تصميم والتعبئة والتغليف، وتسليم العليا العيار الحجمي كريسبر الرجعية وLentiviruses عبر التجسيمي الحقن

Summary

يوفر نظام / Cas9 كريسبر القدرة على جعل الجينوم استهدفت تحرير سهولة وبأسعار معقولة للمجتمع العلمي. ويهدف هذا البروتوكول إلى شرح كيفية إنشاء الفيروسات التي سوف بالضربة القاضية جين الاهتمام باستخدام نظام / Cas9 كريسبر، ثم ضخها stereotaxically في دماغ الفأر الكبار.

Abstract

Replication defective lentiviruses or retroviruses are capable of stably integrating transgenes into the genome of an infected host cell. This technique has been widely used to encode fluorescent proteins, opto- or chemo-genetic controllers of cell activity, or heterologous expression of human genes in model organisms. These viruses have also successfully been used to deliver recombinases to relevant target sites in transgenic animals, or even deliver small hairpin or micro RNAs in order to manipulate gene expression. While these techniques have been fruitful, they rely on transgenic animals (recombinases) or frequently lack high efficacy and specificity (shRNA/miRNA). In contrast, the CRISPR/Cas system uses an exogenous Cas nuclease which targets specific sites in an organism's genome via an exogenous guide RNA in order to induce double stranded breaks in DNA. These breaks are then repaired by non-homologous end joining (NHEJ), producing insertion and deletion (indel) mutations that can result in deleterious missense or nonsense mutations. This manuscript provides detailed methods for the design, production, injection, and validation of single lenti/retro virus particles that can stably transduce neurons to express a fluorescent reporter, Cas9, and sgRNAs to knockout genes in a model organism.

Introduction

لدراسة أساس من علم وظائف الأعضاء الطبيعي وعلم الأمراض، هناك حاجة إلى التعامل بدقة التعبير الجيني في الكائنات نموذج. للكائنات نموذج الثدييات، ويتركز هذا إلى حد كبير على إنشاء وتطوير الفئران المعدلة وراثيا حيث يحيط عنصر وراثي من الفائدة عن طريق مواقع معترف بها من recombinase. هذا يمكن أن يؤدي إلى التلاعب بكل موقع من هذه الجينات يحيط. في حين أن هذا كان استراتيجية ناجحة، فقد حان الوقت والموارد مكثفة. على سبيل المثال، وخلق الحيوانات المعدلة وراثيا الثلاثي التي من شأنها التعبير عن الجينات floxed، لجنة المساواة العرقية recombinase، وجين مراسل لجنة المساواة العرقية يتطلب التزاوج متعددة والتحقق من الصحة. في المقابل، فإن حقن التجسيمي النسخ المتماثل الجسيمات الفيروسية المعيبة ترميز البروتين الفلوري وrecombinase إلى حيوان الجينات floxed لا يتطلب التنميط الجيني معقدة أو استراتيجيات التربية ^1. وعلاوة على ذلك، إذا كان البروتين الفلوري ولجنة المساواة العرقية معربا عن الفيروس شارك حقنه مع ENCO فيروس الثانيدينغ بروتين فلوري مختلفة، ثم وهذا يوفر السيطرة داخل الأنسجة للتلاعب الجيني المستهدفة. بينما هذه الاستراتيجية لا يزال يتطلب استخدام الحيوانات تدق في واستراتيجيات RNA مقرها بوساطة فيروسي تحايل على الحاجة إلى حيوانات معدلة وراثيا. على سبيل المثال، حقن التجسيمي من الفيروسات تكرار نقص تكود بروتين فلوري والحمض النووي الريبي قصيرة دبوس (shRNA) يمكن استخدام الآلات رني الذاتية للخلية أن يؤدي إلى انخفاض قوي للنسخة من الجين من الفائدة. ومع ذلك، استراتيجيات shRNA تنتج الجينات خفية تدق هبوطا في كثير من الأحيان مما أدى إلى الظواهر الخلوية المتواضعة ^2. في حين أن تدق إلى أسفل قد يكون أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لمعالجة العجز الجينات متخالف، متانة في انخفاض مقارنة لالضربة القاضية، ليست مثالية لاكتشاف المظهري للجينات جديدة.

وهناك تقنية الثالثة التي ظهرت في الآونة الأخيرة، وكريسبر (مجمع Interspaced بانتظام كرر المتناوب قصير) / Cas9 (كريسبر المصاحبالبروتين 9) النظام، تعتمد على التعبير عن كل من الحمض النووي الريبي خارجي صغير وإنزيم قطع الحمض النووي. تم تعديل نظام / Cas9 كريسبر من نظام المناعة في بدائيات النواة التي تطورت وسيلة لتحديد أجنبي، غزو الحمض النووي من الفيروسات واستهداف ذلك لتدهور عن طريق انزيم Cas9 ^3،4. هذا قوية تقنية تحرير الجينوم يمكن استخدامها لخلق الحذف المستهدفة، الملاحق، والطفرات. وبروتوكول التالية سيوضح كيفية جعل الحذف في الجينات في المصالح من أجل خروج المغلوب التعبير في الجسم الحي. يجب أعرب انزيم Cas9 مع الحمض النووي الريبي دليل مثلي إلى المنطقة من اهتمام ومتجاورة مع RNA سقالة. خروج المغلوب من الجين باستخدام هذه التقنية يتطلب استهداف Cas9 إلى منطقة معينة في الجينوم باستخدام الرنا دليل الاصطناعية (sgRNA)، وحمل فواصل المزدوج تقطعت بهم السبل (DSBs) في موقع من الفائدة. ثم يتم إصلاح هذه DSBs بواسطة آلية خلية إصلاح الذاتية عن طريق غير مثلي (NHEJ)، الانضمام نهاية التي جنيهإعلان لindels التي قد تنتج مغلطة أو هراء الطفرات وبالتالي يمكن إنشاء فقدان بروتين تعبير وظيفي ^5. لأن هذا النظام ينتج التعديلات الجينوم، فإنه يتطلب فقط التعبير عابرة للCas9 وsgRNA. ومع ذلك، فمن المستحسن لمؤشر الفلورسنت مستقر لتحديد الخلايا وذريتها التلاعب بهذه الطريقة.

Lenti- والفيروسات لديها ميزة دمج مستقر الحمض النووي للاهتمام في الخلايا المضيفة التي تحافظ على التعبير على المدى الطويل، وتنتقل إلى الخلايا الوليدة أثناء الانقسام. يصف هذا البروتوكول تصميم وإنتاج نوعين من تكرار معيب، الفيروسات القهقرية عيار عالية: فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة الجسيمات lentiviral (الفيروسة البطيئة) وتلك القائمة على الفئران مالوني اللوكيميا فيروس (الارتجاعي). في حين أن كلا من هذه الفيروسات قادرة على دعم معربا مستقرة من الجينات المحورة كبيرة، يمكن للجسيمات فيروس الاندماج في الجينوم دو فقطانقسام الخلايا حلقة مع تدهور الغلاف النووي، وبالتالي يمكن أن تستخدم كأداة لتسمية والخلايا الولادة تاريخ ^6. في حين lentiviruses لها سمعة لكونها منخفضة نسبيا عيار ^7، هذه المنهجية، بما في ذلك استخدام الكافيين ⁸ خلال جمع الفيروسي، وتنتج بشكل روتيني التتر من 10 ⁹ و 10 ¹⁰ الجسيمات / مل. ميزة أخرى لlenti- والفيروسات هي التسامح لإدراج كبيرة جدا. مجموعة التالية من بروتوكولات يحدد الإجراء لتصميم lenti أو الارتجاعي ترميز مراسل فلوري، sgRNAs، وCas9 للاستفادة من كريسبر نظام / Cas9 لتعديل الحمض النووي وكذلك التعبير عن بروتين فلوري.

الماوس جراحة المخ والأعصاب التجسيمي هو طريقة قيمة لحقن الفيروسات في الجسم الحي لدراسة التشكل، وظيفة، والتواصل بين الخلايا العصبية المصابة. عدوى فيروسية في الخلايا العصبية يمكن استخدامها لمعالجة مستويات التعبير على مدى فترة طويلة من تيمالإلكترونية، مثل جميع أنحاء التنمية، والتعبير يمكن أن تسيطر على وجه التحديد من خلال استخدام مختلف النظم محرض المخدرات وتحديدا لجنة المساواة العرقية التعبير مدفوعة. يشرح هذا بروتوكول معين كيفية حقن فيروس إبداء sgRNA وCas9 إلى بالضربة القاضية جين من الفائدة في دماغ فأر بالغ. الفئران على التعافي بسرعة جدا من هذا الإجراء والتعبير عن التحوير فيروسية يمكن أن ينظر إليه غضون 48 ساعة بعد الحقن. ومع ذلك، يظهر التعبير fluorophore زيادة على مدار أسابيع مما أدى إلى المستويات القصوى القريب من 3 أسابيع بعد الإصابة. الفئران التي تخضع لحقن التجسيمي فيروسية يمكن أن تستخدم في السلوك، الكهربية، أو الدراسات المورفولوجية. وعموما، فإن الغرض من هذه الإجراءات هو شرح كيفية بالضربة القاضية جين في دماغ الفأر الكبار باستخدام جراحة التجسيمي وفيروس تعبر عن sgRNA محددة وCas9.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي دارتموث السلامة الأحيائية المؤسسية والمؤسسات ورعاية الحيوان واللجنة الاستخدام مجالس المراجعة.

1. بروتوكول لتصميم دليل ستراند (sgRNA) لكريسبر / Cas9 الارتجاعي

ملاحظة: هناك العديد من المواقع التي لا تستهدف الربح والتي يمكن استخدامها لتوليد sgRNAs لاستهداف الجينات في المصالح (https://benchling.com/ وhttp://crispr.mit.edu/). والهدف من هذا البروتوكول هو تصميم وتأمر oligos الذين تقطعت بهم السبل واحدة من بائع التجارية التي صلب لبعضها البعض. سيتم ligated هذا بنسبة ضئيلة صلب في ناقلات نقل PXL. انظر التكميلي فيديو 1 للحصول على مثال من تصميم sgRNAs باستخدام Benchling.

1. استخدام موقع مخصص لتصميم sgRNAs.
   ملاحظة: على سبيل المثال، إدخال والترميز / تسلسل exonic من قرب بدء الجين من الفائدة في الموقع سوف تولد sgRNA 20 النوكليوتيدات. استخدام تسلسل sgRNA 20 النوكليوتيدات لتصميم إحساس ومكافحة الشعور بنسبة ضئيلةالصورة التي من شأنها أن يؤمر لإنشاء sgRNA.
2. بعد توليد sgRNA، نسخ هذا التسلسل في معالج النصوص. إضافة G (جوانين) إلى بداية تسلسل sgRNA 20 النوكليوتيدات في الوثيقة اذا لم تبدأ بالفعل مع واحد (أي، G-20 النوكليوتيدات تسلسل sgRNA). وهذا أمر ضروري لضمان النسخ جيد من المروج U6.
3. توثيق تكملة العكسي من هذا الآن 20-21 تسلسل النوكليوتيدات. لجزئية المعنى، إضافة "CACC" إلى نهاية 5 'من تسلسل في الوثيقة (أي CACC-G-20 النوكليوتيدات sgRNA تسلسل). وسيتم استخدام هذا عبء على ligate التسلسل في ناقلات PXL.
4. للبنسبة ضئيلة العقاقير، إضافة AAAC إلى "نهاية 5. استخدام هذا عبء على ligate التسلسل في ناقلات PXL.
5. الحصول على شعور والعقاقير oligos. بعد تلقي oligos، وجعل 100 ميكرومتر الأسهم باستخدام الدناز المياه مجانا. مزيج معا 10 ميكرولتر من كل 100 ميكرومتر معنى والعقاقير oligos مع 4 μلتر من 10X نب العازلة 2، و 16 ميكرولتر من الماء.
   ملاحظة: انهم لا يحتاجون الى تنقية الصفحة أو 5'phosphorylation (كما يتدلى BBSI هي نهايات متماسكة غير متوافقة).
   1. جلب 200 مل من الماء ليغلي في كوب 500 مل، ثم تطفو أنبوب يحتوي هذا الخليط في رغوة حامل "العوام". السماح للمياه لتبريد ببطء من 95 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   2. تمييع مزيج الآن مطوع-جزئية 1: 1000 في الماء المعقم واستخدامها على الفور في ربط التالية أو تخزين رد فعل المتبقية في -20 درجة مئوية.
6. ملخص PXL، وهو مشتق ناقلات PX330، مع انزيم تقييد BBSI عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. استخدام رد فعل 40 ميكرولتر تحتوي على 2 ميكروغرام من PXL، 4 ميكرولتر من 10X نب العازلة 2، 1 ميكرولتر من Bbs1 والمياه العمومية. إخضاع-PXL هضمها لتنقية هلام الروتينية باستخدام طقم التجارية. تأكد من أن العائد ~ 8.5 كيلوبايت المنتج.
7. استخدام عدة ربط التجارية، ligate 1 ميكرولتر من 1: 1000مطوع-oligos مع 50 نانوغرام من هضمها وهلام تنقية-PXL. تحويل المنتج ربط إلى إعادة التركيب المختص ناقصة E. القولونية (نب 5-ألفا، استنساخ فرعي الكفاءة). يحجب transformants لوجود دليل على صحتها تسلسل الحمض النووي البلازميد.
8. هضم U6، دليل حبلا، وعناصر RNA سقالة (sgRNA) من PXL باستخدام BstB1 وPac1 أنزيمات التقييد وligate في البروتين T2A-Cas9 العمود الفقري الفيروسي الفلورسنت يتفاعل مع نفس الانزيمات قيود. تحويل المنتج ربط (نب 5-ألفا كحد أقصى كفاءة). البروتين-T2A-Cas9 البلازميدات العمود الفقري الفيروسي الفلورسنت منخفضة البلازميدات نسخة ويجب استخدام بروتوكولات نسخة هكذا منخفضة.
   ملاحظة: sgRNA الثانية ويمكن إدخال مماثل باشي هضم PXL دليل حبلا البلازميد آخر وligated في Pac1 هضمها والعجل المعوية الفوسفاتيز علاج العمود الفقري الفيروسي تحتوي بالفعل أول حبلا دليل. والعلاج الفوسفاتيز من البلازميد نقل الفيروسية يساعدتقليل عدد transformants من ربط الذاتي من البلازميدات لا تحتوي على دليل الثاني.
9. تسلسل التحقق النهائي البلازميد وماكسي الإعدادية باستخدام Nucleobond إكسترا عدة ماكسي الإعدادية وحزمه الى فيروس باستخدام "بروتوكول ريترو / Lentiviral الإنتاج - CaPO4 أسلوب" التالية.

2. إعداد 293FT / 293GP الخلايا لترنسفكأيشن (ريترو / Lentiviral الإنتاج - CaPO4 الطريقة)

1. (يوم 1) ذوبان الجليد بسرعة 1 قارورة من الخلايا لكل 10 سم لوحة ثقافة خلية في حمام مائي 37 درجة مئوية. التعبئة lentiviral، استخدم 293FT الخلايا. للتغليف فيروسات، استخدم 293GP (هفوة / بول) الخلايا.
2. ماصة جميع خلايا إذابة من أنبوب البرد إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة 2 مل من قبل حرارة CO ₂ معايرتها الكامل Iscove في التعديل المتوسطة Dulbecco و.
3. خلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 x ج لتكوير. نضح في وطاف resuspend الكرية خلية في 10 مل من كاملةفي كوف التعديل Dulbecco والمتوسطة. لوحة الخلايا على 10 سم طبق ثقافة الخلية. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
4. (يوم 2) 24 ساعة بعد الطلاء، وتغيير وسائل الإعلام على لوحة بواسطة الشفط وسائل الإعلام القائمة وإضافة 10 مل من قبل تحسنت متوسطة التعديل Dulbecco Iscove في لوحة.
   1. (يوم 04/03) 24-48 ساعة بعد التغيير وسائل الإعلام، وبمجرد أن الخلايا تصبح متموجة، وتقسيم الخلايا إلى confluency من 2،5-3،0 × 10 ⁶ خلايا / لوحة (10 سم لوحة).
   2. لتقسيم الخلايا، ونضح وسائل الإعلام وغسل لوحة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين إلى لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا رفع قبالة لوحة. إضافة 0.5 مل من متوسط ​​المعدل Dulbecco Iscove في لتحييد رد فعل 0.25٪ التربسين وماصة للخلايا في أنبوب 1.5 مل.
   3. تدور الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في 1 مل من Iscove في التعديل المتوسطة Dulbecco و. تمييع 1081؛ ل من الخلايا في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا. إعادة لوحة 2،5-3،0 × 10 ⁶ خلايا / لوحة مع كاملة Iscove في التعديل المتوسطة Dulbecco و.
      ملاحظة: ستكون خلايا ~ 50٪ متموجة 24-34 ساعة بعد الطلاء. Transfect الخلايا عندما تكون ~ 50٪ متموجة.

3. (يوم 5) CaPO4 ترنسفكأيشن والفيروسية الجسيمات مجموعة

1. تغيير ساعة وسائل الاعلام 2 قبل ترنسفكأيشن بواسطة الشفط وسائل الإعلام القائمة وإضافة 10 مل من قبل تحسنت التعديل المتوسطة Dulbecco وIscove ل. تأكد من أن هناك بالضبط 10 مل من وسائل الاعلام في لوحة 10 سم.
2. إعداد الكواشف ترنسفكأيشن ل2 الأطباق باستخدام 2، 5 مل جولة أسفل أنابيب البوليسترين. تسمية الأنبوب الأول "DNA" والأنبوب الثاني "2X HBS". ضبط تركيز الحمض النووي ل1μg / ميكرولتر في تريس، EDTA في درجة الحموضة 7.4.
   1. لlentiviruses، إضافة ببطء 20 ميكرولتر من ناقلات نقل (وفيرال بناء المصالح)، و 13 ميكرولتر من CMVdelta8.9، 9 ميكرولتر من VSV-ز، 860 ميكرولتر من البيولوجيا الجزيئية الصف H ₂ O، و 100 ميكرولتر من 2.5 M CaCl ₂ إلى الأنبوب الأول ( "الحمض النووي")، بينما التنصت بشكل مستمر على أنبوب إلى المزيج.
   2. لالفيروسات، حذف البلازميد CMVdelta8.9. إضافة 20 ميكرولتر نقل المتجهات، 15 ميكرولتر VSV-ز، 860 ميكرولتر البيولوجيا الجزيئية الصف H ₂ O، و 100 ميكرولتر 2.5 M CaCl ₂ إلى أنبوب المسمى "الحمض النووي".
   3. إضافة 1 مل من مخزنة المالحة HEPES-2X (7.0 درجة الحموضة، وهذا الرقم الهيدروجيني هو في غاية الأهمية) إلى أنبوب المسمى "2X HBS".
   4. ببطء إضافة محتويات 1 مل من أنبوب "DNA" لأنبوب "2X HBS"، قطرة واحدة في وقت واحد. باستمرار الاستفادة من "2X HBS" أنبوب مع المؤشر أو الإصبع الأوسط مع إضافة محتويات أنبوب "الحمض النووي". مراقبة واضحة كابو ₄ الحويصلات بعد كل قطرة. احتضان الأنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. إضافة 1 مل من ترنسفكأيشن في قطرات بطيئة في كل لوحة الخلية 10 سم، ثم احتضان ليلا 37 درجة مئوية.
4. (يوم 6) استبدال وسائل الإعلام مع 8 مل من التعديل متوسط ​​+ 0.5٪ FBS Dulbecco وIscove و 40 الكافيين ملغ / 100 مل وسائل الاعلام. إذا احتوى ناقلات نقل علامة فلوري، ثم يشير التعبير fluorophore على ترنسفكأيشن ناجحة.
5. (يوم 7) جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على الجسيمات الفيروسية باستخدام 10 مل ماصة المصلية والاستغناء إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تخزين 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في 4 درجات مئوية. إضافة 8 مل من 0.5٪ سائل الإعلام FBS إلى كل لوحة.
   1. (اليوم 8) مرة أخرى، وجمع وسائل الإعلام التي تحتوي على جزيئات فيروسية وتتحد مع موسم الحصاد في اليوم السابق في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.

4. تركيز وتنقية من الفيروسات

1. جعل 5X البولي ايثيلين جلايكول 6000 حل عن طريق إضافة 40٪ البولي ايثيلين جلايكول 6000 و 1.5 M كلوريد الصوديوم لده ₂ O. الأوتوكلاف الحل علىدورة السائل لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. ببطء مزيج الحل عند التبريد.
   ملاحظة: سيتم حل يبدأ غائم ثم أصبح واضحا لأنه يبرد.
2. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على كل المجموعات من طاف الفيروسي في 2000 x ج لمدة 10 دقيقة من أجل تكوير المواد غير القابلة للذوبان. تنقية وسائل الإعلام الفيروسية من خلال تصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون منخفض البروتين حقنة ملزمة (PES أو PVDF).
3. إضافة 5X البولي ايثيلين جلايكول 6000 حل إلى وسائل الإعلام (وينبغي أن يكون التركيز النهائي 8٪ البولي ايثيلين جلايكول 6000 و 0.3 M كلوريد الصوديوم). مزيج من قبل قلب الأنبوب عدة مرات (لا الدوامة). احتضان تحتوي على حل البولي ايثيلين جلايكول الفيروسية عند 4 درجة مئوية لمدة 12 ساعة أو أكثر، التعديل في بعض الأحيان.
4. (يوم 9) أجهزة الطرد المركزي في الفيروسية التي تحتوي على البولي ايثيلين جلايكول الحل في 2500 x ج لمدة 45 دقيقة. إزالة والتخلص من طاف وتدور مرة أخرى لمدة 2 دقيقة. مرة أخرى، إزالة والتخلص من طاف.
5. Resuspend وبيليه وذلك بإضافة 320 ميكرولتر منالعقيمة مخزنة المالحة الفوسفات (320 ميكرولتر هي 1/100 ^عشر للحجم الأصلي من وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات التي تم جمعها)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. اختياريا، resuspend وبيليه في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز لمدة 30 دقيقة.
6. بعد إعادة تعليق، بيليه، قسامة فيروس (5-10 ميكرولتر في 0.5 مل أنبوب) وتجميد aliquots في -80 درجة مئوية (تجميد الذوبان أو تخزين عند 4 درجات مئوية والحد بشكل كبير من عيار).
7. عيار الفيروسات باستخدام البروتوكولات القياسية، أي تنفيذ سلسلة تخفيف على طبق من 6 جيدا من خلايا HEK293T ويدويا عد المستعمرات الفلورسنت بعد 48 ساعة.

5. اختبار فعالية من الفيروسات كريسبر

ملاحظة: استنساخ تسلسل باستخدام الخطوات التالية لاختبار لإنتاج فواصل المزدوج حبلا إصلاحه من قبل NHEJ باستخدام خلايا فأر Neuro2A. وهذا له ميزة على المقايسات مساح في أنه يمكن استخدامها لتحديد نسبة الخلايا التي تم تعديلها وطبيعةمن indels الناتجة عن NHEJ.

1. معطف طبق ثقافة الخلية 3.5 سم مع خليط من البروتين هلامي مثل matrigel المخففة 01:50 في Iscove في التعديل المتوسطة Dulbecco وواحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. نضح خليط من البروتين هلامي ولوحة الخلايا Neuro2A.
2. بعد الخلايا Neuro2A تصل إلى 50٪ التقاء، إضافة كريسبر الفيروسة البطيئة أو الارتجاعي في عدد وافر من إصابة 10 (أي 10 الجسيمات الفيروسية لكل خلية).
   ملاحظة: خلايا Neuro2A ليست انيس كما للإصابة وكذلك HEK293 الخلايا، وبالتالي، عدوى واحد لن يؤدي إلى 100٪ من الخلايا إصابتها الفيروسة البطيئة. وعلاوة على ذلك، فإن الفيروس الارتجاعي فقط يصيب تقسيم الخلايا وبالتالي سوف لن يؤدي إلى الإصابة بنسبة 100٪. من أجل تحقيق القريب معدل 100٪ من الإصابة، إضافة الفيروس يمكن أن يتكرر في أيام متعددة، وتقسيم الخلايا حسب الحاجة. بدلا من ذلك، خلايا إيجابية الفلورسنت يمكن أن تكون معزولة باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز. عشرالبريد أنجع وسيلة لتحقيق معدل الإصابة 100٪ مع lentiviruses هو إجراء العدوى واحد متبوعا FACS العزلة. لالارتجاعي، نفذ 4 جولات من العدوى 24 ساعة، وبصرف النظر متابعة من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية العزلة لضمان العدوى بنسبة 100٪.
3. بعد اصابة الخلايا لمدة 1 أسبوع، توسيع الخلايا القريب التقاء على طبق 10 سم، نضح في وسائل الإعلام، وغسل لوحة مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة. إضافة 1 مل من 0.25٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا رفع قبالة لوحة. إضافة 0.5 مل من متوسط ​​المعدل Dulbecco Iscove في لتحييد رد فعل 0.25٪ التربسين وماصة للخلايا في أنبوب 1.5 مل وبيليه الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
4. لعزل الحمض النووي، وإضافة 100 ميكرولتر من 50 هيدروكسيد البوتاسيوم ملي، اعادة تعليق الخلايا، واحتضان عند 95 ° مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد الحل باستخدام 10 ميكرولتر من 1 M تريس، ودرجة الحموضة = 8.0.
5. PCR تضخيم المنطقة المحيطة المنطقة الجينومية مستهدفة من قبل كريسبر sgRNAباستخدام ~ 300 نانوغرام من الحمض النووي معزولة في الخطوة 5.5 باستخدام عالية الدقة PCR مزيج الرئيسي ^4.
6. تشغيل تفاعل PCR على هلام الاغاروز 2.5٪ وهلام تنقية جزء بحجم مناسب باستخدام طقم تنقية هلام مثل مجموعة هلام الانتعاش الحمض النووي. Ligate إلى استنساخ ناقلات PCR مثل pGem-ر-سهلة وتتحول إلى خلايا المختصة ^9.
7. بعد 24 ساعة، إضافة 2 مل من مرق LB إلى 15 مل أنابيب القاع جولة وكذلك المضادات الحيوية المناسبة (الأمبيسلين، النيومايسين، وما إلى ذلك). تطعيم أنبوب مع مستعمرة الفردية باستخدام طرف ماصة معقمة أو حلقة لتحديد مستعمرة واحدة من LB لوحة. التوسع والنمو المستعمرة عن طريق هز أنبوب في 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تكرار لأكبر عدد ممكن من المستعمرات كما تريد.
   1. باستخدام مجموعة مصغرة الإعدادية، عزل الحمض النووي من E. القولونية وتسلسل مع الاشعال تهدف إلى تضخيم مجال الجينات المستهدفة من قبل sgRNA من أجل تحليل المنطقة Cas9 المستهدفة من جينوم الفأر.

6. التجسيمي بروتوكول حقن للماوس الكبار

1. التحضير للجراحة
   ملاحظة: من المهم للحفاظ على ظروف معقمة خلال عملية جراحية البقاء على قيد الحياة. ويتم إنجاز ذلك في هذا البروتوكول من قبل الحرارة تعقيم أدوات الجراحة، وذلك باستخدام betadine لتعقيم الحقن، وإضافة مرهم مضاد حيوي لموقع شق بعد أن يتم إغلاقه. ومن المهم أيضا أن استخدام قفازات معقمة وكذلك تعقيم دقيق، منطقة مخصصة للجراحة.
   1. تعقيم الحرارة معدات لجراحة قبل استخدامها من قبل أي من التعقيم أو استخدام الساخن معقم حبة. إعداد غرفة الإنعاش ومنطقة الجراحة عن طريق تشغيل منصات التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة والإنعاش. تجميع الحفر المستخدمة في إنشاء ثقوب في الجمجمة للحقن.
   2. تحميل 4 ميكرولتر من الفيروس في إبرة الحقن عن طريق سحب الفيروس مباشرة من الأنبوب PCR العقيمة. لفترة وجيزة إزالة قسامة الفيروسية من الجليد. الحفاظ على فيروسفي حقنة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 1 ساعة قبل الحقن.

7. التجسيمي الحقن

1. تأكد من أن التهوية إلى جناح جراحة مفتوحة لضمان تدفق الهواء الصحيح. إعداد الماوس لعملية جراحية من قبل التخدير مع 4٪ الأيزوفلورين في غرفة الاستقراء. بعد التخدير، ويحلق رأسه لإعداد موقع الحقن.
   1. ضع الماوس في الصك التجسيمي باستخدام ملاقط لنقل اللسان إلى أسفل وإلى الجانب. إدراج شريط لدغة في الفم حتى تسقط الأسنان في الفتحة، ثم تأمين القضبان الأذن. تأكد من أن الجسم من الماوس على وسادة التدفئة، ويقع الأنف في مخروط الأنف. مباشر 4٪ الأيزوفلورين في مخروط الأنف. تأكيد التخدير بواسطة معسر القدم مع ملاقط وضمان عدم وجود أي رد فعل جفل.
   2. تطبيق الدموع الاصطناعية لتليين العينين. الانتهاء من إعداد موقع الحقن عن طريق المسح وحليق الرأس بالتناوب مع جولات من بوفidone اليود والليدوكائين.
2. باستخدام مشرط، وقطع شق صغير على طول مركز فروة الرأس. تجفيف الجمجمة مع مسحة والهيدروجين بيروكسيد إذا لزم الأمر للمساعدة في تصور bregma.
   1. باستخدام نطاق تشريح، حدد موقع bregma على الجمجمة ووضع رأس الحفر على bregma. صفر (أو سجل) الإحداثيات المجسم الرقمية على الطائرات س، ص، و z.
   2. من أجل التأكد من أن الرأس هو مستوى على منقاري إلى الذيلية العمودي، ضع قليلا الحفر على امدا ومستوى الرأس بحيث ض تنسيق يساوي تقريبا في كل bregma وامدا.
   3. من أجل التأكد من أن الرأس هو مستوى على محور س، ضع مثقاب لص = 1/2 امدا. تأكد من أن ض تنسيق يساوي في 1 ملم على كل جانب (س = +/- 1 ملم) من الدرز السهمي. ضبط الجمجمة إذا كان هناك اختلاف في زي تنسيق في 1mm إلى اليسار واليمين لامدا.
3. ضع الحفر على الإحداثيات المطلوبة. لالتلفيف المسنن، استخدم تنسيقسي = -1.9 من bregma و x = +/- 1.1. قبل الحفر، وانخفاض الأيزوفلورين إلى 2٪، ثم ببطء وبعناية، حفر من خلال الجمجمة.
   1. بعد حفر جميع الثقوب، يضعوا-حقنة مليئة على الصك التجسيمي. تركز بصريا الحقنة خلال ثقب والصفر ض تنسيق في الجمجمة.
   2. انخفاض ببطء المحقنة إلى أعمق ض متعمقة. لالتلفيف المسنن، أعماق ض هي -2.5، -2.4، و-2.3. تبدأ حقن بمعدل 0.25 ميكرولتر / دقيقة باستخدام محقن التجسيمي.
      1. بعد حقن اكتمال عند أدنى Z-العمق، انتظر 1 دقيقة، ثم رفع إلى أخرى تنسيق والبدء في الحقن مرة أخرى. يستمر هذا النمط حتى يتم حقن كل الإحداثيات ض الحقن. الانتظار 2 دقيقة قبل إزالة حقنة بعد آخر حقنة.
         ملاحظة: تم تلاحظ أي تأثيرات سلبية على الأنسجة عن طريق حقن تصل إلى 2 ميكرولتر من الفيروس في نصف الكرة الأرضية في مخ الفأر.
   3. كرر حقن للآبار أخرى.
4. بعد الحقن، وإزالة الماوس من الجهاز التجسيمي وخياطة فروة الرأس مع 6-0 خيوط الحرير. تطبيق يدوكائين وكريم مضاد للبكتيريا على الجرح.
   1. حقن 0،8-1،0 مل المالحة + كيتوبروفين (3-5 ملغ / كلغ) عن طريق IP الطريق لإدارة الألم. ثم ضع الماوس في غرفة الإنعاش ساخنة. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان إلى شركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما.
5. في الأيام التالية للجراحة، وزن الماوس يوميا وتوفير الغذاء لينة ويعامل. تحقق الجرح ونلاحظ حالة عام / سلوك.
6. بعد الحقن التجسيمي، الفئران يمكن أن يتم التخلص لشريحة الإعدادية الكهربية ¹ أو perfused وإزالة عقولهم، مقطعة إلى شرائح، وملطخة عبر المناعية للتحليل ^10.

النتائج

بعد "بروتوكول لتصميم دليل ستراند (sgRNA) لكريسبر / Cas9 الارتجاعي"، يتم إدراج oligos تستهدف تسلسل معين في ناقلات PXL استنساخ المصب من المروج hU6 والمصب من سقالة دليل الحمض النووي الريبي باستخدام مواقع الاستنساخ BBSI (الشكل 1، الخطوة 1). ثم يتم رفعه هذا sgRNA من PXL وإدراجها في العمود الفقري pRubi باستخدام مواقع BstBI وباشي (الشكل 1، الخطوة 2). وأخيرا، المستنسخة sgRNA آخر في PXL يمكن وضعها فى اتجاه مجرى النهر من الدليل الأول في pRubi-Guide1 (الشكل 1، الخطوة 3)، واستهداف منطقة أخرى من الجينات وزيادة فرص بالضربة القاضية عبر NHEJ. وينبغي أن تحدد التحقق من ثوابت صحيحة من خلال تحليل تسلسل. مرة واحدة يتم هذا البناء، ويمكن تعبئتها في الفيروس التالي "بروتوكول للريترو / Lentiviral Production- CaPO4 الطريقة". وأكد التعبئة والتغليف ناجحة عن طريق العدوى من الفيروس في HEK293 الخلايا من أجل عيار الخامسirus. إذا لم يكن هناك تعبير fluorophore ثم إلى احتمال وقوع خطأ أثناء التعبئة والتغليف للفيروس.

الرقم 2 هو نتيجة ممثل من 2 الفيروسات القهقرية، واحد GFP التعبير وغيرها من mCherry التعبير، وشارك في حقن التلفيف المسنن من الماوس حديثي الولادة (7 أيام من العمر) والتقط 21 أيام بعد الحقن. وسم الخلايا العصبية مع mCherry أو GFP يسمح تقييم الصرفي من مختلف التلاعب الجيني في الأنسجة نفسها، حيث الفيروس يمكن للمرء أن تعبر عن كريسبر / Cas9 بوساطة KO والآخر فيروس السيطرة، معربا فقط على fluorophore. حقن التجسيمي يسمح الانتقائية تشريحية دقيقة كما يتبين من العدوى منفصلة للإحداثيات المقصود، التلفيف المسنن. عند تحليل أقسام الدماغ للعدوى، فمن المهم للحفاظ على الأنسجة المحيطة بها حتى أنها عازمة على أن المنطقة التشريحية الصحيحة كانت مصابة. إذا لم يكن هناك علامة على الإصابة، فمن الممكن أن حقن وقع في منطقة مجاورةيمكن التعرف د في أقسام المحيطة بها. ويمكن أيضا أن تكون مفيدة لتحديد المسار إبرة للعثور على منطقة الحقن الدقيق. VSVG الفيروسات pseudotyped نادرا ما ينتشر من هامش التلفيف المسنن عند حقنه في الجسم الحي، وتميل إلى الانتشار على طول الخلايا الذيلية / منقاري محور اصابة طول التلفيف المسنن بأكمله، حسب تحليل إعادة الإعمار 3D (الشكل 3).

الشكل 1: استنساخ استراتيجية لالبلازميد pRubi-Guide1-Guide2-كريسبر فيروسات هذه الاستراتيجية متطابقة لالبلازميدات lentiviral على أساس FU. ومطوع oligos sgRNA وإدراجها في PXL باستخدام مواقع الاستنساخ BsbI. بعد التسلسل لضمان أن sgRNA يتم إدخال بنجاح في PXL، هضم البلازميد مع BstBI وباشي. ثم يتم استنساخ إدراج الذي تسربوا (الصندوق الأسود) في ب الظهر الفيروسيةواحد (أسود منقط خطوط) pRubi-Guide1 كريسبر. ويمكن أيضا إدراج وsgRNA الثانية في PXL وهضمها من استخدام انزيم باشي. ثم يتم استنساخ هذه في ناقلات كريسبر pRubi-Guide1 (الأحمر الخطوط المنقطة) باستخدام موقع باشي. البلازميد الناتجة ثم يحتوي على كل خيوط دليل فضلا عن العناصر الفيروسية اللازمة، والمروجين، وfluorophores. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم حقن حقن فيروسات من التلفيف المسنن الماوس الفيروسات القهقرية معربا عن mCherry (أحمر) أو GFP (الأخضر) في التلفيف المسنن على فأرة الحاسوب P7: الرقم 2. بعد 21 أيام من perfused الفئران والعقول مقطوع والملون لGFP وmCherry. (A) أظهرت 5X واسعة المجال صورة الفلورسنت العلاقات العامةecision الحقن التلفيف المسنن وخصوصية وضع العلامات المسنن الخلايا العصبية التلفيف الحبيبية. مورفولوجية الحصين يمكن أن ينظر إليه من خلال (الأزرق) تلطيخ دابي. يقيس شريط مقياس 200 ميكرون. (ب) صورة الفلورسنت 10X واسعة المجال يدل على أن هذه lentiviruses عيار عالية تصيب عدد كبير من الخلايا التي يمكن الوصول إليها عن طريق التعبير fluorophore التشكل. يقيس شريط مقياس 100 ميكرون. (C) الفيروسات معربا عن GFP أو mCherry وقد شارك في حقن التلفيف المسنن. باستخدام نظام من الفيروسات، يمكن للمرء أن استخدام فيروس واحد لجعل التلاعب الجيني واحدة تميزت GFP والتلاعب آخر تميزت mCherry، ومن ثم تقييم التغيرات واحدة أو المضافة المستحقة لكل الفيروس. يقيس مقياس شريط 10 ميكرون.

الرقم 3: انتشار التشريحية الحقن lentiviral coinjection التجسيمي فيروس GFP-shPten وفيروس السيطرة mCherry في دماغ شخص بالغ أدى PTEN ^{loxp / +} الماوس في انتشار الفيروس على طول منقاري كامل / محور الذيلية من التلفيف المسنن من الحصين. ويظهر ذلك في إعادة الإعمار 3D من مدى حقن وتتبع ملامح من انتشار الفيروس أكثر من 21 مسلسل أقسام (Z = 50 ميكرون / قسم) باستخدام برامج إعادة الإعمار التي أغلقت. ثم تم محاذاة اقتفاء أثر كفاف لتوليد الصور 3D لحجم الكمي. يظهر الكلي انتشار الفيروس في الأخضر (حجم = 54730800 ميكرون ³⁾ ويظهر انتشار مترجمة المسنن في الأرجواني (حجم = 27275200 ميكرون ^3). ينتشر الفيروس على طول مسار الإبرة والجسم الثفني عند تقاطع الطريق إبرة بالإضافة إلى ملء محور الذيلية / منقاري من التلفيف المسنن. يقيس شريط مقياس 200 ميكرون.

ليه / ftp_upload / 53783 / 53783video1frame.jpg "/>
تكميلية الفيديو 1. تصميم sgRNAs إلى استنساخ في العمود الفقري للفيروسات، وlentiviral.
في هذا الاصطناعية دليل الحمض النووي الريبي (sgRNA) مثال تصميم، يتم تحميل تسلسل الجينوم من CHD8 الماوس من NCBI. ثم يتم تصور كودون بداية وهيكل اكسون في المتجهات المعهد القومي للاتصالات. وهذا يسمح لنا لنسخ المنطقة الجينومية حول أول اكسون الترميز وإدخال هذا التسلسل في Benchling. Benchling يسمح لنا تصور كل sgRNAs المحتملة في المنطقة. وعلاوة على ذلك، بعد تشير إلى المنطقة الجينومية لدينا المدخلات، سوف Benchling تبين لنا عشرات على الهدف وبعيدا عن الهدف لكل RNA دليل. يمكن للمستخدم ثم حدد الحمض النووي الريبي دليل على أعلى الدرجات داخل وخارج المستهدفة. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Discussion

هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة التي تعتبر مهمة للتعبئة الفيروسي ناجحة. الصحة الخلية الحيوية قبل وخلال ترنسفكأيشن، وخلايا غير صحية سوف يقلل كثيرا من كمية الفيروس المنتجة. إذا كان ترنسفكأيشن والتعبئة والتغليف ناجحة، ثم 100٪ من الخلايا يجب أن تعبر عن fluorophore وهذه الخلايا يجب أن تشكل مخلى الوظيفية. في خطوة 3.2.4، والتنصت على أنبوب هو ضروري لترنسفكأيشن ارتفاع عيار كفاءة، ودرجة الحموضة في مخزنة المالحة HEPES-يجب أن يكون بالضبط. و-محضرات ماكسي التي تنتج البلازميدات اللازمة لتغليف الفيروسي يجب أن تكون نقية للغاية. إلى هذه النقطة، فإنه من المفيد أن الإيثانول ترسيب الحمض النووي شطف النهائي وإعادة تعليق العازلة في تريس، EDTA. بل هو أيضا مهم جدا لتقليل كمية من المصل إلى 2٪ أو أقل في وسائل الإعلام أن تتم إضافة الكافيين إلى يوم 6 (الخطوة 3.4) قبل جمع الفيروسي. إذا لم يتم خفض المصل، ثم الفيروس النقي النهائي سوف تحتوي على كمية غير مرغوب فيه من البروتوكول الاضافي في الدمعين. استخدام البولي ايثيلين جلايكول 6000 عندما عجل الجسيمات الفيروسية يستبعد ضرورة تنبيذ فائق. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن كريسبر تحتوي على فيروسات Cas9 وعادة ما يكون عيار حوالي 10 أضعاف أقل من الفيروسات تحتوي على fluorophore فقط.

لعملية جراحية التجسيمي، واستخدام التخدير عن طريق الاستنشاق يسمح السيطرة السريعة والدقيقة أو وعي الحيوان مقارنة التخدير عن طريق الحقن، ويسمح التخدير أكثر من الفئة العمرية الأكبر. ومن المهم للغاية للحفاظ على الأدوات الجراحية نظيفة ومعقمة، واستهداف استنساخه يتطلب تحديد المواقع بدقة من الرأس. تأكد من وجود أي نصب أو المتداول الرأس في الصك التجسيمي وأن الجمجمة يشعر ثابتا في مكانه. يمكن أن يكون مفيدا للسماح الجمجمة حتى يجف من أجل العثور على خيوط لتحديد الإحداثيات التجسيمي. أيضا، فإن معدل وحجم لكل التجسيمي تنسيق يجب أن تحدد تجريبيا.

هذا الأسلوب يحد في أن انتشار lenti- أو الارتجاعي يقتصر، لا سيما بالمقارنة مع الفيروسات الغدة المرتبطة (AAVS). لذلك، هذه الفيروسات هي قيمة عندما تصيب منطقة الدماغ منفصلة، ​​ولكن ليس للعدوى العام يرتبط مع AAVS تستخدم لتحليل سلوكي لدى الحيوانات. استخدام الكافيين في هذا البروتوكول بشكل كبير يزيد من عيار من هذه الفيروسات، لكنها لا تزال يست مرتفعة كما التتر التي تحققت في التعبئة والتغليف AAV. أيضا، التكامل مستقر هو فقط ميزة التعبير fluorophore، كما يشكل كريسبر / Cas9 التعديلات الجينوم مستقرة حتى عندما transfected عابر وأنه من الممكن أن الجارية تعبير عن Cas9 وsgRNA قد تؤدي في نهاية المطاف من آثار الهدف. التعبير عابرة للكريسبر / Cas9 النظام مع AAVS كافية لإنتاج التغيرات الجينية التي تم نشرها في جميع أنحاء انقسامات الخلية، ومع ذلك، لن يتم الإبقاء التعبير fluorophore.

إنشاء ليونسوف ti- والفيروسات باستخدام كريسبر / نظام Cas9 نقلها القدرة على استهداف أي الجينات رواية في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية. تظهر كفاءة التحرير الجينات أن تعتمد على تسلسل الحمض النووي الريبي دليل استهداف انشقاق Cas9. وقد تم تحديد تجريبيا أن ما بين 10٪ و 80٪ من الحيوانات المستنسخة تحتوي على indels بعد إصابة التسلسل خلايا Neuro2A. ومن غير المعروف حاليا ما إذا كان الترددات INDEL حساب في الخلايا Neuro2A هي انعكاس لتلك الموجودة في الخلايا العصبية. توجيه RNA تصميم البرمجيات مثل Benchling تشمل الآن على درجة "على الهدف" التي قد تكون قادرة على التنبؤ كفاءة سلسلة هدف معين. إلى أي مدى هذه الدرجات "على الهدف" هي احتياجات موثوقة إلى أن تحدد تجريبيا في الخلايا العصبية وغيرها من أنواع الخلايا كنظام كريسبر-Cas9 يصبح تنفيذها على نطاق أوسع.

وكان الإنتاج الحيواني المعدلة وراثيا على أساس الفيروسة البطيئة ناجح بنسب مختلفة مع تقارير تفيد بأن الجينات المحورة التي ألقيت من الفيروسة البطيئة تصبح الاشتراكيةlenced ^11. قد يتم تمريرها كريسبر التحرير الجينات بوساطة الحمض النووي من خلال خط الجرثومية لتوليد نماذج الحيوانية كلها. وبالتالي، قد يكون تحرير الجيني مستقر يمكن تحقيقه على الرغم من إسكات fluorophores الفيروسية التي ألقيت والجينات المحورة Cas9. وهذا قد تقدم منصة فعالة لإجراء تعديلات الجينومية المستهدفة. تسليم الفيروسية للنظام / Cas9 كريسبر، في حين لا تتطلب الكائنات المعدلة وراثيا، هي مكملة لتلك التقنيات. على سبيل المثال، عن طريق الحقن مثل هذه الجسيمات الفيروسية في الحيوانات المعدلة وراثيا مركب يعبر عن inducibly لجنة المساواة العرقية ولجنة المساواة العرقية opto- تعتمد أو الكيماوي الوراثية الجينات المحورة ينبغي أن تسهل دراسات معقدة في العلاقة بين التلاعب الجيني ونشاط الخلايا العصبية. والمثال الثاني هو تقديم هذه الجسيمات الفيروسية Cas9 / sgRNA إلى دور الستة عشر الشرطي في محاولة للكشف عن التفاعلات الجينات الجين. وأخيرا، والطريق مثير آخر من هذا البحث هو فحص الظواهر والمركبات العلاجية في خلايا المريض المشتقة، والتي يمكناستخدامها للتحقق من صحة واكتشاف شبكات الجينية التي تتعطل في مختلف الأمراض.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
List of Cell Culture Reagents
293FT cell line	Life Technologies	R700-07	For Lentivirus
293GP cell line	Clontech	631458	For Retrovirus
Iscove's Modification of DMEM (IMDM)	Corning	10-016-CV	Complete IMDM with 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-Gln, and  1% P/S
Fetal Bovine Serum (FBS)	Corning	35-011-CV
MEM Nonessential Amino Acids (NEAA)	Corning	25-025-CI
L-Glutamine solution, 100x (L-Gln)	Corning	25-005-CI
Pennicillin/Streptomycin solution, 100x (P/S)	Corning	30-002-CI
Polystyrene 10 cm plate	USA Scientific	CC7682-3394
Trypsin EDTA 1x	Corning	25-053-CI
List of Transfection Reagents
5 ml polystyrene tubes	Fisher Scientific	352054
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)	Fisher Scientific	C69-500	Make a 2.5 M solution in ddH2O
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3
HEPES	Fisher Scientific	BP2939-100
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Fisher Scientific	S369-500
2x HEPES Buffered Saline (HBS)			500 ml: 8.2 g NaCl, 5.95 g HEPES, 0.106 g Na2HPO4, pH 7.01 (exact!)
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-5G
0.22 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLGV033RS
0.45 µM syringe filter unit	EMD Millipore	SLHP033RS
60 cc L/L Syringe	Med-Vet International	MV60CCLL
50 ml Conical Tube	Corning	352098
polyethylene glycol   6000 (PEG 6000)	Millipore	528877
(10x) Phosphate Buffered Saline (PBS)	National Diagnostics	CL-253
0.5 ml microcentrifuge tubes	USA Scientific	1605-0000
Matrigel	Fisher Scientific	CB-40230A
6-well plate	Fisher Scientific	353046
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	AC41678-5000
Donor Horse Serum	Cellgro	35-030-CV
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML
10 ml serological pipette	Fisher Scientific	357551
anti-GFP, rabbit, 488 conjugate	Invitrogen	A21311
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Syringe only 1 cc Luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS
Isoflurane
Stainless Steel Scalpel Blades, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
artificial tear ointment	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
normal saline	Med-Vet International	DYND500MLSH
cotton tipped applicators	Med-Vet International	CTA6
Triple antibiotic ointment	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Needles Soft Pack 25 g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 silk sutures	Med-Vet International	MV-711