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Résumé

La validation des activités enzymatiques impliquées dans les voies biochimiques peut être élucidée en utilisant une analyse de complémentation fonctionnelle (CAF). Décrite dans ce manuscrit est le dosage CAF démontrant l'activité enzymatique des enzymes impliquées dans le métabolisme des acides aminés, de réponse stringente bactérienne et la biosynthèse du peptidoglycane bactérien.

Résumé

Functional dosage de complémentation (FCA) est un test in vivo qui est largement utilisé pour élucider la fonction / rôle des gènes / enzymes. Cette technique est très courante dans la biochimie, de la génétique et de nombreuses autres disciplines. Une vue d'ensemble de la technique pour compléter l'enseignement des voies biochimiques relatives aux acides aminés, peptidoglycane et la réponse stricte bactérienne est signalée dans ce manuscrit. Deux ADNc de l'organisme modèle Arabidopsis thaliana plante qui sont impliqués dans le métabolisme de la lysine (L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) et de la tyrosine aminotransferase (tyrB) impliqués dans le métabolisme de la tyrosine et phénylalanine sont surlignés. En outre, le peptidoglycane bactérien voie anabolique est mis en évidence par l'analyse de la -acetylmuramoyl-l-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) gène UDP- N à partir de la bactérie Verrucomicrobium spinosum impliqué dans la croix-linking de peptidoglycane. La réponse rigoureuse bactérienne est également signalé par l'analyse de l'rsh (POT h de omolog de ​​r ela / s) gène bifonctionnel responsable d'un phénotype hyper-muqueux dans la bactérie Novosphingobium sp. Quatre exemples de FCA sont présentés. La vidéo se concentrera sur trois d'entre eux, à savoir la lysine, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse.

Introduction

complémentation fonctionnelle dans le contexte d'élucider la fonction (s) / rôle (s) d'un gène est défini comme la capacité d'un homologue particulier ou d'un gène orthologue pour restaurer un mutant particulier avec un phénotype observable à l'état sauvage lorsque l'homologue ou d'un gène orthologue est introduit en cis ou trans dans l'arrière - plan mutant. Cette technique a été largement utilisée pour isoler et identifier la fonction (s) / rôle (s) de nombreux gènes. Un exemple particulier est l'isolement et l' identification des orotidine-5-phosphate décarboxylase de Candida albicans en utilisant le mutant ura3 de S. cerevisiae et du mutant pyrF E. coli. 1 Les auteurs ont utilisé cette technique pour élucider la fonction des gènes qui sont impliqués dans le métabolisme des acides aminés, le peptidoglycane et la réponse rigoureuse dans leurs programmes de recherche et ont incorporé cette technique dans leurs programmes d'enseignement dans le BBIOTECHNOLOGIE et programme au Rochester Institute of Technology (RIT) Molecular Bioscience (BMB).

Les auteurs enseignent Fondements de végétaux Biochimie / Pathologie (FPBP) (Hudson) et Bioseparations: Principes et pratiques (BPP) (Hudson / Savka), deux cours basés division laboratoire supérieure élective dans le programme BMB au RIT. Depuis quelques-uns des sujets qui sont abordés dans les cours sont affiliés à leurs intérêts de recherche, les auteurs ont intégré un grand nombre de techniques et d'outils expérimentaux qui sont utilisés dans leurs programmes de recherche respectifs dans ces deux cours en laboratoire. Un tel exemple est complémentation fonctionnelle comme un exercice de laboratoire pour renforcer les documents de cours relatifs aux acides métabolisme des acides à partir de plantes, peptidoglycane et le métabolisme de réponse rigoureuse à partir de bactéries.

Trois des voies d'acides aminés à partir de plantes qui sont abordés dans le cours FPBB sont celui de la lysine (LYS), tyrosine(Tyr) et de la phénylalanine (Phe). La voie est mise en évidence dans le lys cours en raison de l'importance de l'acide aminé comme un acide aminé essentiel pour tous les animaux en particulier les humains puisque les animaux manquent de la machinerie génétique pour synthétiser lys de novo. En outre, on a récemment découvert que les plantes utilisent une voie pour la synthèse de lys qui est significativement différente de celle des bactéries. Cette découverte a été facilitée en partie par complémentation fonctionnelle de E. coli diaminopimélate (PAH) des mutants en utilisant un gène qui code pour l'enzyme L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPI) à partir du Arabidopsis thaliana plante modèle. 2 Les variantes de voies pour la synthèse de Lys à travers la diaminopimélate intermédiaire sont représentés sur la figure 1. En outre , la synthèse de lys facilite par la famille de aspartate dérivée d'acides aminés qui est très réglementé. 3 en plus de leur importance en protéines synthesis, les voies de Tyr et Phe sont mis en évidence compte tenu de leur importance dans le service en tant que composés précurseurs pour l'anabolisme des composés phénylpropanoïdes impliqués la synthèse de composés de défense des plantes telles que:. alcaloïdes, les lignines, les flavonoïdes, les isoflavonoïdes, l' acide hydroxycinnamique entre autres 4 Le tyr et les voies de Phe sont également mis en évidence pour montrer la différence entre la plante et les voies anaboliques bactériennes. Chez les bactéries, la tyrosine aminotransférase enzyme (tyrB) est impliquée dans l'anabolisme des deux acides aminés, tandis que chez les végétaux, l'enzyme est principalement impliqué dans le catabolisme de Tyr et Phe, et n'a pas été impliqué dans l'anabolisme de ces acides aminés. (Figure 2) 4.

Les différences entre Gram positif et les bactéries Gram négatives en ce qui concerne la structure du peptidoglycane (PG) sont mis en évidence au cours de FPBP. La PG de bactéries Gram négatives est d'un intérêt en ce qui concerne la pathologie végétale sur la base du fait que la plupartpathogènes des plantes sont Gram négatif. Une étude récente concernant les 10 bactériennes phyto-pathogènes a révélé que tous sont Gram négatif. Les bactéries ont été parmi les genres Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya et Pectobacterium 5 L' une des différences chimiques lors de la comparaison de la souche PG de bactéries Gram négatif et Gram positif est la différence entre la réticulation amino. les acides des deux types. La première étape pour que différente réticulation du PG se produit à l'étape cytoplasmique de PG anabolisme et est facilitée par l'enzyme UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate méso ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) (figure 3A). Mure catalyse l'addition d'un composé de diamine particulier à la troisième position de la tige de peptide 6. Dans la plupart des bactéries Gram - négatives, les lys pénultième précurseur, méso -diaminopimelate ( m -DAP) sert de réticulation amino - acide et sert Lys le même rôle dans la PG de la plupart des bactéries Gram - positives (figure 3B). 7 Ceci est dû au fait qu'à la fois m et -DAP Lys possèdent deux amine groupes et sont capables de former deux liaisons peptidiques pour la tige de peptide réticulation.

Dans les Bioséparations: Principes et pratiques (BPP) Bien sûr, les différences entre les systèmes ouverts et fermés pour la culture de bactéries et comment nutriment niveaux va changer de manière significative dans les deux systèmes en raison de changements environnementaux sont discutés. Ces événements sont liés aux changements réglementaires appelés un «décalage vers le bas" ou "shift up" déclenché par la faim ou une quantité suffisante d'acides aminés ou de l'énergie. La réponse «rétrograder» peut se produire quand une culture bactérienne est transférée à partir d'un milieu riche et complexe à un milieu défini chimiquement avec une source de carbone unique. Ce changement dans l'environnement conduit à la Cessa rapidetion de la synthèse ARNt et ARNr. Cette cessation résulte en l'absence de ribosomes, les protéines et la synthèse d'ADN, même si la biosynthèse des acides aminés sont régulés à la hausse.

Après la réponse «rétrograder», les ribosomes existants sont utilisés pour produire de nouvelles enzymes pour synthétiser les acides aminés ne sont plus disponibles dans le milieu ou l'environnement. Après une période de temps, la synthèse de l'ARNr et les nouveaux ribosomes sont assemblées et la population de cellules bactériennes commence à croître mais à un taux réduit. Le cours des événements est appelé la «réponse stricte» ou «contrôle strict» et est un exemple de la régulation cellulaire globale et peut être considéré comme un mécanisme de réglage des machines biosynthétique de la cellule pour compenser la disponibilité des substrats nécessaires et les besoins énergétiques . 8 la réponse rigoureuse permet ainsi aux bactéries de répondre rapidement aux flux de nutriments dans l'environnement et contribue et enhances la capacité des bactéries à concourir dans des environnements qui peuvent changer rapidement en ce qui concerne la disponibilité des nutriments et ou du substrat. 9/8

La réponse rigoureuse a un rôle essentiel dans l' expression du gène lorsque la disponibilité des acides aminés, le carbone, l' azote, le phosphate et les acides gras sont limités. 8,10-14 Cette réponse rigoureuse est coordonné par deux nucléotides, guanosine tétraphosphate (ppGpp) et guanosine pentaphosphate (pppGpp) communément appelé ensemble comme le alarmone (p) ppGpp. Par exemple, lorsque les acides aminés sont limitées, ce qui peut conduire à un goulot d'étranglement dans la synthèse des protéines, la alarmone, la guanosine 3,5- (bis) Pyrophosphate (ppGpp), dérivée de l'anabolisme de la guanosine diphosphate-3 5-triphosphate (pppGpp) accumule dans la cellule. Le changement de niveau (p) ppGpp est impliqué dans l'expression des gènes qui régulent la réponse à surmonter le manque de substrats dans l'environnement qui sont directement impliqués dans la croissance cellulaire et développement. Deux des gènes qui sont impliqués dans ce processus sont appelés relA et spoT. RelA est un ribosome associé (p) ppGpp synthétase qui est impliquée dans la réponse à l'accumulation des ARNt non chargés qui est le résultat de la limitation de l'acide aminé. fonctions repèrer comme bifonctionnel (p) ppGpp synthétase et hydrolase. L'activité de synthétase de repèrer est impliqué dans la réponse à l'absence de carbone et d' acide gras famine. 8 Les homologues RelA / Tache sont répandus dans les plantes et les bactéries et sont appelées rsh R ela / S POT h omologs. 8,10 -12,16 un manuscrit récent a montré qu'il existe une protéine rsh spécifique impliquée dans la synthèse de ces alarmones de la bactérie Novosphingobium sp Rr 2-17 17.

Nous présentons ici quatre voies biochimiques attachés aux essais de complémentation fonctionnelle. Les essais de complémentation décrites dans ce manuscrit fournit une avenue pour explminerai utilisant ce test in vivo comme un moyen d'identifier et de caractériser ou des enzymes qui sont prévues pour avoir une fonction inconnue / putative (s) ou comme outils d'enseignement pour compléter l'enseignement des voies biochimiques.

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Protocole

NOTE: Les auteurs sont prêts à fournir des souches bactériennes et les plasmides recombinants pour faciliter l'incorporation de l'analyse de complémentation fonctionnelle à des fins d'enseignement pour les personnes qui sont intéressées. Les plasmides qui ont été utilisés pour faciliter les expériences de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 1.

1. Construction de Plasmides pour la complémentation fonctionnelle

  1. Clonage de diaminopimélate aminotransférase (DAPL) pour complémentation fonctionnelle.
    1. Amplifier le cadre de lecture ouvert DAPL (ORF) du V. spinosum et des ADNc de A. thaliana et C. reinhardtii par PCR. Utiliser 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min. Inclure 12 pmoles de chaque amorce, 1 mM MgSO4, 0,5 mM de chacun des 4 désoxynucléotides triphosphates, et 0,5 ng d'ADN matrice et une unité de PfxADN polymérase.
      NOTE: La description complète concernant le clonage recombinant de trois orthologues DAPL de la plante A. thaliana (A -dapL), la bactérie Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) et l'algue Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) a été publié précédemment. 2,18-20
      REMARQUE: Les amorces utilisées pour le clonage des orthologues DAPL sont les suivantes:
      Vs DAPL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      Vs DAPL R 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      A DAPL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      A DAPL R-5'GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr DAPL F-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 5'- 3 '
      Cr DAPL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
    2. Cloner les fragments de PCR en til plasmide pET30A pour produire les plasmides recombinants, pET30A :: Vs DAPL, pET30A :: A DAPL et pET30A :: Cr DAPL en utilisant les amorces, des enzymes de restriction et l' ADN ligase T4.
      1. En bref, incuber 50 ng d'insert et 20 ng de vecteur dans le tampon de ligase 1x et 1 unité d'ADN ligase T4 pendant une nuit à 17 ° C. Transformer la ligature dans E. cellules coli DH5a et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 50 pg / ml -1 kanamycine par incubation à 37 ° C pendant 24 heures. 18-20
    3. Pour créer le plasmide pour la complémentation fonctionnelle, digèrent pET30A :: Vs et DAPL pET30A :: A DAPL plasmides avec les enzymes de restriction Xbal et Sali et Xbal et Hindlll pour le pET30A :: Cr DAPI. Ligaturer les insertions dans les pBAD33 plasmidiques en utilisant l' ADN ligase T4 pour produire les plasmides pBAD33 :: Vs DAPL; pBAD33 :: A DAPL et pBAD33 :: Cr DAPL.
      1. Incuber 50 ng d'insert et 20 ngdu vecteur dans un tampon de ligase 1x et 1 unité d'ADN ligase T4 pendant une nuit à 17 ° C. Transformer la ligature dans E. cellules coli DH5a et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 34 pg / ml -1 kanamycine par incubation 37 ° C pendant 24 heures. 20
  2. Le clonage de la tyrosine aminotransferase (tyrB) de A. thaliana pour complémentation fonctionnelle.
    NOTE: Les détails concernant le clonage de l'ADNc de A. thaliana annoté par les balises du locus At5g36160 a été décrit précédemment. 4
    1. Amplifier l'ADNc par PCR. Utiliser 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min. Inclure 12 pmoles de chaque amorce, 1 mM MgSO4, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynucléotide triphosphates, et 0,5 ng d'ADN matrice et une unité d'ADN polymerase Pfx.
      REMARQUE: Les amorces utilisées pour la cloning du At5g36160 sont les suivantes:
      F- au tyrB 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
    2. Cloner le fragment dans le pET30A plasmidique pour produire les plasmides recombinants pET30A :: At5g36160 par digestion du fragment de PCR avec EcoR1 et Sal1; ligaturer dans le fragment dans pET30A en utilisant l' ADN ligase T4 comme décrit ci - dessous. 4
    3. Pour créer le plasmide de complémentation fonctionnelle, digérer le pET30A :: At5g36160 avec les enzymes de restriction Xbal et Hindlll et ligaturé l'insert dans pBAD33 en utilisant les mêmes sites d'enzymes de restriction pour produire le plasmide recombinant pBAD33 :: At5g3160 en utilisant l'ADN ligase T4.
      1. Incuber 50 ng d'insert et 20 ng de vecteur dans le tampon de ligase 1x et 1 unité d'ADN ligase T4 pendant une nuit à 17 ° C. Transformer la ligature dans E. cellules coli DH5a et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 34 pg / ml de chlo -1ramphenicol par incubation de 37 ° C pendant 24 heures. 4
  3. Clonage de UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate méso Ligase -2,6-diaminopimélate (Mure) de V. spinosum pour complémentation fonctionnelle.
    NOTE: Le clonage de l'ORF Mure de V. spinosum a été décrit précédemment. 18
    1. Amplifier le cadre de lecture ouvert par PCR. Utiliser 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min. Inclure 12 pmoles de chaque amorce, 1 mM MgSO4, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynucléotide triphosphates, 0,5 ng d'ADN matrice et une unité d'ADN polymerase Pfx. Puis cloner dans le plasmide pET100D pour produire le plasmide pET100D :: Vs Mure.
      REMARQUE: Les amorces utilisées pour le clonage de la mure Vs sont les suivantes:
      Vs de CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT Mure F- -3 '
      ContreMure R- 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
    2. Pour produire le plasmide pour la complémentation fonctionnelle, digérer la pET100D :: Vs Mure
      Avec les enzymes de restriction Xbal et Sal1 et ligaturer l'insert dans pBAD33 pour produire le plasmide pBAD33 recombinant :: Vs Mure en utilisant l' ADN ligase T4.
      1. Incuber 50 ng d'insert et 20 ng de vecteur dans le tampon ligase 1 x, avec 1 unité d'ADN ligase de T4, pendant une nuit à 17 ° C. Transformer la ligature dans E. cellules coli DH5a et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 34 pg / ml de chloramphénicol -1 par incubation 37 ° C pendant 24 heures. 8
  4. Clonage de Marmite relA / (de rsh) de Novosphingobium sp pour complémentation fonctionnelle.
    . REMARQUE: Le clonage du rsh de Novosphingobium sp a été décrit précédemment 17.
    1. Amplifier l'ORF rsh en plus de 599 nucléotides UPSTramette du site de début d'initiation et de 46 nucléotides en aval du site de terminaison par PCR. Utiliser 1 cycle à 94 ° C pendant 2 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 15 secondes, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min. Inclure 12 pmoles de chaque amorce, 1 mM MgSO4, 0,5 mM de chacun des quatre désoxynucléotide triphosphates, 0,5 ng d'ADN matrice et 1 unité de Taq ADN polymerase. Puis cloner dans le plasmide pCR2.1 pour produire pCR2.1 :: Nsp rsh.
      1. Incuber 1 ul de fragment amplifié par PCR, 1 pi de vecteur pCR2.1, 1 pl de solution de sel et 1 pl d'eau. Incuber à 25 ° C pendant 5 min et 2 pi de ligature dans E. coli, des cellules et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine -1 en faisant incuber 37 ° C pendant 24 heures.
        REMARQUE: Les amorces utilisées pour le clonage de la rsh sont les suivantes:
        rsh F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        rsh R- 5'GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Pour complémentation fonctionnelle, digérer le plasmide pCR2.1 :: Nsp rsh avec EcoR1 et ligaturer l'insert dans la large gamme d'hôtes pRK290 pour produire le plasmide recombinant pRK290 :: Nsp RSH en utilisant l' ADN ligase T4.
        1. Incuber 50 ng d'insert et 20 ng de vecteur dans le tampon de ligase 1x et 1 unité d'ADN ligase T4 pendant une nuit à 17 ° C. Transformer la ligature dans E. cellules coli DH5a et écran pour les colonies sur des plaques LB additionné de 10 pg / ml de tetracycline -1 en incubant 37 ° C pendant 24 heures. 17

2. Préparation des cellules bactériennes électro-compétentes pour faciliter la transformation

REMARQUE: La préparation des cellules électro-compétentes sont basées sur le protocole 26 pour 1,0 litre de culture qui peut être réduite à un volume plus faible ( à savoir, 250 ml). S'il vous plaît noter que ce protocole peut be utilisé pour faire toutes les souches compétentes sont décrites dans ce manuscrit pour faciliter la FCA. 22

  1. Inoculer 50 ml de milieu liquide avec une seule colonie dans un ballon et se développer pendant la nuit, en prenant soin de vérifier le génotype du mutant avant le début de cette étape (tableau 2).
  2. Le deuxième jour, inoculer 1,0 litres de milieu approprié (LB pour des mutants de E. coli et PD pour Novosphingobium sp) avec 50 ml de la culture pendant une nuit, et croître jusqu'à une DO600 de 0,4 à 0,6 (phase log) à 30 ° C.
  3. Cellules de récolte par centrifugation à 5000 xg pendant 15 min à 4 ° C, Décanter le surnageant et remettre le culot dans 500 ml de glacée stérile pur H 2 O.
  4. Centrifuger les cellules à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C, transvaser le surnageant et remettre en suspension le culot dans 250 ml de stérile glacée 10% de glycérol.
  5. Centrifuger les cellules à 5000 xg pendant 20 min à 4 ° C, transvaser le supernatant et resuspendre le culot dans 2,0 ml de 10% de glycérol.
  6. Aliquoter les cellules en transférant 50 pi dans des tubes micro-centrifugeuse et geler immédiatement en plaçant les tubes dans un bain de glace sèche-éthanol. Stocker les cellules compétentes à -80 ° C pour l'électroporation.

3. électroporation des cellules bactériennes avec complémentation Plasmides

  1. Pour l'électroporation, ajouter 1,0 ul (10-50 ng) du plasmide recombinant à une aliquote (50 ul) de cellules compétentes et les placer sur de la glace pendant 5 min.
  2. Transférer le mélange via pipetage dans une cuvette d'électroporation et mettre l'appareil d'électroporation au réglage suivant: 25 pF capacité, 2,5 kV et 200 ohm de résistance et de délivrer une impulsion.
  3. Ajouter 1,0 ml de milieu de récupération (LB) à la cuvette d'électroporation et de transfert à l'aide d'une pipette dans un tube conique de 15 ml. Récupérer avec une rotation douce pendant 60 min dans un incubateur à agitation.
  4. Plaque 100 pl de la culture de la recopas très sur les plaques d'agar pour sélectionner les transformants par pipetage et la diffusion à l'aide d'un épandeur stérile.
    REMARQUE: Assurez - vous de vérifier le tableau 1 et le tableau 2 avant le début de cette étape pour vérifier les antibiotiques et les génotypes pour rendre les plaques d' agar appropriées.

4. Transformation de AOH1 pour faciliter la complémentation fonctionnelle Utilisation L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPL)

  1. Pour une analyse de complémentation, transformer AOH1 avec le vecteur vide (pBAD33), et avec les vecteurs d'expression DAPL dans les événements de transformation séparés en utilisant le protocole d'électroporation décrit à la section 3.0.
  2. Sélectionner des transformants par étalement sur ​​du milieu gélose LB additionné de 50 pg / ml -1 DAP et 34 pg / ml de chloramphenicol -1 et 50 pg / ml de kanamycine -1.
  3. Test de complémentation fonctionnelle par des colonies réplique-placage par stries sur LB-moidium à 0,2% (p / v) d' arabinose , avec ou sans 50 pg / ml -1 DAP et 34 pg / ml de kanamycine -1.
  4. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 heures et observer les résultats.
    REMARQUE: Le résultat doit montrer que le mutant est seulement capable de croître sur des milieux sans DAP uniquement lorsque le gène est exprimé DAPL en arrière-plan mutante par rapport au vecteur seul contrôle.

5. Transformation de TKL-11 pour faciliter la complémentation fonctionnelle utilisant UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6- méso -diaminopimelate ligase (Mure)

  1. Transformer le mutant avec le vecteur vide (pBAD33) et avec le vecteur Mure exprimant (pBAD33 :: VsmurE) en utilisant le protocole décrit dans la section 3.0.
  2. Plate et sélectionnez transformants sur un milieu de gélose LB additionné de 50 pg / ml de thymine -1 et 34 pg / ml -1 chloramphénicol et incuber les plaques à 30 ° C pendant 24 heures.
  3. Test pour la complémentation en ensemençant des colonies ou de placage à la fois le contrôle et les transformations expérimentales sur deux milieu LB plus 0,2% (p / v) d' arabinose et 50 ug / ml de thymine -1.
  4. Incuber une plaque à 30 ° C et l'autre à 42 ° C pendant 24 heures pour évaluer visuellement le phénotype de croissance.
    NOTE: Les résultats doivent montrer que le mutant est capable de croître à 42 ° C seulement lorsque le gène est exprimé Mure en arrière-plan mutant par rapport au vecteur seul contrôle.

6. Transformation de DL39 pour faciliter la complémentation fonctionnelle utilisant Tyrosine aminotransférase (tyrB)

  1. Transform DL39 soit avec pBAD33 ou pBAD33 :: At5g36160 et sélectionnez transformants sur des plaques d'agar LB additionné de tyrosine 50 pg / ml -1, 50 pg / ml phénylalanine -1, et 34 pg / ml de chloramphénicol -1 en utilisant le protocole décrit dans la section 3.0.
  2. Réplique-plate colonies (M9) sur un milieu minimal avec 50 pg / ml phenylalanine -1 et 50 pg / ml tyrosine -1, 50 pg / ml -1 aspartate, 50 pg / ml de leucine -1, 50 pg / ml -1 valine 50 pg / ml isoleucine -1, 10 pg / ml d' uracile -1 0,5% (p / v) de glycerol, 0,2% (p / v) d' arabinose. Aussi colonies réplique-plaque sur des plaques dépourvues de phénylalanine et de la tyrosine en striant la même colonie des deux plaques.
  3. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 48 heures pour observer le phénotype de croissance.
    REMARQUE: Le résultat doit montrer que le mutant est seulement capable de croître sur des milieux phénylalanine et de tyrosine libre, uniquement lorsque le gène tyrB est exprimé dans le fond mutant par rapport au vecteur seul contrôle.

7. Transformation de Hx699 pour faciliter complémentation fonctionnelle du Hypomucoid Phénotype de Novosphingobium sp. Strain Hx699

  1. Transform souche de type sauvage Novosphingobium sp. (Rr2-17) et le Hx699 mutant avec pRK290 et pRK290 :: rsh Nsp dans 2 événements de transformation séparés en utilisant le protocole de transformation décrit dans la section 3.0.
  2. Plate les transformations sur la pomme de terre dextrose (PD) agar additionné de 10 pg / ml -1 tétracycline, et incuber pendant au moins 24 heures ou jusqu'à ce que les transformants apparaissent.
  3. Streak deux transformations dans un «X» sur des plaques d'agar PD frais et incuber à 30 ° C pendant au moins 4 jours. Observer les phénotypes du vecteur seulement, et l'expérience en examinant visuellement le phénotype des deux plaques de croissance.
    NOTE: Le résultat doit montrer que le phénotype hypo-muqueux est complété lorsque rsh est exprimé en arrière-plan mutant par rapport au vecteur seul contrôle.

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Résultats

Les souches bactériennes qui sont utilisés dans les différentes analyses de complémentation fonctionnelle sont énumérées dans le tableau 2.

Analyse fonctionnelle de complémentation: L, L-diaminopimélate aminotransférase (DAPL)

E. coli mutant double AOH1 (Δ :: dapD Kan2, dapE6) héberge une mutation dans le gène...

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Discussion

Bon nombre des cours qui font partie intégrante de la biotechnologie et de curriculum bioscience moléculaire à l'Institut de technologie de Rochester ont une composante de laboratoire en plus de la partie de lecture du cours. Le programme d'études pour l'année scolaire 2014-2015 contient un total de 48 cours, dont 29 contiennent un composant de laboratoire qui représentent environ 60%. Un tel cours est Fondements de la biochimie et de pathologie des plantes (FPBP), une conférence / cours de laboratoir...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

AOH et MAS reconnaît le Collège des sciences et de l'école Thomas H. Gosnell des sciences de la vie à l'Institut de technologie de Rochester pour le soutien. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation nationale américaine des sciences (NSF) de prix à AOH MCB-1120541.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantsHudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Potato Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
AspartateSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

Références

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