JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

التحقق من صحة الأنشطة الإنزيمية تشارك في المسارات البيوكيميائية ويمكن توضيح ذلك باستخدام التحليل تكامل وظيفي (FCA). وصفها في هذه المخطوطة هي فحص FCA مما يدل على النشاط الأنزيمي من الأنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، استجابة صارمة البكتيرية والحيوي ببتيدوغليكان البكتيرية.

Abstract

وظيفية تكامل فحص (FCA) هو فحص في الجسم الحي الذي يستخدم على نطاق واسع لإلقاء الضوء على وظيفة / دور الجينات / الانزيمات. هذا الأسلوب هو أمر شائع جدا في الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة والعديد من التخصصات الأخرى. لمحة شاملة عن تقنية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية المتعلقة الأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان ويقال الاستجابة الصارمة البكتيرية في هذه المخطوطة. ويسلط الضوء على اثنين من cDNAs من المصنع نموذج thaliana كائن نبات الأرابيدوبسيس التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي لليسين (L، L-diaminopimelate الألانين (dapL) والألانين التيروزين (tyrB) تشارك في عملية التمثيل الغذائي للالتيروزين والفينيل ألانين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ببتيدوغليكان البكتيرية يتم تمييز مسار المنشطة من خلال تحليل -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) الجين UDP- N من البكتيريا Verrucomicrobium الشائكة التي ينطوي عليها الصليب-linking من ببتيدوغليكان. وذكر أن استجابة صارمة البكتيرية أيضا من خلال تحليل آر إس إتش (ص العلا / ق وعاء ح omolog) الجين bifunctional مسؤولة عن النمط الظاهري شديدة مخاطي في س بكتيريا Novosphingobium. يتم عرض أربعة أمثلة من الهيئة الاتحادية للجمارك. وسوف يركز الفيديو على ثلاثة منها، وهي ليسين، ببتيدوغليكان واستجابة صرامة.

Introduction

ويعرف تكامل وظيفي في سياق توضيح وظيفة (ق) / دور (ق) من الجين كما قدرة مثلي معين أو الجينات orthologous لاستعادة متحولة خاص مع النمط الظاهري ملاحظتها للدولة من النوع البري عندما مثلي أو هو عرض الجينات orthologous في رابطة الدول المستقلة أو العابرة في الخلفية متحولة. وقد استخدم على نطاق واسع هذه التقنية لعزل والتعرف على وظيفة (ق) / دور (ق) من العديد من الجينات. أحد الأمثلة على ذلك هو العزلة وتحديد كربوكسيل orotidine-5-الفوسفات من المبيضات البيض باستخدام متحولة ura3 س الخباز ومتحولة pyrF من E. القولونية. 1 وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لتوضيح وظيفة الجينات التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان واستجابة الصارمة في برامجها البحثية وأدرجت هذه التقنية ضمن برامجها التعليمية في بiotechnology والبرامج في معهد روتشستر للتكنولوجيا (RIT) العلوم البيولوجية الجزيئية (بي إم بي).

الكتاب تعلم أساسيات الكيمياء الحيوية النباتية / علم الأمراض (FPBP) (هدسون) وBioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) (هدسون / Savka)، وهما العلوي قسم المختبر انتخابي يستند دورات في برنامج BMB في جامعة روتشستر للتكنولوجيا. منذ تنتسب بعض الموضوعات التي تمت مناقشتها في هذه الدورات مع اهتماماتهم البحثية، وأدرجت في الكتاب العديد من التقنيات والأدوات التجريبية التي يتم استخدامها في برامجها البحثية المعنية في هذه الدورات المختبري اثنين. أحد الأمثلة على ذلك هو تكامل وظيفي كعملية مختبر لتعزيز مواد المحاضرات المتعلقة الأمينية التمثيل الغذائي للأحماض من النباتات، ببتيدوغليكان والتمثيل الغذائي ردا صارما من البكتيريا.

ثلاثة مسارات الأحماض الأمينية من النباتات التي تمت مناقشتها في FPBB بالطبع هي أن من ليسين (الزنبق)، التيروزين(صور) والفينيل ألانين (PHE). ومن أبرز مسار اليس في سياق بسبب أهمية من الأحماض الأمينية مثل حمض أميني أساسي لجميع الحيوانات وخاصة البشر منذ الحيوانات تفتقر إلى آلية وراثية لتجميع ليز دي نوفو. بالإضافة إلى ذلك، تم اكتشاف مؤخرا أن النباتات تستخدم مسارا لتركيب الزنبق التي تختلف بشكل كبير عن تلك البكتيريا. وقد سهل هذا الاكتشاف جزئيا تكامل وظيفي للE. القولونية diaminopimelate (DAP) المسوخ باستخدام الجينة التي تكود إنزيم L، L-diaminopimelate الألانين (DapL) من thaliana مصنع نموذج نبات الأرابيدوبسيس. 2 يتم عرض مسارات البديل لتركيب اليس من خلال diaminopimelate سيطة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك ، تركيب ليز يسهل من خلال الأسرة اسبارتاتي مشتقة من الأحماض الأمينية التي تنظم للغاية. 3 بالإضافة إلى أهميتها في synt البروتينhesis، ويسلط الضوء على إعطاء مسارات للصور وPHE أهميتها في خدمة كمركبات تمهيدا لتحريض استقلاب المركبات فينيل تشارك تجميع المركبات الدفاع النباتية مثل: قلويدات، يغنينس، الفلافونويد، isoflavonoids، حمض hydroxycinnamic وغيرها (4) صور وأبرز مسارات PHE أيضا لإظهار الفرق بين المصنع ومسارات المنشطة البكتيرية. في البكتيريا، وتشارك الألانين انزيم التيروزين (TyrB) في تحريض استقلاب كل من الأحماض الأمينية، في حين أنه في النباتات، الانزيم هو في المقام الأول تشارك في هدم من صور وPHE وغير متورطة في تحريض استقلاب من هذه الأحماض الأمينية. (الشكل 2). 4

ويسلط الضوء على الاختلافات بين موجبة الجرام والجرام البكتيريا سلبية فيما يتعلق بهيكل ببتيدوغليكان (PG) في سياق FPBP. وPG من البكتيريا سالبة الجرام هو من مصلحة بخصوص أمراض النبات استنادا إلى حقيقة أن معظممسببات الأمراض النباتية هي سلبية الغرام. وكشف الاستعراض الأخير بشأن أفضل 10 البكتيرية النباتية مسببات الأمراض التي كلها سلبية الغرام. وكانت البكتيريا من أجناس: الزائفة، رالستونيا، الأجرعية، زانثوموناس، الإيروينية، Xylella، Dickeya وPectobacterium 5 واحد من الاختلافات الكيميائية عند مقارنة الجذعية PG من بكتيريا إيجابية الغرام السلبية وغرام هو الفرق بين عبر ربط الأمينية الأحماض من كلا النوعين. الخطوة الأولى لذلك مختلفة عبر ربط PG يحدث في خطوة هيولي من PG ابتناء وتتيسر بفضل انزيم UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) (الشكل 3A). MURE يحفز إضافة مركب ديامين معين في المركز الثالث من جذع الببتيد. 6 في معظم البكتيريا سالبة الجرام، والزنبق قبل الأخيرة السلائف والمتوسط ​​-diaminopimelate ( م -DAP) بمثابة عبر ربط الأحماض الأمينية واليس يخدم نفس الدور في PG معظم البكتيريا إيجابية الجرام (الشكل 3B). 7 ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كلا من م -DAP واليس تمتلك اثنين أمين الجماعات وقادرة على تشكيل اثنين من السندات الببتيد لالببتيد الجذعية عبر ربط.

في Bioseparations: المبادئ والممارسات (BPP) البرنامج الدراسي، وتناقش الاختلافات بين النظم المفتوحة والمغلقة لزراعة البكتيريا وكيف أن مستويات المواد الغذائية سوف تتغير بشكل كبير في كلا النظامين نظرا للتغيرات البيئية. وترتبط هذه الأحداث إلى التغييرات التنظيمية يسمى "تحول أسفل" أو "حتى تحول" الناجمة عن المجاعة أو إمدادات كافية من الأحماض الأمينية أو الطاقة. يمكن أن يحدث "تحول أسفل" استجابة عندما يتم نقل ثقافة البكتيرية من وسيلة غنية ومعقدة إلى متوسطة محددة كيميائيا مع مصدر الكربون واحد. هذا التغيير في البيئة يؤدي إلى cessa السريعنشوئها من الحمض الريبي النووي النقال والريباسي التوليف. هذا وقف النتائج في عدم وجود الريبوسومات والبروتين والحمض النووي على الرغم من وupregulated الحيوي من الأحماض الأمينية.

بعد استجابة "تحول أسفل"، يتم استخدام الريبوسومات القائمة على إنتاج إنزيمات جديدة لتجميع الأحماض الأمينية لم تعد متوفرة في المتوسط ​​أو البيئة. بعد فترة من الوقت، يتم تجميع التوليف الريباسي والريبوسومات جديدة والسكان من الخلايا البكتيرية يبدأ في النمو على الرغم بسعر مخفض. ويطلق على مجرى الأحداث في "استجابة الصارمة" أو "رقابة صارمة"، ومثال على التنظيم الخلوية العالمي ويمكن النظر إليها على أنها آلية لضبط الآلات السكروز الخلية للتعويض عن توافر ركائز المطلوبة واحتياجات الطاقة 8 الرد صرامة مما يتيح البكتيريا على الاستجابة السريعة لتدفقات من المواد الغذائية في البيئة ويساهم وENHances قدرة البكتيريا على المنافسة في البيئات التي يمكن أن تتغير بسرعة فيما يتعلق المغذيات وأو توافر الركيزة 8-9

استجابة صارمة لديه دورا أساسيا في التعبير الجيني عندما تقتصر على توافر الأحماض الأمينية، والكربون والنيتروجين والفوسفات، والأحماض الدهنية. 8،10-14 يتم تنسيق هذه الاستجابة الصارمة من قبل اثنين من النيوكليوتيدات، غوانوزين tetraphosphate (ppGpp) وغوانوزين pentaphosphate (pppGpp) يشار معا في alarmone (ع) ppGpp. على سبيل المثال، عندما يتم الأحماض الأمينية محدودة والتي يمكن أن تؤدي إلى اختناق في تخليق البروتين، وalarmone، غوانوزين 3،5- (مكرر) بيروفوسفات (ppGpp)، والمستمدة من ابتناء من غوانوزين 3-ثنائي فسفات 5 ثلاثي الفوسفات (pppGpp) يتراكم في الخلية. التغير في مستوى (ع) ppGpp وتشارك في التعبير عن الجينات التي تنظم الاستجابة للتغلب على عدم وجود ركائز في البيئة التي تشارك مباشرة في نمو الخلايا والتنت. ودعا اثنين من الجينات التي تشارك في هذه العملية RELA والبقعة. RELA هو (ع) ppGpp مخلقة المرتبطة الريبوسوم التي تشارك في الاستجابة إلى تراكم tRNAs بدون تهمة الذي هو نتيجة للقيود الأحماض الأمينية. وظائف بقعة باعتباره bifunctional (ع) ppGpp مخلقة وهيدرولاز. وتشارك النشاط مخلقة من بقعة في الاستجابة لعدم وجود الكربون والأحماض الدهنية المجاعة. 8 homologs RELA / بقعة على نطاق واسع في النباتات والبكتيريا ويشار إلى آر إس إتش للomologs ح R العلا / S وعاء. 8،10 -12،16 أظهرت مخطوطة الأخيرة أن هناك بروتين آر إس إتش المحددة المعنية في تركيب هذه alarmones من البكتيريا Novosphingobium س ص ص 2-17. 17

هنا نقدم أربعة المسارات البيوكيميائية مصطفة على المقايسات تكامل وظيفي. المقايسات تكامل المبينة في هذه المخطوطة توفر وسيلة لEXPLخام يعمل هذا الاختبار في الجسم الحي كوسيلة لتحديد وتوصيف أو الانزيمات التي من المتوقع أن يكون غير معروف / وظيفة المفترضة (ق) أو كأدوات تعليمية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: المؤلفون على استعداد لتوفير السلالات البكتيرية والبلازميدات المؤتلف لتسهيل إدماج تحليل تكامل وظيفي لأغراض التدريس للأفراد المهتمين. يتم سرد البلازميدات التي كانت تستخدم لتسهيل تجارب تكامل وظيفي في الجدول 1.

1. البناء من البلازميدات لالتكملة الوظيفي

  1. استنساخ Diaminopimelate الألانين (dapL) لالتكملة الوظيفي.
    1. تضخيم dapL إطار القراءة المفتوح (ORF) من V. الشائكة وcDNAs من أ. thaliana و C. reinhardtii بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide 4، و 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من PFXالبلمرة DNA.
      ملاحظة: وصف كامل المتعلقة الاستنساخ المؤتلف من ثلاثة orthologs dapL من مصنع A. thaliana (في -dapL)، والبكتيريا Verrucomicrobium الشائكة (مقابل -dapL) والطحالب كلاميدوموناس reinhardtii (الكروم -dapL) قد نشرت في وقت سابق. 2،18-20
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في الاستنساخ من orthologs dapL هي كما يلي:
      مقابل dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 "
      مقابل dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 "
      في dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 "
      في dapL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 "
      كر dapL F-5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 "
      كر dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 "
    2. استنساخ شظايا PCR في تيانه البلازميد pET30A لإنتاج البلازميدات المؤتلف، pET30A :: مقابل dapL، pET30A :: في dapL وpET30A :: الكروم dapL باستخدام بادئات، والانزيمات التقييد ويغاز T4 DNA.
      1. لفترة وجيزة، واحتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 18-20
    3. لخلق البلازميد للتكامل وظيفي، وهضم pET30A :: مقابل dapL وpET30A :: في البلازميدات dapL مع تقييد الانزيمات XbaI وسالي وXbaI وHindIII لpET30A :: الكروم dapL. Ligate يدرج في pBAD33 البلازميد باستخدام يغاز T4 الحمض النووي لإنتاج البلازميدات pBAD33 :: مقابل dapL. pBAD33 :: في dapL وpBAD33 :: الكروم dapL.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و20 نانوغرامناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 20
  2. استنساخ ناقلة أمين التيروزين (tyrB) من أ. thaliana لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: التفاصيل الكاملة بشأن استنساخ [كدنا] من أ. thaliana المشروح بالعلامات مكان وقد وصفت At5g36160 سابقا. 4
    1. تضخيم [كدنا بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، و 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز PFX DNA 0.5 ملم.
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في البنودoning من At5g36160 هي كما يلي:
      في tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
    2. استنساخ جزء في pET30A البلازميد إنتاج البلازميدات المؤتلف pET30A :: At5g36160 من قبل هضم جزء PCR مع EcoR1 وSal1. ligate في جزء إلى pET30A باستخدام يغاز T4 DNA كما هو موضح أدناه. 4
    3. لخلق البلازميد تكامل وظيفي، وهضم pET30A :: At5g36160 مع تقييد الانزيمات XbaI وHindIII، وligate إدراج في pBAD33 باستخدام نفس المواقع انزيم التقييد لإنتاج البلازميد المؤتلف pBAD33 :: At5g3160 باستخدام يغاز T4 DNA.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل chlo -1ramphenicol التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 4
  3. استنساخ UDP- N -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) من V. الشائكة لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: استنساخ MURE ORF من V. وقد وصفت الشائكة سابقا. 18
    1. تضخيم إطار القراءة المفتوح بواسطة PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز PFX الحمض النووي. ثم استنساخ في البلازميد pET100D لإنتاج البلازميد pET100D :: مقابل MURE.
      ملاحظة: الاشعال المستخدمة في استنساخ مقابل MURE هي كما يلي:
      مقابل MURE F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 "
      ضدMURE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 "
    2. لإنتاج البلازميد للتكامل وظيفي، وهضم pET100D :: مقابل MURE
      مع تقييد الانزيمات XbaI وSal1 وligate إدراج في pBAD33 لإنتاج البلازميد pBAD33 المؤتلف :: مقابل MURE باستخدام يغاز T4 DNA.
      1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X، جنبا إلى جنب مع 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي، وبين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 التي يحتضنها 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. 8
  4. استنساخ RELA / ق وعاء (آر إس إتش) من Novosphingobium ليرة سورية لالتكملة الوظيفي.
    ملاحظة: إن الاستنساخ من آر إس إتش من Novosphingobium ليرة سورية وقد وصفت سابقا 17.
    1. تضخيم ORF آر إس إتش بالإضافة إلى 599 النيوكليوتيدات upstماعون من الموقع الشروع بداية و 46 النيوكليوتيدات المصب في موقع الانهاء من جانب PCR. استخدام 1 دورة في 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. تشمل 12 pmoles من كل التمهيدي، 1 ملم MgSO 4، 0.5 ملي كل من triphosphates deoxynucleotide أربعة، 0.5 نانوغرام من الحمض النووي القالب و1 وحدة من بوليميريز طق الحمض النووي. ثم استنساخ في pCR2.1 البلازميد إنتاج pCR2.1 :: برنامج الفضاء الوطني آر إس إتش.
      1. احتضان 1 ميكرولتر من تضخيم جزء PCR، 1 ميكرولتر من ناقلات pCR2.1، 1 ميكرولتر من محلول الملح و 1 ميكرولتر من المياه. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و 2 ميكرولتر من ربط إلى E. خلايا القولونية، وشاشة لمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين التي يحتضنها 37 ° مئوية لمدة 24 ساعة.
        ملاحظة: الاشعال المستخدمة في الاستنساخ من آر إس إتش هي كما يلي:
        آر إس إتش F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 "
        آر إس إتش R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 "
      2. لتكامل وظيفي، وهضم pCR2.1 البلازميد :: برنامج الفضاء الوطني RSH مع EcoR1 وligate إدراج في pRK290 نطاق واسع المضيف لإنتاج البلازميد المؤتلف pRK290 :: برنامج الفضاء الوطني آر إس إتش باستخدام يغاز T4 DNA.
        1. احتضان 50 نانوغرام من إدراج و 20 نانوغرام من ناقلات في المخزن يغاز 1X و 1 وحدة من يغاز T4 الحمض النووي بين عشية وضحاها في 17 درجة مئوية. تحويل الربط إلى E. خلايا القولونية Dh5α وشاشة للمستعمرات على لوحات LB تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل التتراسيكلين -1 التي يحتضنها 37 ° مئوية لمدة 24 ساعة. 17

2. إعداد الخلايا البكتيرية الكهربائية المختصة لتسهيل التحول

ملاحظة: إعداد الخلايا الكهربائية المختصة تقوم على بروتوكول 26 ل 1.0 لتر من الثقافة التي يمكن زيادتها لتصل إلى حجم أصغر (أي 250 مل). يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول يمكن بالبريد تستخدم لجعل كل السلالات المختصة التي تم وصفها في هذه المخطوطة لتسهيل FCA 22

  1. تطعيم 50 مل من المتوسط ​​السائل مع مستعمرة واحدة في قارورة وتنمو أكثر من ليلة، مع التأكد من تحقق التركيب الوراثي للمتحولة قبل البدء في هذه الخطوة (الجدول 2).
  2. في اليوم الثاني، تطعيم 1.0 لتر من الوسط المناسب (LB لE. coli و المسوخ PD لNovosphingobium س) مع 50 مل من الثقافة بين عشية وضحاها، وتنمو إلى OD 600 0،4-0،6 (تسجيل مرحلة) عند 30 درجة C.
  3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف، و resuspend بيليه في 500 مل من معقم الجليد الباردة H النقي 2 O.
  4. الطرد المركزي الخلايا في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، صب وطاف و resuspend بيليه في 250 مل من معقم الجليد الباردة 10٪ الجلسرين.
  5. الطرد المركزي الخلايا في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 ° C، صب السوبرعائم، و resuspend بيليه في 2.0 مل من 10٪ الجلسرين.
  6. قسامة الخلايا عن طريق نقل 50 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة وعلى الفور تجميد عن طريق وضع الأنابيب في حمام الجليد الجاف الايثانول. تخزين الخلايا المختصة في -80 درجة مئوية ل electroporation.

3. Electroporation للمن الخلايا البكتيرية مع التكملة البلازميدات

  1. ل electroporation، إضافة 1.0 ميكرولتر (10-50 نانوغرام) البلازميد المؤتلف إلى قسامة (50 ميكرولتر) من الخلايا المختصة ووضع على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. نقل الخليط عبر pipetting للكفيت Electroporation للوتعيين جهاز Electroporation لللإعداد التالي: 25 السعة μF، 2.5 كيلو فولت، و 200 أوم المقاومة وتسليم النبض.
  3. إضافة 1.0 مل من وسائط استرداد (LB) إلى كفيت Electroporation للونقل باستخدام ماصة إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. استعادة مع دوران طيف لمدة 60 دقيقة في حاضنة تهتز.
  4. لوحة 100 ميكرولتر من ثقافة من ريكوخطوة جدا على لوحات أجار عليه الاختيار لtransformants من قبل pipetting ونشر استخدام رش العقيمة.
    ملاحظة: تأكد من تحقق الجدول 1 والجدول 2 قبل البدء في هذه الخطوة للتحقق من المضادات الحيوية والأنماط الجينية لجعل لوحات أجار المناسبة.

4. التحول من AOH1 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق L، L-diaminopimelate الألانين (dapL)

  1. لتحليل تكامل، وتحويل AOH1 مع ناقلات فارغة (pBAD33)، ومع ناقلات التعبير DapL في أحداث التحول منفصلة باستخدام بروتوكول Electroporation للالمبينة في القسم 3.0.
  2. تحديد transformants بواسطة الطلاء على LB المتوسطة أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل -1 DAP و 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 و 50 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين.
  3. اختبار للتكامل وظيفي من قبل المستعمرات متماثلة الطلاء من تسليط الضوء على LB ليdium مع 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز مع وبدون 50 ميكروغرام / مل -1 DAP و 34 ميكروغرام / مل -1 كانامايسين.
  4. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ومراقبة النتائج.
    ملاحظة: نتيجة ينبغي أن تظهر أن متحولة غير قادرة على النمو في وسائل الإعلام الحرة حزب العمل الديمقراطى فقط عندما يتم التعبير عن الجينات dapL في الخلفية متحولة فقط بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

5. التحول من TKL-11 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق الوسيط UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-غلوتاميل-2،6- -diaminopimelate يغاز (مور)

  1. تحويل متحولة مع ناقلات فارغة (pBAD33) ومع التعبير عن ناقلات MURE (pBAD33 :: VsmurE) باستخدام بروتوكول المبينة في القسم 3.0.
  2. لوحة وتحديد transformants في المتوسط ​​LB أجار تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الثايمين -1 و 34 ميكروغرام / مل -1 الكلورامفينيكول واحتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. اختبار للتكامل من خلال تسليط الضوء أو الطلاء المستعمرات من كل من السيطرة والتحولات التجريبية على اثنين من LB المتوسطة بالإضافة إلى 0.2٪ (ث / ت) الارابينوز و 50 ميكروغرام / مل الثايمين -1.
  4. احتضان لوحة واحدة على 30 درجة مئوية، والآخر في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتقييم بصريا النمط الظاهري النمو.
    ملاحظة: يجب أن تظهر النتائج أن متحولة غير قادرة على النمو في 42 درجة مئوية فقط عندما يتم التعبير عن الجينات MURE في الخلفية متحولة مقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

6. تحول DL39 لتيسير التكملة الوظيفي عن طريق ناقلة أمين التيروزين (tyrB)

  1. تحويل DL39 مع أي pBAD33 أو pBAD33 :: At5g36160، وتحديد transformants على لوحات أجار LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 50 ميكروغرام / مل الفنيل الأنين -1، و 34 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول -1 باستخدام بروتوكول المبينة في القسم 3.0.
  2. طبق الاصلالمستعمرات -plate على الحد الأدنى (M9) وسائل الاعلام مع 50 ميكروغرام / مل الفنيل الأنين -1 و 50 ميكروغرام / مل التيروزين -1، 50 ميكروغرام / مل -1 اسبارتاتي، 50 ميكروغرام / مل ليسين -1، 50 ميكروغرام / مل -1 حمض أميني أساسي، 50 ميكروغرام / مل يسوليوكيني -1، 10 ميكروغرام / مل -1 اليوراسيل 0.5٪ (ث / ت) الجلسرين، 0.2٪ (ث / ت) أرابينوز. أيضا المستعمرات متماثلة لوحة على لوحات تفتقر الفينيل ألانين والتيروزين من تسليط الضوء على نفس مستعمرة لكل من لوحات.
  3. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة لمراقبة النمط الظاهري النمو.
    ملاحظة: نتيجة ينبغي أن تظهر أن متحولة غير قادرة على النمو على الفينيل ألانين والتيروزين وسائل الإعلام الحرة، فقط عندما يتم التعبير عن الجينات tyrB في الخلفية متحولة فقط بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

7. التحول من Hx699 لتيسير التكملة الوظيفي للHypomucoid النمط الظاهري من Novosphingobium ليرة سورية. سلالة Hx699

  1. تحويل من نوع السلالة البرية Novosphingobium ليرة سورية. (Rr2-17) وHx699 متحولة مع pRK290 وpRK290 :: آر إس إتش اس بي في 2 أحداث التحول منفصلة باستخدام بروتوكول التحول المبينة في القسم 3.0.
  2. لوحة التحولات على سكر العنب البطاطس (PD) أجار تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل -1 التتراسيكلين، واحتضان لمدة لا تقل عن 24 ساعة أو حتى تظهر transformants.
  3. خط كل من تحولات في نمط "X" على لوحات PD أجار الطازجة واحتضان عند 30 ° مئوية لمدة 4 أيام على الأقل. مراقبة الظواهر متجه فقط، والتجربة من خلال دراسة بصريا النمط الظاهري نمو كل من لوحات.
    ملاحظة: يجب أن تظهر النتيجة أن النمط الظاهري للفراش لا تسبب مخاطي ويكمل عندما يتم التعبير عن آر إس إتش في الخلفية متحولة بالمقارنة مع مكافحة ناقلات فقط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم سرد السلالات البكتيرية التي يعملون في مختلف التحليلات تكامل وظيفي في الجدول 2.

وظيفية تحليل تكامل: L، L-diaminopimelate الألانين (dapL)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

العديد من الدورات التي هي جزء لا يتجزأ من الحيوية ومنهج العلوم البيولوجية الجزيئية في معهد روتشستر للتكنولوجيا وجود مكون المختبر بالإضافة إلى جزء محاضرة للدورة. المناهج الدراسية للعام الدراسي 2014-2015 ويتضمن ما مجموعه 48 دورة، 29 منها تحتوي على عنصر المختبر والتي تمثل ح?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

AOH وMAS يعترف كلية العلوم وH. مدرسة توماس Gosnell لعلوم الحياة في معهد روتشستر للتكنولوجيا حصول على الدعم. وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية بالولايات المتحدة (NSF) جائزة لAOH MCB-1120541.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantsHudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Potato Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
AspartateSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

References

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved