilizarse para los mismos fines (por ejemplo: de contraste de fase).

1. A las 2 DIV, el plato de cristal lugar de imágenes de fondo que contiene las neuronas transfectadas en cámara ambiental pre-calentado para mantener un env húmedoironment con 5% de _CO2 y 37 ° C. Utilizar un microscopio equipado con un Plan de 60X-Apocromático, 1.4 lente objetivo NA DIC y alta del condensador NA para la mejor calidad de imagen y resolución.
2. Ajustar el plano focal para encontrar las neuronas a través de los oculares utilizando iluminación de luz transmitida.
3. Uso de la función multi adquisición zona en software de imágenes, encontrar y salvar a los lugares XYZ de al menos 6 células. Coloque el escenario para que las neuronas de interés quepan dentro del campo de visión para obtener los mejores resultados.
   1. Estimular con 250 ng / ml netrina-1 y pulse 'iniciar la adquisición de múltiples área'. adquirir imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, haciendo una pausa adquisición y reorientación como sea necesario.
4. Revisar las imágenes en el software de imágenes utilizando Aplicaciones> revisión de datos> nombre de archivo abierto Multi Dimensional. Identificar las ramas del axón estables (20 m de largo) que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de línea de drenaje para medir una branc stableaxonh desde la base en el axón hasta la punta para asegurar que se cumpla la longitud de calificación de 20 micras.
   1. En una hoja de cálculo, registre el número de trama después de la estimulación netrina cuando protuberancias de la membrana inician en zonas en las ramas más tarde forman, así como el número de trama después de la estimulación netrina cuando nacientes ramas alcanzan los 20 m de longitud.
   2. Multiplicar el número de fotogramas entre la protrusión y la formación de la rama por 20 segundos para calcular el tiempo de formación por cada rama.

5. Las manipulaciones toxina y Inmunofluorescencia teléfono fijo

1. A las 2 DIV, el tratamiento de las neuronas en condiciones experimentales con 250 ng / ml netrina-1 y / o 10 nM de toxina botulínica A (TBA), que escinde la proteína SNARE SNAP25 y efectivamente inhibe la exocitosis mediada por SNARE ^13, más 250 ng / ml netrin- 1. Deja un conjunto de neuronas no tratadas como condición de control.
   PRECAUCIÓN: BoNTA requiere el uso de protección ocular y respiratoria cuando la preparación y usosoluciones. Mantener todos los materiales contaminados como material de riesgo biológico y autoclave tan pronto como sea posible.
2. A las 3 DIV (tratamiento post 24 h) medios de aspirado, y vuelva a colocar inmediatamente con al menos 1 ml de solución PHEM (véase la Tabla 1 para más detalles) se calienta a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
3. Enjuagar 3 veces con PBS (para una futura utilización del sello con parafilm y se almacena a 4 ° C).
4. Coloque los cubreobjetos en la cámara de tinción oscura, humidificado y permeabilizar las membranas de las células durante 10 min en recién diluido 0,2% Triton X-100 en PBS (hecho de 10% Triton X-100 de valores).
5. Retire la solución de permeabilización y enjuague con 50 l de 1x con PBS. Bloquear durante 30 min en ~ 50 l de 10% de albúmina sérica bovina en PBS (BSA-PBS) o 10% hervidos burro suero en PBS a RT.
6. Enjuague con 1x PBS de nuevo. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo primario (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar la identidad neuronal) en 1% BSA-PBS durante 1 hora a RT, en la oscuridad.
7. Realizar 3 x 5 min lavados en PBS. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo secundario espectralmente distinta de la tubulina (1: 400), y faloidina fluorescente (varía por excitación: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina en 1: 100) en 1% BSA-PBS durante 1 hr .
8. Lavar 3x 5 min en 1 x PBS y montar los cubreobjetos sobre portaobjetos en medio de montaje.
9. el exceso de vacío del material de montaje de los bordes del cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas transparente.
10. Recoger las imágenes de campo amplio de epifluorescencia en un microscopio invertido con un objetivo de 40X 1.4NA, las capacidades de epifluorescencia y EM-CCD.
    1. analizar manualmente ramificación usando ImageJ. Pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo> Abrir> Nombre de archivo (Figura 4A recuadro 1).
    2. El uso de la línea> línea segmentada, trace el axón, que se define como la neurita más larga que se extiende desde el soma (Figura 4A recuadro 2 - 3).
    3. Utilizando Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión, guardar el axón de rastreo como una región de interés. Rastrear y guardar cada rama axón, que se define como una de las neuritas ≥20 micras de longitud. Incluir ramas solamente primarios (excrecencias que brotan directamente desde el axón) en el análisis (Figura 4A inserción 3-4).
    4. Pulse 'm' para medir las regiones guardados de interés, y la transferencia de longitudes en píxeles a una hoja de cálculo para calcular la longitud en cm.
    5. Se divide el número de ramificaciones del axón ≥20 micras de longitud, por la longitud del axón en micras dividido por 100 para obtener el número de ramificaciones del axón por 100 m de longitud.

Resultados

Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensayar la cantidad de complejos SNARE SDS-resistentes en una población de neuronas. La figura 1 muestra la transferencia de Western resultante después de la terminación de la SNARE complejo de ensayo SDS-resistente probaron para SNAP-25, y Sintaxina1A VAMP2.

Microscopía TIRF en la membrana celular basal proporciona imágenes de alta resolución de l...

Discusión

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011