JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

התיקוף של פעילות אנזימטית מעורבת הביוכימיים ניתן הובהר באמצעות ניתוח השלמה תפקודי (FCA). מתואר בכתב היד הזה הוא assay FCA הוכחת הפעילות האנזימטית של אנזימים מעורבים במטבוליזם של חומצות אמינו, תגובה מחמירה חיידקים וביוסינטזה פפטידוגליקן חיידקים.

Abstract

Assay השלמה הפונקציונלית (FCA) היא assay in vivo כי נעשה שימוש נרחב על מנת להבהיר את הפונקציה / התפקיד של גנים / אנזימים. טכניקה זו נפוצה מאוד ביוכימיה, גנטיקה ותחומים רבים אחרים. סקירה מקיפה של הטכניקה כדי להשלים את הוראת הביוכימיים הקשורים לחומצות אמינו, פפטידוגליקן והתגובה מחמירה החיידקים מדווחת כתב היד הזה. שני cDNAs מן thaliana ארבידופסיס האורגניזם צמח מודל מעורבים במטבוליזם של ליזין (L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) ו aminotransferase טירוזין (tyrB) המעורבים במטבוליזם של טירוזין ו פנילאלנין מודגשים. בנוסף, פפטידוגליקן חיידקי מסלול אנבוליים מודגש באמצעות הניתוח של גן UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) מן spinosum חיידק Verrucomicrobium מעורב הצלב-linking של פפטידוגליקן. התגובה מחמירה החיידקים מדווחת גם באמצעות הניתוח של RSH (omolog h הסיר s r ELA /) גן bifunctional אחראי פנוטיפ היפר-רירני ב sp Novosphingobium החיידק. ארבע דוגמאות של FCA מוצגות. הווידאו יתמקד בשלושה מהם, כלומר ליזין, פפטידוגליקן ואת התגובה המחמירה.

Introduction

השלמה פונקציונלית בהקשר של הבהרת הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גן מוגדרת כיכולת של הומולוגי בפרט או גן orthologous לשחזר מוטציה מסוימת עם פנוטיפ הנצפה למדינת wild-type כאשר ההומולוגי או גן orthologous הוא הציג ציס או טרנס לתוך רקע המוטציה. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לבודד ולזהות את הפונקציה (ים) / תפקיד (ים) של גנים רבים. דוגמה מסוימת אחת היא בידוד וזיהוי של decarboxylase orotidine-5-פוספט קנדידה אלביקנס באמצעות מוטציה URA3 של ס cerevisiae ואת מוטצית pyrF של E. coli. 1 המחברים השתמשו בטכניקה זו כדי להבהיר את הפונקציה של גנים מעורבים במטבוליזם של חומצות אמינו, פפטידוגליקן והתגובה מחמירה בתוכניות המחקר שלהם שלבו טכניקה זו לתוכניות ההוראה שלהם Biotechnology ו Bioscience מולקולרית (BMB) תוכנית במכון רוצ'סטר לטכנולוגיה (RIT).

המחברים ללמד יסודות הצמח ביוכימיה / פתולוגיה (FPBP) (Hudson) ו Bioseparations: עקרונות ושיטות (BPP) (Hudson / Savka), שני קורסי בחירת חלוקה עליונות במעבדות בתכנית BMB בבית RIT. מכיוון שחלק מן הנושאים נדונים הקורסים מזוהים עם תחומי המחקר, החוקרים שלבו רבים של טכניקות וכלים ניסיוניים המשמשות בתוכניות המחקר שלהם לשתי אלה מבוססי קורסי מעבדה. דוגמא אחת כזו היא השלמה פונקציונלית כתרגיל במעבדה כדי לחזק את חומרי הרצאה הנוגעים אמינו מטבוליזם חומצה מצמח, פפטידוגליקן ואת חילוף חומרי תגובה המחמיר מחיידקים.

שלושת מסלולי חומצת אמינו מצמחים הנדונות בקורס FPBB הם של ליזין (ליס), טירוזין(Tyr) ו פנילאלנין (Phe). מסלול ליס מודגש כמובן בגלל החשיבות של החומצות אמיניות כמו חומצת אמינו חיונית עבור כל בעלי החיים במיוחד בני האדם מאז חיות חסרות את המנגנון הגנטי לסנתז ליס דה נובו. בנוסף, התגלה לאחרונה כי מפעלים מעסיקים מסלול לסינתזה של ליס שונה מהותית מזו של חיידקים. תגלית זו התאפשרה חלקית על ידי השלמה תפקודית של E. coli diaminopimelate (DAP) מוטנטים באמצעות הגן המקודד את האנזים L, L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) מן thaliana ארבידופסיס צמח המודל. 2 מסלולים גרסה לסינתזה של ליס דרך diaminopimelate ביניים מוצגים באיור 1. בנוסף , הסינתזה של ליס מקלה דרך המשפחה נגזר aspartate של חומצות אמינו אשר פיקוח הדוק. 3 בנוסף וחשיבותם synt חלבוןhesis, המסלולים עבור Tyr ו Phe מודגשים נתונים וחשיבותם משמשים תרכובות מבשרות על אנאבוליזם של תרכובות phenylpropanoid מעורבים בסינתזה של תרכובות גינת צמח כגון:. אלקלואידים, lignins, פלבנואידים, isoflavonoids, חומצת hydroxycinnamic בין היתר 4 Tyr שבילי Phe מודגשים גם להראות את ההבדל בין המפעל לבין המסלולים אנבוליים חיידקים. אצל חיידקים, aminotransferase טירוזין אנזים (TyrB) מעורב אנאבוליזם של חומצות אמינו, ואילו צמחים, האנזים מעורב בעיקר פירוק של Tyr ו Phe והוא אינו מעורב אנאבוליזם של חומצות אמינו אלו. (איור 2). 4

ההבדלים בין גראם חיוביים חיידקים גרם-שליליים לגבי מבנהו של פפטידוגליקן (PG) מודגשים הקורס FPBP. האחריות ההורית של חיידקים גראם שליליים הוא אינטרסים בכל הנוגע בטיפול מחלות צמחים מבוססים על העובדה כי רובפתוגנים צמח הם גראם שליליים. הסקירה אחרונה לגבי 10 פתוגנים פייטו חיידקים העליונים חשפה שכל הם שלילי גראם. החיידקים היו מן הסוגים:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ו Pectobacterium 5 אחד ההבדלים הכימיים כאשר משווה בין גזע PG של חיידקים חיוביים שליליים גראם גרמו ההבדל בין אמינו מקשרים הצולב חומצות של שני הסוגים. השלב הראשוני כי cross-linking השונה של PG מתרחש בשלב cytoplasmic של אנאבוליזם PG והוא בהנחייתם של האנזים UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) (איור 3 א). Mure מזרז תוספת של תרכובת diamine מסוימת במיקום השלישי של גזע פפטיד. 6 אצל החיידקים השליליים ביותר גראם, את ליס הלפני האחרון מבשר, טווה -diaminopimelate ( -DAP מ ') משמש cross-linking חומצת אמינו ליס משרתת אותו תפקיד PG של חיידקים חיוביים ביותר גראם (איור 3 ב). 7 זאת בשל העובדה כי הן מ -DAP ו ליס להחזיק שני אמין קבוצות מסוגלות להרכיב שני קשרים פפטידיים עבור גזע פפטיד cross-linking.

בשנתי ה Bioseparations: עקרונות והשיטות (BPP) כמובן, את ההבדלים בין מערכות פתוחות וסגורות לגידול חיידקים וכיצד רמות המזין ישתנה באופן משמעותי בשני המערכות בשל שינויים סביבתיים הם דנו. אירועים אלו צמודים לשינויים רגולטוריים שנקראו "משמרת למטה" או "משמר את" מופעל על ידי רעב או אספקה ​​נאותה של חומצות אמינו או אנרגיה. "המשמרת למטה" התגובה יכולה להתרחש כאשר תרבית חיידקים מועברת מדיום עשיר ומורכב עד בינוני הגדרה כימית עם מקור פחמן יחיד. שינוי זה בסביבה מובילה cessa המהירהtion של סינתזת tRNA ו rRNA. תוצאות הפסקת זה בחוסר ריבוזומים, חלבון וסינתזה DNA למרות ביוסינתזה של חומצות אמינו הן שהוגברו.

בעקבות התגובה "משמרת למטה", הריבוזומים הקיימים משמשים לייצור אנזימים חדשים לסנתז את חומצות אמינו אינה זמינה יותר בטווח הבינוני או הסביבה. לאחר פרק זמן מסוים, סינתזת rRNA וריבוזומים חדשים עברו הרכבה ואת אוכלוסיית תאים חיידקיים מתחילה לגדול אף בשיעור מופחת. את מהלך האירועים שמכונה "תגובה המחמירה" או "בקרה מחמירה" והוא דוגמא של רגולצית הסלולר העולמית יכול להיחשב מנגנון התאמת מנגנון biosynthetic של התא כדי לפצות על הזמינות של מצעים הנדרשים צרכי אנרגיה 8. התגובה המחמירה ובכך מאפשרת לחיידקים להגיב במהירות ונתיבים של חומרים מזינים בסביבה ותורמת ו enhהשונויות המוס רות היכולת של חיידקים להתחרות בסביבות שיכול להשתנות במהירות לגבי מזין או זמינות המצע. 8-9

התגובה המחמירה יש תפקיד אינטגרלי ביטוי גנים כאשר הזמינות של חומצות אמינו, פחמן, חנקן, פוספט, וחומצות שומן מוגבלת. 8,10-14 זה תגובה מחמירה מרוכזת על ידי שני נוקלאוטידים, tetraphosphate guanosine (ppGpp) ו guanosine pentaphosphate (pppGpp) התייחס יחד בכינויו alarmone (p) ppGpp. לדוגמה, כאשר חומצות אמינו מוגבלים-מה שעלול להוביל צוואר בקבוק בסינתזה-החלבון alarmone, guanosine 3,5- (BIS) pyrophosphate (ppGpp), נגזר אנאבוליזם של guanosine 3-diphosphate 5 אדנוזין (pppGpp) מצטבר בתא. השינוי (p) רמת ppGpp מעורב ביטוי של גנים המווסתים את התגובה להתגבר על חוסר המצעים בסביבה כי הם מעורבים ישירות צמיחת תאי development. שני הגנים המעורבים בתהליך זה נקראים רלה ספוט. רלה הוא synthetase הקשורים-הריבוזום (p) ppGpp כי הוא מעורב תגובת ההצטברות של tRNAs טעון כי הוא התוצאה של הגבלה של חומצות אמיניות. פונקציות ספוט כמו synthetase ו hydrolase bifunctional (p) ppGpp. פעילות synthetase של ספוט מעורבת בתגובת חוסר רעב פחמן חומצות שומן. 8 homologs רלה / ספוט נפוץ בצמחים ובבעלי חיידקים מכונים RSH עבור omologs R ELA / S סיר h. 8,10 -12,16 כתב יד שנערך לאחרונה הראה כי קיים חלבון RSH ספציפי המעורבים בסינתזה של alarmones אלה מן Rr sp החיידק Novosphingobium 2-17. 17

כאן אנו מציגים ארבעה הביוכימיים קשורים אל מבחני ההשלמה הפונקציונליים. מבחני ההשלמה המפורטים בכתב היד הזה מספק שדרה Explעפרות העסקת assay in vivo זה כאמצעי זיהוי או מאפיינת אנזימים שהם חזו יש פונקציה ידועה / משוערת (ים) או ככלי הוראה להשלים את הוראת הביוכימיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: המחברים מוכנים לספק זני חיידקים ו פלסמידים רקומביננטי כדי להקל על השילוב של ניתוח השלמה פונקציונלי למטרות הוראה ליחידים מעוניינים. פלסמידים ששימשו כדי להקל ניסויים השלמה פונקציונלי מפורטים בטבלה 1.

1. בניית פלסמידים עבור השלמה פונקציונלית

  1. שיבוט של Diaminopimelate aminotransferase (dapL) עבור השלמה פונקציונלית.
    1. הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה dapL (ORF) מן V. spinosum ו cDNAs מן א thaliana ו- C. reinhardtii ידי PCR. השתמש 1 מחזור ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. כלול 12 pmoles של כל צבע יסוד, 1 מ"מ MgSO 4, 0.5 מ"מ כל אחד 4 triphosphates deoxynucleotide, ו -0.5 ננוגרם של תבנית ה- DNA ו 1 יחידת PFXDNA פולימרז.
      הערה: התיאור המלא הנוגעים שיבוט רקומביננטי של שלושה orthologs dapL מן א הצמח thaliana (בשעה -dapL), החיידק Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) ואת אצה Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) כבר פורסם בעבר. 2,18-20
      הערה: פריימרים המשמשים השיבוט של orthologs dapL הם כדלקמן:
      Vs dapL F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 "
      Vs dapL R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 "
      בשעה dapL F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 "
      בשעה dapL R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 "
      Cr dapL F-5'- 'CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3
      Cr dapL R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 "
    2. Clone שברי PCR לתוך tהוא פלסמיד pET30A לייצר פלסמידים רקומביננטי, pET30A :: Vs dapL, pET30A :: בשעה dapL ו pET30A :: Cr dapL באמצעות פריימרים, אנזימי הגבלה ו האנזים T4 DNA.
      1. בקצרה, דגירה 50 ng של הכנס ו -20 ננוגרם של וקטור במאגר האנזים 1x ו 1 יחידה של האנזים T4 DNA לילה בשעה 17 ° C. Transform קשירה לתוך E. תאים ומסך coli Dh5α עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל -1 kanamycin ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 18-20
    3. כדי ליצור את הפלסמיד עבור השלמה פונקציונלית, לעכל pET30A :: Vs dapL ו pET30A :: בשעת פלסמידים dapL עם הגבלת אנזימי XbaI ו סאלי XbaI ו HindIII עבור dapL pET30A :: Cr. ולקשור מחדיר לתוך pBAD33 פלסמיד באמצעות האנזים T4 DNA כדי לייצר את פלסמידים pBAD33 :: Vs dapL; pBAD33 :: בשעה dapL ו pBAD33 :: Cr dapL.
      1. דגירה 50 ng של הכנס ו -20 ngשל וקטור במאגר האנזים 1x ו 1 יחידה של האנזים T4 DNA לילה בשעה 17 ° C. Transform קשירה לתוך E. תאים ומסך coli Dh5α עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 34 מיקרוגרם / מ"ל -1 kanamycin ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 20
  2. שיבוט של טירוזין aminotransferase (tyrB) מ א thaliana עבור השלמה פונקציונלית.
    הערה: פירוט מלא של שיבוט של cDNA מ א thaliana מבואר ידי תגיות מוקד At5g36160 תואר בעבר. 4
    1. להגביר את cDNA על ידי PCR. השתמש 1 מחזור ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. כלול 12 pmoles של כל צבע יסוד, 1 מ"מ 4 MgSO, 0.5 מ"מ כל אחד מארבעת triphosphates deoxynucleotide, ו -0.5 ננוגרם של DNA תבנית 1 יחידה של פולימראז PFX DNA.
      הערה: פריימרים המשמשים CLoning של At5g36160 הם כדלקמן:
      בשעה tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 "
    2. Clone את הפיסה לתוך pET30A פלסמיד לייצר פלסמידים רקומביננטי pET30A :: At5g36160 ידי לעכל שבר PCR עם EcoR1 ו Sal1; ולקשור את הפיסה לתוך pET30A באמצעות האנזים T4 DNA כמתואר להלן. 4
    3. כדי ליצור את הפלסמיד השלם הפונקציונלי, לעכל את pET30A :: At5g36160 עם הגבלת אנזימי XbaI ו HindIII, ולקשור את הכנס לתוך pBAD33 באמצעות אותם אתרי אנזים ההגבלה לייצר פלסמיד רקומביננטי pBAD33 :: At5g3160 באמצעות אנזים T4 DNA.
      1. דגירה 50 ng של הכנס ו -20 ננוגרם של וקטור במאגר האנזים 1x ויחידת 1 של האנזים T4 DNA לילה ב C 17 °. להפוך את הקשירה לתוך E. תאים ומסך coli Dh5α עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 34 מיקרוגרם / מ"ל Chlo -1ramphenicol ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 4
  3. שיבוט של UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate- טווה אנזים -2,6-diaminopimelate (Mure) מ V. spinosum עבור השלמה פונקציונלית.
    הערה: שיבוט של ORF Mure מ V. spinosum תואר בעבר. 18
    1. הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה על ידי PCR. השתמש 1 מחזור ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. כלול 12 pmoles של כל צבע יסוד, 1 מ"מ 4 MgSO, 0.5 מ"מ כל אחד מארבעת triphosphates deoxynucleotide, 0.5 ng של DNA תבנית 1 יחידה של פולימראז PFX DNA. ואז לשבט לתוך פלסמיד pET100D לייצר הפלסמיד pET100D :: Vs Mure.
      הערה: פריימרים המשמשים השיבוט של Vs Mure הם כדלקמן:
      Vs 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT Mure F- -3 '
      לעומתMure R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 "
    2. כדי לייצר את הפלסמיד עבור השלמה פונקציונלית, לעכל את pET100D :: Vs Mure
      עם הגבלה אנזימים XbaI ו Sal1 ולקשור את הכנס לתוך pBAD33 לייצר את pBAD33 פלסמיד רקומביננטי :: Vs Mure באמצעות האנזים T4 DNA.
      1. דגירה 50 ng של הכנס ו -20 ננוגרם של וקטור במאגר האנזים 1x, יחד עם 1 יחידה של האנזים T4 DNA, לילה ב 17 מעלות צלזיוס. Transform קשירה לתוך E. coli Dh5α תאים מסך עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 34 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol -1 ידי דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 8
  4. שיבוט של רלה / s סיר (RSH) מ sp Novosphingobium עבור השלמה פונקציונלית.
    הערה:. השיבוט של RSH מ Novosphingobium sp תוארה בעבר 17.
    1. הגבר את ORF RSH בנוסף 599 נוקלאוטידים upstלקדד של אתר ייזום התחלת 46 נוקלאוטידים downstream באתר הסיום ידי PCR. השתמש 1 מחזור ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. כלול 12 pmoles של כל צבע יסוד, 1 מ"מ 4 MgSO, 0.5 מ"מ כל אחד מארבעת triphosphates deoxynucleotide, 0.5 ng של DNA תבנית 1 יחידה של פולימראז תקי DNA. ואז לשבט לתוך pCR2.1 פלסמיד לייצר pCR2.1 :: NSP RSH.
      1. דגירה 1 μl של שבר מוגבר PCR, 1 μl של וקטור pCR2.1, 1 μl של פתרון מלח 1 μl של מים. לדגור על 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -2 μl של קשירה לתוך E. קולי תאים, ומסך עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל -1 kanamycin ידי דוגרים 37 ° C למשך 24 שעות.
        הערה: פריימרים המשמשים השיבוט של RSH הם כדלקמן:
        RSH F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        RSH R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. עבור השלמה פונקציונלי, לעכל את pCR2.1 פלסמיד :: NSP RSH עם EcoR1 ולקשור את הכנס לתוך pRK290 מגוון רחב מארח לייצר פלסמיד רקומביננטי pRK290 :: NSP RSH באמצעות האנזים T4 DNA.
        1. דגירה 50 ng של הכנס ו -20 ננוגרם של וקטור במאגר האנזים 1x ויחידת 1 של האנזים T4 DNA לילה ב C 17 °. Transform קשירה לתוך E. תאים ומסך coli Dh5α עבור מושבות על צלחות LB בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין -1 ידי דוגרים 37 ° C למשך 24 שעות. 17

2. הכנת אלקטרו מוסמכת תאים חיידקיים כדי להקל טרנספורמציה

הערה: הכנת תאים אלקטרו המוסמכת מבוססת על פרוטוקול 26 עבור 1.0 L של תרבות וניתן לשנותם עד נפח קטן יותר (כלומר, 250 מ"ל). יש לציין כי פרוטוקול זה יכול בדואר המשמש לייצור כל זני מוסמכות מתוארים בכתב היד הזה כדי להקל FCA. 22

  1. לחסן 50 מ"ל של מדיום נוזלי עם מושבה אחת לתוך בקבוק ולגדול במשך הלילה, והקפד לבדוק את הגנוטיפ של מוטציה לפני תחילת שלב זה (טבלה 2).
  2. ביום שני, לחסן 1.0 ליטר של המדיום המתאים (LB עבור מוטציות החיידק ו PD עבור sp Novosphingobium) עם 50 מ"ל של תרבות לילה, ולגדול ל OD 600 0.4-0.6 (יומן שלב) על 30 מעלות ג
  3. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C, למזוג supernatant, ו resuspend גלולה ב 500 מ"ל של H טהור קר כקרח סטרילי 2 O.
  4. צנטריפוגה התאים ב 5000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C, למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 250 מ"ל של גליצרול 10% קר כקרח סטרילי.
  5. צנטריפוגה התאים ב 5000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, למזוג סופרשׂוֹחֶה, ו resuspend גלולה ב 2.0 מ"ל של גליצרול 10%.
  6. Aliquot את התאים על ידי העברת 50 μl לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות ומיד להקפיא על ידי הנחת צינורות באמבט קרח יבש-אתנול. אחסן את התאים המוסמכים ב -80 מעלות צלזיוס במשך electroporation.

3. Electroporation של תאים חיידקיים עם פלסמידים שלם

  1. עבור electroporation, להוסיף 1.0 מיקרוליטר (10-50 ng) של פלסמיד רקומביננטי ל aliquot (50 μl) של תאים מוסמכים ומניח על קרח למשך 5 דקות.
  2. מעבירים את התערובת דרך pipetting אל קובט electroporation ולהגדיר את המנגנון electroporation להגדרה הבאה: 25 קיבול μF, 2.5 קילו וולט, ו -200 התנגדות אוהם ולספק דופק.
  3. להוסיף 1.0 מ"ל של התקשורת התאוששות (LB) כדי קובט electroporation והעברת בעזרת פיפטה כדי צינור חרוטי 15 מ"ל. שחזור עם סיבוב עדין במשך 60 דקות בתוך חממה רועדת.
  4. פלייט 100 μl של תרבות מן recoצעד מאוד לצלחות אגר כדי לבחור עבור transformants ידי pipetting והפצת באמצעות מפזר סטרילי.
    הערה: הקפד לבדוק טבלת 1 וטבלה 2 לפני תחילת שלב זה כדי לבדוק את האנטיביוטיקה גנוטיפים לעשות צלחות אגרו הנכונות.

טרנספורמציה 4. AOH1 כדי להקל השלמה תפקודית באמצעות L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL)

  1. לניתוח שלם, להפוך AOH1 עם הווקטור הריק (pBAD33), ועם וקטורי ביטוי DapL באירועי טרנספורמציה נפרדים באמצעות פרוטוקול electroporation המפורטים בסעיף 3.0.
  2. בחר transformants ידי ציפוי על מצע אגר LB בתוספת 50 מ"ל / מיקרוגרם -1 DAP ו chloramphenicol 34 מיקרוגרם / מ"ל -1 ו -50 מיקרוגרם / מ"ל -1 kanamycin.
  3. מבחן השלמה תפקודית על ידי מושבות העתק-ציפוי ידי פסים על LB ליdium עם 0.2% (w / v) arabinose עם ובלי 50 מ"ל / מיקרוגרם -1 DAP ו -34 מיקרוגרם / מ"ל -1 kanamycin.
  4. דגירת צלחות על 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ולבחון תוצאות.
    הערה: התוצאה צריכה להראות כי המוטציה היא רק מסוגל לצמוח על תקשורת החופשית DAP רק כאשר גן dapL מתבטא ברקע המוטציה כשמשווה את וקטור בקרה בלבד.

5. טרנספורמציה של TKL-11 כדי להקל על השלמה תפקודית באמצעות UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6- טווינה -diaminopimelate האנזים (Mure)

  1. Transform מוטציה עם וקטור ריק (pBAD33) ועם וקטור להביע Mure (pBAD33 :: VsmurE) באמצעות פרוטוקול המפורטים בסעיף 3.0.
  2. Transformants פלייט ובחר על מדיום אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל תימין -1 ו -34 מיקרוגרם / מ"ל -1 chloramphenicol דגירה צלחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  3. מבחן שלם על ידי פסים או ציפוי מושבות משני מלא התמורות הניסיוניות על מדיום השני LB בתוספת 0.2% (w / v) arabinose ו -50 מיקרוגרם / תימין -1 מיליליטר.
  4. דגירת צלחת אחת ב 30 מעלות צלזיוס, והשני ב 42 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות על מנת להעריך את הפנוטיפ הצמיחה חזותי.
    הערה: התוצאות צריכות להראות כי המוטציה הוא מסוגלת לגדול ב 42 מעלות צלזיוס רק כאשר גן Mure מתבטא ברקע המוטציה לעומת וקטור בקרה בלבד.

טרנספורמציה 6. DL39 כדי להקל השלמה תפקודית באמצעות טירוזין aminotransferase (tyrB)

  1. Transform DL39 עם או pBAD33 או pBAD33 :: At5g36160, ובחר transformants על צלחות אגר LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל טירוזין -1, 50 מיקרוגרם / מ"ל פנילאלנין -1, ו -34 מיקרוגרם / מ"ל chloramphenicol -1 באמצעות פרוטוקול המפורטים בסעיף 3.0.
  2. הֶעתֵק מְדוּיָקמושבות -plate על התקשורת מינימלי (M9) עם 50 מיקרוגרם / מ"ל פנילאלנין -1 ו -50 מיקרוגרם / מ"ל טירוזין -1, 50 מיקרוגרם / מ"ל -1 אספרטט, 50 מיקרוגרם / מ"ל לאוצין -1, 50 מיקרוגרם / מ"ל -1 ולין, 50 מיקרוגרם / מ"ל isoleucine -1, 10 מיקרוגרם / מ"ל -1 אורציל 0.5% (w / v) גליצרול, 0.2% (w / v) arabinose. גם מושבות העתק-צלחת על צלחות חסרות פנילאלנין ו טירוזין ידי פסים באותה המושבה של שני הצלחות.
  3. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי להתבונן פנוטיפ צמיחה.
    הערה: התוצאה צריכה להראות כי המוטציה הוא מסוגל רק לגדול על פנילאלנין ו טירוזין תקשורת חופשית, רק כאשר גן tyrB מתבטא ברקע המוטציה כשמשווה את וקטור בקרה בלבד.

טרנספורמציה 7. Hx699 כדי להקל השלמה פונקציונלית של sp Hypomucoid הפנוטיפ של Novosphingobium. Hx699 זנים

  1. Transform sp זן Novosphingobium wild-type. (Rr2-17) ואת Hx699 מוטציה עם pRK290 ו pRK290 :: RSH NSP ב 2 אירועים טרנספורמציה נפרד באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה המפורטים בסעיף 3.0.
  2. פלייט טרנספורמציות על דקסטרוז תפוחי אדמה (PD) אגר בתוספת 10 מיקרוגרם / מ"ל -1 טטרציקלין, דגירה במשך לפחות 24 שעות או עד transformants להופיע.
  3. Streak הן טרנספורמציות בדפוס "X" על צלחות אגר PD טרי לדגור על 30 ° צלזיוס למשך 4 ימים לפחות. שימו לב פנוטיפים של וקטור בלבד, ולהתנסות ידי בחינת חזותית פנוטיפ צמיחה של שתי הצלחות.
    הערה: התוצאה צריכה להראות כי היפו-רירני הפנוטיפ הוא השלים כאשר RSH מתבטא ברקע מוטציה כשמשווים את וקטור הבקרה בלבד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

זני החיידקים כי מועסקי הניתוחים השלמים הפונקציונליים השונים מפורטים בטבלה 2.

ניתוח השלמה פונקציונלית: L, L-diaminopimelate aminotransferase (dapL)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

רבים מן הקורסים הם חלק בלתי נפרדים ביוטכנולוגיה ו הלימודים ביוסיינס המולקולרית בבית המכון הטכנולוגי של רוצ'סטר יש מרכיב מעבדה בנוסף חלק ההרצאה של הקורס. תוכנית הלימודים של שנת הלימודים 2014-2015 מכיל בסך הכל 48 קורסים, 29 מהם מכילים מרכיב מעבדה המייצגים כ -60%. קורס אחד כזה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

AOH ו MAS מודה המכללה למדע ובית הספר Gosnell Thomas H. למדעי החיים במכון רוצ'סטר לטכנולוגיה לתמיכה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי ארצות הברית הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס AOH MCB-1,120,541.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantsHudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Potato Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
AspartateSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

References

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved