JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Проверка достоверности ферментативных активностей, участвующих в биохимических путей, могут быть объяснены с помощью функционального анализа комплементации (FCA). Описанное в этой рукописи является анализ FCA демонстрирующий ферментативную активность ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, бактериальный строгие реакции и бактериального пептидогликана биосинтеза.

Аннотация

Функциональный анализ комплементационная (FCA) представляет собой анализ в естественных условиях , который широко используется для выяснения функции / роль генов / ферментов. Этот метод является очень распространенным явлением в области биохимии, генетики и многих других дисциплин. Подробный обзор техники в дополнение к преподаванию биохимических путей, имеющих отношение к аминокислотам, пептидогликана и бактериальная жесткие ответ сообщается в этой рукописи. Два кДНК из модели растительного организма Резуховидка Таля, которые участвуют в обмене веществ лизина (L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) и тирозин - аминотрансферазы (tyrB) , участвующих в обмене тирозина и фенилаланина выдвинуты на первый план. Кроме того, бактериальные пептидогликана анаболический путь выделен через анализ -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазная (Мюр) гена UDP- N из бактерии Verrucomicrobium Spinosum , участвующих в скрещивании-linking пептидогликана. Бактериальный жесткие реакции также сообщается посредством анализа РСЗ (г ELA / с горшка ч УДОСТОВЕРЕ) бифункциональный ген , ответственный за гипер-слизистый фенотипа бактерии Novosphingobium зр. Четыре примера FCA представлены. Видео будет сосредоточена на трех из них, а именно лизин, пептидогликана и жестким ответом.

Введение

Функциональная комплементационный в контексте выяснении функцию (и) / роли (ролей) гена определяется как способность конкретного гомологичные или ортологичными гена для восстановления конкретного мутанта с наблюдаемой фенотипа к состоянию дикого типа, когда гомологичные или ортологичными ген вводят в цис- или транс - в мутантный фоне. Этот метод широко используется для выделения и идентификации функции (ы) / роли (ролей) многих генов. Одним из конкретных примеров является выделение и идентификация оротидин-5-фосфат - декарбоксилазы от Candida Albicans использованием URA3 мутант S. CEREVISIAE и pyrF мутант Е. палочки. 1 Авторы использовали эту технику для выяснения функции генов, которые участвуют в обмене аминокислот, пептидогликана и строгий ответ в своих научно - исследовательских программ и включили эту технику в свои учебные программы в Biotechnology и программы в Рочестерского технологического института (RIT) Молекулярная Bioscience (BMB).

Авторы учат Основы биохимии растений / Патология (FPBP) (Hudson) и Bioseparations: Принципы и практика (BPP) (Hudson / Савка), два курса верхнего отдела факультативный лаборатория, базирующаяся в программе BMB ​​на RIT. Так как некоторые из тем, которые обсуждаются в курсах аффилированы с их научными интересами, авторы включили многие из методов и экспериментальных инструментов, которые используются в своих научно-исследовательских программ в этих двух курсов лабораторных основе. Одним из таких примеров является функциональной дополнительности в качестве лабораторного упражнения, чтобы укрепить лекционные материалы, имеющие отношение к метаболизм аминокислот из растений, пептидогликана и строгие реакции метаболизма от бактерий.

Три из путей аминокислот из растений, которые обсуждаются в ходе FPBB является то, что лизин (Lys), тирозин(Тир) и фенилаланин (Phe). Лиз путь выделяется в процессе из - за важности аминокислоты в качестве незаменимой аминокислоты для всех животных , особенно у людей , так как животные не имеют генетический механизм для синтеза лиз De Novo. Кроме того, недавно было установлено, что растения используют путь для синтеза лиз, который значительно отличается от бактерий. Это открытие было частично способствовало функциональной комплементации E. палочки диаминопимелатдегидрогеназу (DAP) мутанты с использованием гена , который кодирует фермент L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) от модели завода Резуховидка Таля. 2 от варианта пути синтеза лиз через промежуточный диаминопимелатдегидрогеназу показаны на рисунке 1. Кроме того , синтез лиз облегчает через аспартат полученные семейства аминокислот , которые строго регламентированы. 3 в дополнение к их важности в белковой Synthesis, тропинки для Tyr и Phe выдвинуты на первый план , учитывая их важность в выступающей в качестве исходных соединений для анаболизм фенилпропаноидных соединений , участвующих в синтезе растительных защитных соединений , таких как:. алкалоиды, лигнины, флавоноиды, изофлавоноидов, гидроксикоричной кислоты среди других 4 Тир и фенилаланина пути также подсвечиваться, чтобы показать разницу между растением и бактериальными анаболических путей. У бактерий фермент тирозин-аминотрансферазы (TyrB) участвует в анаболизм обеих аминокислот, в то время как в растениях, фермент в основном участвует в катаболизме Tyr и Phe и не участвует в анаболизм этих аминокислот. (Рисунок 2). 4

Различия между грамположительных и грамотрицательных бактерий относительно структуры пептидогликана (PG), выделены в FPBP конечно. Программатор грам-отрицательных бактерий, представляет интерес в отношении патологии растений основано на тот факт, что большинствовозбудителей болезней растений являются грамотрицательные. Недавний обзор в отношении 10 лучших бактериальных фито-патогенных микроорганизмов показали, что все грамотрицательные. Бактерии из родов:. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya и Pectobacterium 5 Одним из химических различий при сравнении ствола PG грамотрицательных и грамположительных бактерий , разница между сшивающего амино- кислоты обоих типов. Первым шагом для этого различного сшиванию PG происходит в цитоплазматической ступени PG анаболизм и облегчается с помощью фермента UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигаза (мурэ) (Рисунок 3А). Мурэ катализирует добавление конкретного диамина соединения в третьем положении пептида стебле. 6 В большинстве грамотрицательных бактерий, предпоследний лиз предшественник, мезо -diaminopimelate ( м -DAP) служит в качестве сшивающего аминокислоту и лиз выполняет ту же роль в PG большинства грамположительных бактерий (фиг.3В). 7 Это связано с тем , что оба м -DAP и Lys имеют два амина групп и способны образовывать две пептидные связи пептидных стволовой сшиванием.

В Bioseparations: Принципы и практика (BPP), конечно, различия между открытыми и закрытыми системами для выращивания бактерий и, как уровни питательных веществ существенно изменится в обеих системах из-за изменений окружающей среды обсуждаются. Эти события связаны с регуляторными изменениями называется "сдвиг вниз" или "сдвиг вверх", вызванная голоданием или достаточный запас аминокислот или энергии. "Сдвиг вниз" реакция может произойти, когда бактериальная культура передается из богатой и сложной среде в химически определенной среде с одним источником углерода. Это изменение в окружающей среде приводит к быстрому CESSAция тРНК и рРНК синтеза. Это приводит к отказу от отсутствия рибосом, синтеза белка и ДНК, даже при том, что биосинтез аминокислот активируемых.

После "Сдвиг вниз" ответ, существующие рибосомы используются для производства новых ферментов для синтеза аминокислот, больше не доступны в среде или среде. После некоторого периода времени, синтез рРНК и новые рибосомы собраны и популяция бактериальных клеток начинает расти, хотя по сниженной цене. Ход событий называется "жестким ответом" или "жесткий контроль" и является примером глобальной клеточной регуляции и может рассматриваться в качестве механизма для регулирования биосинтетическую машины ячейки , чтобы компенсировать наличие необходимых субстратов и энергетических потребностей . 8 Строгий ответ , таким образом , позволяет бактериям быстро реагировать на потоки питательных веществ в окружающей среде и способствует и ENHAnces способность бактерий , чтобы конкурировать в условиях , которые могут быстро меняться в отношении питательных веществ и наличия или субстрата. 8-9

Строгий реакция имеет важную роль в экспрессии генов , когда наличие аминокислот, углерода, азота, фосфата и жирных кислот ограничены. 8,10-14 Это жесткие ответ координируется двумя нуклеотидами, гуанозин тетрафосфат (ppGpp) и гуанозина pentaphosphate (pppGpp) обычно называют вместе как alarmone (р) ppGpp. Например, когда аминокислоты с ограниченным, которые могут привести к узким местом в синтеза белка-на alarmone, гуанозин 3,5- (бис) пирофосфат (ppGpp), полученный из анаболизм гуанозин 3-дифосфат 5-трифосфата (pppGpp) накапливает в клетке. Изменение уровня (р) ppGpp участвует в экспрессии генов, которые регулируют реакцию преодолеть отсутствие субстратов в окружающей среде, которые непосредственно вовлечены в рост клеток и РАЗВИТИЕт. Два из генов, которые участвуют в этом процессе, называются Рела и SPOT. RelA является рибосомами, связанный (р) ppGpp синтетазы, который участвует в ответ на накопление тРНК, что является результатом ограничения аминокислоты. Функции SPOT как бифункциональный (р) ppGpp синтетазы и гидролазы. Синтетазы активность SPOT участвует в ответ на отсутствие углерода и жирных кислот голодания. 8 гомологов RelA / SPOT широко распространены в растениях и бактериях и называются Rsh для R ELA / S горшка ч omologs. 8,10 -12,16 Недавно рукопись показал , что существует специфический белок Rsh участвует в синтезе этих alarmones из бактерии Novosphingobium зр Rr 2-17. 17

Здесь мы представляем четыре биохимических путей, привязанными к функциональным комплементационных анализов. Комплементации анализы, описанные в этой рукописи содержится проспект к EXPLруды с использованием этого анализа в естественных условиях в качестве средства идентификации и или характеризующие ферменты, которые предсказаны , чтобы иметь неизвестный / предполагаемую функцию (ы) или в качестве учебно - методических пособий в дополнение к преподаванию биохимических путей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Авторы готовы предоставить бактериальные штаммы и рекомбинантные плазмиды с целью содействия включению функционального анализа комплементационной для целей обучения для лиц, которые заинтересованы. Плазмиды , которые были использованы для облегчения проведения функциональных экспериментов комплементационной приведены в таблице 1.

1. Конструирование плазмид для функциональной дополнительности

  1. Клонирование диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ) для функциональной дополнительности.
    1. Усилить ДАПЛ открытую рамку считывания (ORF) из V. Spinosum и от A. кДНК thaliana и C. reinhardtii с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из 4 дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица PFXДНК-полимеразы.
      Примечание: Полное описание , относящиеся к рекомбинантным клонированием трех ДАПЛ ортологи из растений A. thaliana (В -dapL), бактерия Verrucomicrobium Spinosum (Vs -dapL) и водоросль Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) была ранее опубликована. 2,18-20
      Примечание: праймеры, используемые для клонирования ортологах ДАПЛ заключаются в следующем:
      Vs ДАПЛ F- 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      Vs ДАПЛ R 5'- CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      На ДАПЛ F- 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3 '
      В ДАПЛ R-5'- GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr ДАПЛ F-5'- CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      Cr ДАПЛ R -5'- CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
    2. Клонирование фрагментов ПЦР в тон , как и плазмида pET30A для получения рекомбинантных плазмид, pET30A :: Vs ДАПЛ, pET30A :: В ДАПЛ и pET30A :: Cr ДАПЛ с использованием праймеров, ферменты рестрикции и ДНК - лигазы Т4.
      1. В кратком изложении, инкубировать 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 50 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования при 37 ° С в течение 24 ч. 18-20
    3. Для создания плазмиды для функциональной комплементации, переваривать pET30A :: Vs ДАПЛ и pET30A :: В ДАПЛ плазмид ферментами рестрикции XbaI и SalI и XbaI и HindIII для pET30A :: Cr ДАПЛ. Лигирования вставки в плазмиду pBAD33 с использованием ДНК - лигазы Т4 с получением плазмиды pBAD33 :: Vs ДАПЛ; pBAD33 :: В ДАПЛ и pBAD33 :: Cr ДАПЛ.
      1. Выдержите 50 нг вставки и 20 нгвектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 34 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 20
  2. Клонирование тирозинаминотрансферазы (tyrB) от А. thaliana для функциональной дополнительности.
    Примечание: Полные подробности , касающиеся клонирования кДНК из A. thaliana аннотированный локусом тегов At5g36160 был описан ранее. 4
    1. Amplify кДНК с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, и 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы.
      Примечание: праймеры, используемые для ХЛческими из At5g36160 заключаются в следующем:
      На tyrB F- 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
      AttyrB R- 5'- CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
    2. Клонирование фрагмента в плазмиду pET30A для получения рекомбинантных плазмид pET30A :: At5g36160 расщеплением ПЦР-фрагмента с EcoR1 и Sal1; лигировать в фрагмента в pET30A с использованием ДНК - лигазы Т4 , как описано ниже. 4
    3. Чтобы создать функциональную плазмиду комплементации, переваривают pET30A :: At5g36160 ферментами рестрикции XbaI и HindIII, и лигируют вставку в pBAD33 используя те же сайты ферментов рестрикции для получения рекомбинантной плазмиды pBAD33 :: At5g3160 с использованием ДНК-лигазы Т4.
      1. Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform лигирование в Е. палочка DH5 & клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 34 мкг / мл -1 Chloramphenicol путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 4
  3. Клонирование UDP- N -acetylmuramoyl-L-аланил-D-glutamate- мезо -2,6-диаминопимелатдегидрогеназу лигазы (мурэ) из V. Spinosum для функциональной дополнительности.
    Примечание: Клонирование MURE ORF из V. Spinosum было описано ранее. 18
    1. Усилить открытую рамку считывания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Pfx ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pET100D для получения плазмиды pET100D :: Vs Мюр.
      Примечание: праймеры , используемые для клонирования Vs MURE заключаются в следующем:
      Vs MURE F- 5'- CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT -3 '
      VsMURE R- 5'- GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
    2. Для получения плазмиды для функциональной дополнительности, переваривать pET100D :: Vs MURE
      Ферментами рестрикции XbaI и Sal1 и лигирования вставки в pBAD33 получением рекомбинантной плазмиды pBAD33 :: Vs мурэ с использованием ДНК - лигазы Т4.
      1. Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы, вместе с 1 единицу ДНК-лигазы Т4, в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. клетки и экран палочки для DH5 & колоний на LB пластинах с 34 мкг / мл -1 хлорамфеникол , дополненных инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 8
  4. Клонирование Рела / с горшка (РСЗ) из Novosphingobium зр для функциональной дополнительности.
    Примечание:. Клонирование РСЗ из Novosphingobium зр было описано ранее 17.
    1. Усилить РСЗ ORF в дополнение к 599 нуклеотидами upstстопка сайта старта инициации и 46 нуклеотидов ниже по течению на месте окончания с помощью ПЦР. С помощью 1 цикл при 94 ° С в течение 2 мин, а затем 30 циклов при 94 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек и 72 & deg; С в течение 2 мин. Включают 12 пмоль каждого праймера, 1 мМ MgSO 4, 0,5 мМ каждого из четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, 0,5 нг матричной ДНК и 1 единица Taq - ДНК - полимеразы. Затем клонировать в плазмиду pCR2.1 для производства pCR2.1 :: NSP RSH.
      1. Выдержите 1 мкл ПЦР-амплификации фрагмента 1 мкл вектора pCR2.1 1 мкл солевого раствора и 1 мкл воды. Инкубируют при 25 ° С в течение 5 мин и 2 мкл лигирование в E. палочки клетки и пропускают через сито для колоний на LB пластинах с добавлением 50 мкг / мл канамицина -1 путем инкубирования 37 ° C в течение 24 часов.
        Примечание: праймеры, используемые для клонирования РСЗ заключаются в следующем:
        RSH F- 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC -3 '
        RSH R- 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT -3 '
      2. Для функциональной комплементации, переваривают плазмиду pCR2.1 :: Nsp РСЗ с EcoR1 и лигировать вставку в pRK290 широком диапазоне хозяина для получения рекомбинантной плазмиды pRK290 :: NSP РСЗ с использованием ДНК - лигазы Т4.
        1. Инкубируют 50 нг вставки и 20 нг вектора в 1х буфере дл лигазы и 1 единицу ДНК-лигазы Т4 в течение ночи при 17 ° С. Transform перевязку в E. палочка DH5 & alpha ; клетки и экран для колоний на LB пластинах с добавлением 10 мкг / мл тетрациклина -1 путем инкубирования 37 ° С в течение 24 ч. 17

2. Получение Электрогидравлический компетентных бактериальных клеток с целью содействия трансформации

Примечание: Получение электромеханических компетентных клеток основан на протоколе 26 для 1,0 л культуры , которая может быть масштабирована до меньшего объема (то есть, 250 мл). Обратите внимание, что этот протокол может бе используется , чтобы сделать все штаммы компетентны, которые описаны в этой рукописи , чтобы облегчить FCA. 22

  1. Привить 50 мл жидкой среды с одной колонии в колбу и расти в течение ночи, убедившись в том , чтобы проверить генотип мутанта перед началом этого шага (таблица 2).
  2. На второй день инокуляции 1,0 л соответствующей среде (LB для E. мутантов палочки и PD для Novosphingobium SP) с 50 мл ночной культуры, и вырасти до OD 600 до 0.4-0.6 (логарифмической фазы) при 30 ° C.
  3. Урожай клетки центрифугированием при 5000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С, сливают супернатант, и ресуспендируют осадок в 500 мл стерильной охлажденной льдом чистого Н 2 О.
  4. Центрифуга клетки при 5000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С, сливают супернатант и ресуспендируют осадок в 250 мл стерильной охлажденной на льду 10% -ного глицерина.
  5. Центрифуга клеток при 5000 х г в течение 20 мин при 4 ° C, фильтруйте суперплавучий, и ресуспендируют осадок в 2,0 мл 10% глицерина.
  6. Аликвотировать клеток путем переноса 50 мкл в микро-центрифужные пробирки и немедленно замораживать, помещая пробирки в баню с сухим льдом-этанолом. Хранить компетентных клеток при -80 ° С для электропорации.

3. электропорации бактериальных клеток с комплементационной плазмид

  1. Для электропорации, добавьте 1,0 мкл (10-50 нг) рекомбинантной плазмиды в аликвоты (50 мкл) компетентных клеток и помещают на лед в течение 5 мин.
  2. Перенести смесь с помощью пипетки к кювету для электропорации и установите аппарат для электропорации со следующей установкой: 25 мкФ емкости, 2,5 кВ и 200 Ом сопротивление и доставить импульс.
  3. Добавить 1,0 мл носителя восстановления (LB) в кювету для электропорации и передачи с помощью пипетки на 15 мл коническую трубку. Восстановление с легким вращением в течение 60 мин в шейкере инкубаторе.
  4. Пластина 100 мкл культуры из RECOочень шаг на агара, чтобы выбрать для трансформантов с помощью пипетки и распространение с использованием стерильного шпателя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том , чтобы проверить таблицу 1 и Таблицу 2 перед началом этого шага , чтобы проверить антибиотики и генотипы , чтобы сделать соответствующие агаром.

4. Трансформация AOH1 для содействия функциональной дополнительности Использование L, L-диаминопимелатдегидрогеназу Aminotransferase (ДАПЛ)

  1. Для анализа комплементационной, преобразование AOH1 с пустым вектором (pBAD33), и с вектором экспрессии ДАПЛ в отдельных событий трансформации с использованием протокола электропорации , описанную в разделе 3.0.
  2. Выберите трансформантов путем высева на агаровой среде LB с добавкой 50 мкг / мл -1 DAP и 34 мкг / мл хлорамфеникола -1 и 50 мкг / мл канамицина -1.
  3. Тест для функциональной дополнительности по репликой-гальванических колоний штриховой разводкой на LB мнеDIUM с 0,2% (вес / объем) арабинозы с использованием и без 50 мкг / мл -1 DAP и 34 мкг / мл канамицина -1.
  4. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 24 ч и наблюдать результаты.
    Примечание: результат должен показать, что мутант только способен расти на DAP свободных средств массовой информации только тогда, когда ген ДАПЛ выражается в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.

5. Трансформация TKL-11 для содействия функциональной дополнительности Использование UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-глутамил-2,6- мезо -diaminopimelate лигазы (Мюр)

  1. Transform мутанта с пустым вектором (pBAD33) и с экспрессирующим вектором мурэ (pBAD33 :: VsmurE) , используя протокол , изложенный в разделе 3.0.
  2. Пластине и выбрать трансформантов на LB агаре среде с добавлением 50 мкг / мл -1 тимин и 34 мкг / мл хлорамфеникола , -1 и инкубировать пластин при 30 ° С в течение 24 ч.
  3. Тест для комплементации штриховой разводкой или металлизации колоний из обоих контрольных и экспериментальных преобразований на две среды LB плюс 0,2% (вес / объем) арабинозы и 50 мкг / мл -1 тимин.
  4. Выдержите в одну пластину при 30 ° С, а другую при 42 ° С в течение 24 ч, чтобы визуально оценить фенотип роста.
    Примечание: Результаты должны показать, что мутант способен расти при 42 ° С только тогда, когда ген мурэ выражается в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.

6. Преобразование DL39 для содействия функциональной дополнительности Использование тирозинаминотрансферазы (tyrB)

  1. Трансформирование DL39 либо pBAD33 или pBAD33 :: At5g36160 и выберите трансформантов на чашках с LB с добавкой 50 мкг / мл -1 тирозина, 50 мкг / мл -1 фенилаланин и 34 мкг / мл хлорамфеникола -1 с использованием протокола , изложенного в разделе 3.0.
  2. копия-plate колонии на минимальных (М9) сред с 50 мкг / мл -1 фенилаланина и 50 мкг / мл -1 тирозин, 50 мкг / мл -1 аспартат, 50 мкг / мл -1 лейцин, 50 мкг / мл -1 валин, 50 мкг / мл -1 изолейцин, 10 мкг / мл -1 урацил 0,5% (вес / об) глицерина, 0,2% (вес / объем) арабинозы. Кроме реплик пластинчатые колонии на пластинах, не имеющих фенилаланин и тирозин штриховой разводкой ту же колонию обеих пластин.
  3. Инкубируйте пластин при 30 ° С в течение 48 часов для наблюдения фенотип роста.
    Примечание: результат должен показать, что мутант только способен расти на фенилаланин и тирозин свободных средств массовой информации, только тогда, когда выражается ген tyrB в мутантной фоне по сравнению с только вектором управления.

7. Трансформация Hx699 для содействия функциональной дополнительности в Hypomucoid фенотип Novosphingobium зр. Штамм Hx699

  1. Transform штамм дикого типа Novosphingobium зр. (Rr2-17) и мутант Hx699 с pRK290 и pRK290 :: RSH Nsp в 2 отдельных событий трансформации с использованием протокола преобразования , описанной в разделе 3.0.
  2. Пластина преобразований на картофельной декстрозы (PD) агар с добавлением 10 мкг / мл тетрациклина -1, и инкубируют в течение по крайней мере 24 ч или пока не появятся трансформантов.
  3. Streak и преобразования в "X" узор на свежие чашки с агаром PD и инкубировать при температуре 30 ° C в течение по крайней мере 4-х дней. Обратите внимание на фенотипы содержавшие только вектор, и эксперимент путем визуального изучения фенотипа роста обоих пластин.
    Примечание: результат должен показать, что гипо-слизистый фенотип дополняется когда RSH выражается в мутантного фона по сравнению с только вектором управления.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Бактериальные штаммы, которые используются в различных функциональных анализах комплементации, перечислены в таблице 2.

Функциональный анализ комплементационная: L, L-диаминопимелатдегидрогеназу аминотрансферазы (ДАПЛ)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Многие из курсов, которые являются неотъемлемой частью биотехнологии и молекулярной Bioscience учебного плана в Рочестерского технологического института имеют лабораторный компонент в дополнение к лекционной части курса. Учебный план на учебный 2014-2015 год содержит в общей сложности 48 кур?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

AOH и MAS признает колледж науки и Томас Х. Госнелл Школа естественных наук в Рочестерского технологического института для поддержки. Эта работа была частично поддержана со стороны США Национального научного фонда (NSF) награду AOH MCB-1120541.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli mutantsHudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
Temperature controlled incubatorGeneric
MicrocentrifugeGeneric
Luria AgarThermofisher Scientific22700025
Luria BrothThermofisher Scientific12795084
M9 MediumSigma-Aldrich63011
Potato Dextrose MediumFisher Scientfic DF0013-15-8
KanamycinSigma-AldrichK1377
DiaminopimelateSigma-Aldrich92591
ThymineSigma-AldrichT0376
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
TyrosineSigma-AldrichT3754
PhenlylalanineSigma-AldrichP2126
AspartateSigma-AldrichA9256
ValineSigma-AldrichV0500
LeucineSigma-AldrichL8000
IsoleucineSigma-AldrichI2752
UracilSigma-AldrichU0750
GylcerolSigma-AldrichG5516
ArabinoseSigma-AldrichA3256
TetracylineSigma-Aldrich87128
Taq DNA polymeraseThermofisher Scientific10342-020
Platinum pfx DNA polymeraseThermofisher Scientific11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
E. coli Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
E. coli Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D/topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 VectorThermofisher ScientificK2030-01

Ссылки

  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C. An L,L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of the lysine biosynthesis pathway in plants. Plant Physiol. 140, 292-301 (2006).
  3. Jander, G., Joshi, V. Aspartate-derived amino acid biosynthesis in Arabidopsis thaliana. The Arabidopsis Book. Last, R. L. , American Society for Plant Biologists. Rockville, MD. (2009).
  4. Prabhu, P., Hudson, A. O. Identification and partial characterization of an L-Tyrosine aminotransferase from Arabidopsis thaliana. Biochemistry Research International. , 549572(2010).
  5. Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., Dow, M., Verdier, V., Beer, S. V., Machado , M. A., Toth, I., Salmond, G., Foster, G. D. Top 10 pathogenic bacteria in molecular pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 614-629 (2012).
  6. McGroty, S. E., Pattaniyil, D. T., Patin, D., Blanot, D., Ravichandran, A. C., Suzuki, H., Dobson, R. C., Savka, M. A., Hudson, A. O. Biochemical Characterization of UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate: meso-2,6-diaminopimelate ligase (MurE) from Verrucomicrobium spinosum DSM 4136T. PLoS ONE. 8 (6), e66458(2013).
  7. Hutton, C. A., Perugini, M. A., Gerrard, J. A. Inhibition of lysine biosynthesis: an evolving antibiotic strategy. Mol Biosyst. 3, 458-465 (2007).
  8. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical. Annu Rev Microbiol. 62, 35-51 (2008).
  9. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74, 171-199 (2010).
  10. Cashel, M., Gentry, D. J., Hernandez, V. J., Vinella, D. The stringent response. Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C., Curtiss, R. III, Ingraham, J. L., Lin, E. C. C., Low, K. B., Magasanik, B., Reznikoff, W. S., Riley, M., Schaechter, M., Umbarger, H. E. , 2nd, ASM Press. Washington, DC. 1458-1496 (1996).
  11. Chatterji, D., Ojha, A. K. Revisiting the stringent response, ppGpp and starvation signaling. Curr. Opin. Microbiol. 4, 160-165 (2001).
  12. Jain, V., Kumar, M., Chatterji, D. ppGpp: stringent response and survival. J. Microbiol. 44, 1-10 (2006).
  13. Kramer, G. F., Baker, J. C., Ames, B. N. Near-UV stress in Salmonella typhimurium: 4-thiouridine in tRNA, ppGpp, and pppGpp as components of an adaptive response. J. Bacteriol. 170, 2344-2351 (1988).
  14. Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends Microbiol. 14, 45-54 (2006).
  15. Joseleau-Petit, D., Vinella, D., D'Ari, R. Metabolic alarms and cell division in Escherichia coli. J. Bacteriol. 181, 9-14 (1999).
  16. Mittenhuber, G. Comparative genomics and evolution of genes encoding bacterial (p) ppGpp synthetases/hydrolases (the Rel, RelA, and SpoT proteins). J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3, 585-600 (2001).
  17. Gan, H. M., Buckley, L., Szegedi, E., Hudson, A. O., Savka, M. A. Identification of an rsh Gene from a Novosphingobium sp. Necessary for Quorum-Sensing Signal Accumulation. J. Bacteriol. 191, 2551-2560 (2009).
  18. Nachar, V. R., Savka, F. C., McGroty, S. E., Donovan, K. A., North, R. A., Dobson, R. C., Buckley, L. J., Hudson, A. O. Genomic and biochemical analysis of the diaminopimelate and lysine biosynthesis pathway in Verrucomicrobium spinosum: Identification and partial characterization of L,L-diaminopimelate aminotransferase and UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamyl-2,6-meso-diaminopimelate ligase. Front. Microbiol. 3, 183(2012).
  19. Hudson, A. O., Giròn, I., Dobson, R. C. J. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of L,L-diaminopimelate aminotransferase (DapL) from Chlamydomonas reinhardtii. Acta Cryst. 67, 140-143 (2011).
  20. Dobson, R. C. J., Gir òn, I., Hudson, A. O. L,L-Diaminopimelate Aminotransferase from Chlamydomonas reinhardtii: A Target for Algaecide Development. PLoS ONE. 6 (5), e20439(2011).
  21. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose pBAD promoter. J. Bacteriol. 177, 4121-4130 (1995).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
  23. Lugtenberg, E. J., van Schijndel-van Dam, A. Temperature-sensitive mutants of Escherichia coli K-12 with low activity of the diaminopimelic acid adding enzyme. J. Bacteriol. 110, 41-46 (1972).
  24. Mavrides, C., Orr, W. Multispecific aspartate and aromatic amino acid aminotransferases in Escherichia coli. J. Biol Chem. 250, 4128-4133 (1975).
  25. Gelfand, D. H., Steinberg, R. A. Escherichia coli mutants deficient in the aspartate and aromatic amino acid aminotransferases. J. Bacteriol. 130, 429-440 (1977).
  26. Whitaker, R. J., Gaines, C. G., Jensen, R. A. A multispecific quintet of aromatic aminotransferases that overlap different biochemical pathways in Pseudomonas aeruginosa. J. Biol Chem. 257, 13550-13556 (1982).
  27. Raskin, D. M., Judson, N., Mekalanos, J. J. Regulation of the stringent response in the essential function if the conserved bacterial G protein CgtA in Vibrio cholera. Proc Natl Acad Sci, USA. 104, 4636-4641 (2007).
  28. Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D., Helinski, D. R. Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc Natl Acad Sci, USA. 77, 7347-7351 (1980).
  29. Watanabe, A., Suzuki, M., Ujiie, S., Gomi, K. Purification and enzymatic characterization of a novel β-1,6-glucosidase from Aspergillus oryzae. J Biosci Bioeng. , (2015).
  30. Song, J. T., Lu, H., McDowell, J. M., Greenberg, J. T. A key role for ALD1 in activation of local and systemic defenses in Arabidopsis. Plant J. 40, 200-212 (2004).
  31. Rost, B., Liu, J., Nair, R., Wrzeszczynski, K. P., Ofran, Y. Automatic prediction of protein function. Celuular and Molecular Life Sciences. 60, 2637-2650 (2003).
  32. Norris, S. R., Shen, X., Penna, D. D. Complementation of the Arabidopsis pds1 mutation with the gene encoding p-Hyrdoxyphenylpyruvate dioxygenase. Plant Physiol. 117, 1317-1323 (1998).
  33. Mohler, W. A., Blau, H. M. Gene expression and cell fusion analyzed by lacZ complementation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci, USA. 93, 12423-12427 (1996).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены