Fonksiyonel tamamlama Analizi (FCA): Tasarım ve Biyokimyasal Yolların Öğretim Ek için Uygulanan A Laboratory Egzersiz

Özet

biyokimyasal yollarla ilgili enzimatik faaliyetlerin doğrulama fonksiyonel tamamlama analizi (FCA) kullanılarak aydınlatılmıştır edilebilir. amino asitler, bakteriyel katı cevabı ve bakteriyel peptidoglikan biyosentezinin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin enzimatik aktivitesi gösteren FCA deneyi Bu yazıda tarif edilmektedir.

Özet

Fonksiyonel tamamlama deneyi (FCA), yaygın olarak genler / enzimlerin fonksiyonu / rolünü açıklamak için kullanılan bir in vivo deneydir. Bu teknik biyokimya, genetik ve diğer birçok bilim dallarında çok yaygındır. tekniğin kapsamlı bir bakış peptidoglikan ve bakteriyel sıkı yanıt Bu yazıda bildirilen asitleri, amino ilgili biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için. Lisin (D, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL) ve tirosin ve fenilalanin metabolizmasına katılan tirosin aminotransferaz (tyrB) metabolizmasında rol oynayan modeli bitki organizma Arabidopsis thaliana iki cDNA'lar vurgulanır. Buna ek olarak, bakteriyel peptidoglikan anabolik yolu ortada yer alan bir bakteri Verrucomicrobium spinosum gelen UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz (MURE) geninin analizi ile vurgulanırpeptidoglikan -linking. Bakteriyel sıkı yanıt da. Rsh (r ela / s Pot h omolog) bakteri Novosphingobium sp bir hiper-sümüksü fenotip sorumlu çift işlevli gen analizi ile bildirilen FCA dört örnekleri sunulmaktadır. Video yani lisin, peptidoglikan ve sıkı tepki, üçü üzerinde durulacak.

Giriş

Bir genin işlev (ler) açıklık / rol (ler) bağlamında fonksiyonel tamamlama homolog doğal tipte durumuna gözlemlenebilir fenotip ile belirli bir mutant geri belirli bir homolog ya da ortolog genin yeteneği olarak tanımlanır veya orthologous gen mutant arka plana cis veya trans tanıtıldı. Bu teknik yaygın izole ve işlev (ler) birçok genin / rolü (ler) tanımlamak için kullanılır olmuştur. Bir özel örnek olarak S. URA3 kullanılarak Candida albicans arasından orotidin-5-fosfat dekarboksilaz izolasyon ve tanımlanmasıdır S. cerevisiae ve E. pyrF mutant E. coli. ¹ Yazarlar amino asitler, peptidoglikan ve araştırma programlarına sıkı yanıtın metabolizmasında rol alır ve B öğretim programlarına bu tekniği dahil olan genlerin işlevini aydınlatmak için bu tekniği kullandıkiotechnology ve Moleküler Bioscience (BMB) Rochester Institute of Technology (RIT) program.

İlkeleri ve Uygulamaları (BPP) (Hudson / Savka), RIT BMB Programı iki üst bölümü seçmeli laboratuar tabanlı dersler: Yazarlar Bitki Biyokimyası / Patoloji (FPBP) (Hudson) ve Biyoseparasyonlara temelleri öğretmek. derslerde ele alınmaktadır konuların bazıları araştırma alanları ile bağlı olduğundan, yazarlar bu iki laboratuar tabanlı derslerin içine kendi araştırma programlarında kullanılan teknikler ve deneysel araçları birçok dahil etmişlerdir. Böyle bir örnek bitkiler, peptidoglikan ve bakterilerden sıkı yanıt metabolizma asit metabolizmasını amino ilgili ders materyallerini güçlendirmek için bir laboratuvar egzersiz fonksiyonel tamamlama olduğunu.

FPBB ders açıklanan bitkilerden amino asit yollarının üç olduğu lisin (Lys) arasında, tirosin(Tyr) ve fenilalanin (Phe). Hayvanlar lys de novo sentez genetik makine yoksun beri lys yolu nedeniyle tüm hayvanlar, özellikle insanlarda için temel bir amino asit gibi amino asitin önemi sırasında vurgulanır. Buna ek olarak, son zamanlarda bitkilerin bakteri önemli ölçüde farklı olan Lys sentezi için bir yol kullanılması olduğu keşfedilmiştir. Bu buluş, kısmen, E. fonksiyonel komplemantasyon ile kolaylaştırıldı E. coli diaminopimelat (DAP) model bitki Arabidopsis thaliana enzim L L-diaminopimelat aminotransferaz (DapL) kodlayan bir gen kullanılarak mutantlar. Ara madde ² diaminopimelat, Lys sentezi için varyant yolları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Buna ek olarak , lys sentezi çok düzenlenir amino asitler aspartat türetilmiş ailesi aracılığıyla kolaylaştırır. ³ protein synt önemleri ek olaraknüklerde, Tyr ve Phe'den için yollar fenilpropanoid bileşiklerin anabolizmasında öncül bileşikler olarak hizmet veren önemlerini gibi bitki savunma bileşiklerin sentezi dahil verilen vurgulanmış almaktadır. alkaloidler, lignin, flavonoidler, isoflavonoitlerin, diğerleri arasında hidroksisinnamik asit ⁴ tyr ve phe yolları da bitki ve bakteriyel anabolik yollar arasındaki farkı göstermek için vurgulanır. Bitkilerde, enzim, Tyr ve Phe'den katabolizması esas olarak dahil olup, bu amino asitler anabolizma dahil değildir ise bakteriler, enzim tirosin aminotransferaz (TyrB), her iki amino asit anabolizma yer almaktadır. (Şekil 2). ⁴

Gram pozitif ve Gram peptidoglikan (PG) yapısına ilişkin negatif bakteriler arasındaki farklar FPBP ders vurgulanır. Gram negatif bakterilerin PG aslında dayalı bitki patolojisi ile ilgili ilgi çoğu obitki patojenleri Gram negatif bulunmaktadır. ilk 10 bakteriyel bitki patojenleri ile ilgili yeni bir yorum tüm Gram negatif olduğunu ortaya koymuştur. Bakteri cinslerden edildi. Pseudomonas, Ralstonia, Agrobacterium, Xanthomonas, Erwinia, Xylella, Dickeya ve Pectobacterium kimyasal farklılıkları ⁵ bir Gram negatif ve Gram pozitif bakterilere PG kök karşılaştırırken çapraz bağlama amino arasındaki farktır Her iki tip asitlerdir. PG farklı çapraz-bağlanması için, ilk aşama PG anabolizma sitoplazmik aşamada gerçekleşir ve enzim UDP- N -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat ligaz ile kolaylaştırılır (MURE) (Şekil 3A). MURE çok Gram negatif bakteriler peptit sapının üçüncü konum. ⁶ da, belirli bir diamin bileşiğinin eklenmesini katalize sondan bir önceki Lys (, mezo -diaminopimelate öncülü m -DAP) olarak görev yapan çapraz bağlama amino asidi ve Lys çoğu Gram pozitif bakterilerin PG (Şekil 3B) aynı rol oynar. ^7, bu m -DAP ve Lys her iki amin sahip olmasından kaynaklanmaktadır gruplar ve peptit, kök çapraz bağlanma için iki peptid bağlar oluşturabilirler.

Biyoseparasyonlara in: Principles and Practices (BPP) kursu nedeniyle çevresel değişikliklere bakteri ekimi ve nasıl besin düzeyleri her iki sistemde de önemli ölçüde değişecek açık ve kapalı sistemler arasındaki farklar tartışılır. Bu olaylar bir "aşağı kayması" veya "shift" olarak adlandırılan düzenleyici değişiklikler ile bağlantılı açlık ya da amino asitler ya da enerji yeterli kaynağı tarafından tetiklenen. Bir bakteri kültürü, tek bir karbon kaynağı ile kimyasal olarak tanımlanmış orta zengin ve karmaşık ortamından transfer edildiğinde "vites" yanıtı oluşabilir. ortamda bu değişiklik hızlı Cessa yol açartRNA ve rRNA sentezi yon. amino asit biyosentezi upregüle halde ribozomlar, protein ve DNA sentezinin eksikliği Bu bırakma sonuçları.

"Vites" yanıtın ardından, mevcut ribozomlar orta ya da çevrede artık mevcut amino asitleri sentezlemek için yeni enzimler üretmek için kullanılır. Bir süre sonra, rRNA sentezi ve yeni ribozom monte edilir ve bakteriyel hücre popülasyonu daha az bir oranda olmakla birlikte büyümeye başlar. Olayların ders "sıkı tepki" ya da "sıkı denetim" olarak adlandırılan ve küresel hücresel düzenlemenin bir örneğidir ve gerekli yüzeylerde ve enerji ihtiyacının durumu telafi etmek için hücrenin biyosentetik makine ayarlamak için bir mekanizma olarak düşünülebilir edilir . ⁸ sıkı tepkisi dolayısıyla çevrede besin akıları hızla yanıt bakteri sağlayan ve katkıda bulunur ve enhbesin ve veya substrat kullanılabilirliği açısından hızla değiştirebilirsiniz ortamlarda rekabet bakterilerin yeteneğini MANOTOP'la. ^8-9

Katı yanıtı amino asitler, karbon, azot, fosfat ve yağlı asitlerin mevcudiyeti sınırlıdır gen ekspresyonunda bir rol vardır. ^8,10-14 Bu katı tepkisi iki nükleotid guanosin tetrafosfat (ppGpp) ve guanosin tarafından koordine edilir pentafosfat (pppGpp) genellikle alarmone (p) ppGpp olarak birlikte anılacaktır. Örneğin, amino asitler sınırlı olan zaman, guanosin 3-difosfat 5-trifosfatın anabolizma türetilen guanosin 3,5- (bis) pirofosfat (ppGpp), (pppGpp) biriken protein sentezini-alarmone bir darboğaz yol açabilir hücresinde. (P) ppGpp seviyesindeki değişiklik, doğrudan hücre büyümesi ve developmen katılan ortamında alt-tabakaların eksikliğinin üstesinden gelmek üzere yanıt düzenleyen genlerin ifadesi ile ilgilidirt. Bu süreçte yer alan genlerin ikisi rela ve spoT denir. RelA amino asit sınırlama sonucudur yüksüz tRNA'ların birikimine cevap olarak dahil olan bir ribozom ile ilişkili (p) ppGpp sentetaz olup. bir iki fonksiyonlu (p) ppGpp sentetaz ve hidrolaz spot çalışır. Spot sentetaz aktivitesi karbon ve yağ asidi açlık eksikliği yanıt yer almaktadır. RelA / Spot homologları bitkilerde ve bakterilerde yaygın ve R ELA / S Pot h omologs için RSH olarak adlandırılır ^{8. 8,10 -12,16} yeni bir el yazması bir bakteri Novosphingobium sp Rr 2-17 bu alarmones sentezinde yer alan belirli bir Rsh proteini olduğunu göstermiştir. ¹⁷

Burada fonksiyonel tamamlama deneyleri gergin dört biyokimyasal yollar sunuyoruz. Bu yazıda belirtilen tamamlama deneyleri expl bir yol sağlarcevher bilinmeyen / varsayılan işlev (ler) ya da eğitim araçları biyokimyasal yolların öğretilmesini tamamlamak için sahip olduğu tahmin edilir enzimleri belirlenmesi ve ya karakterize bir araç olarak bu in vivo deney istihdam.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Yazarlar ilgilenen bireyler için öğretim amaçlı fonksiyonel tamamlama analizi birleşmesini kolaylaştırmak için bakteri suşları ve rekombinant plazmidler sağlamak için hazırız. Fonksiyonel tamamlama deneyleri kolaylaştırmak için kullanılmıştır plasmidler Tablo 1 'de listelenmiştir.

Fonksiyonel tamamlama için Plazmidler 1. İnşaat

1. Fonksiyonel olarak tamamlanması diaminopimelat Aminotransferaz (dapL) klonlanması.
   1. V arasında dapL açık okuma çerçevesi (ORF) büyütmek A. spinosum ve cDNA'ların thaliana ve C PCR ile reinhardtiiye. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol dahil, 1 mM MgSO _4, 0.5 ila 4 mm deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX 1 üniteDNA polimerazı.
      NOT: Bitki A. üç dapL ortologlarda rekombinant klonlama ile ilgili tam açıklaması thaliana (-dapL 'de), bakteri Verrucomicrobium spinosum (Vs -dapL) ve deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii (Cr -dapL) daha önce yayınlanmıştır. ^2,18-20
      NOT: aşağıda dapL ortologlar klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
      DapL F vs 5'-CCCCGAATTCATGGCCCTCATCAACGAAAACTTCCTCAAG-3 '
      DapL R vs 5'CCCCGTCGACCTACTTCAGCGCGGCGATACGGCGGCAGAC-3 '
      DapL F 'de 5'-GGGGCATTGGAAGGAGATATAACCATGGCAGTCAATACTTGCAAATGT-3'
      En dapL R-5'-GGGGGTCGACTCATTTGTAAAGCTGCTTGAATCTTCG-3 '
      Cr dapL F-5'-CCCCCGAATTCATGCAGCTCAACGTGCGGTCCACCGCCAGC- 3 '
      Cr dapL R -5' CCCCCAAGCTTCTAGTTACGCTTGCCGTAGGCCTCCTTAAA-3 '
   2. t içine PCR fragmanlarını klonlamakO pET30a yeniden birleştirici plazmidleri üretilmesi için plazmid, pET30a :: Vs dapL, pET30a :: dapL ve primerler, kısıtlama enzimleri ve T4 DNA ligaz kullanılarak pET30a :: Cr dapL 'de.
      1. Kısaca, ucun 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş ^{-1. 18-20}
   3. Kısıtlama pET30a :: Cr dapL için Xbal ve SalI ve Xbal ve HindIII enzimleri ile fonksiyonel tamamlama için plazmid oluşturmak için, dapL plazmidler At pET30a :: Vs dapL ve pET30a :: sindiremez. Plazmidleri pBAD33 :: Vs dapL üretmek üzere T4 DNA ligazı kullanılarak plazmid pBAD33 halinde eklentilerini bağlamak; pBAD33 :: dapL ve pBAD33 :: Cr dapL At.
      1. geçmenin 50 ng ve 20 ng inkübe1x ligaz tamponu vektörün ve gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı, 1 birim. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş ^{-1. 20}
2. A. tirosin aminotransferaz (tyrB) klonlanması fonksiyonel tamamlama için thaliana.
   NOT: A. cDNA klonlama ile ilgili tam ayrıntılar At5g36160 daha önce tarif edilmiştir lokus etiketlerinin açıklamalı thaliana. ⁴
   1. PCR ile cDNA yükseltmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO _4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden ve DNA şablonu, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü.
      Not: cl için kullanılan primerlerşöyle At5g36160 bölgesinin oning gibidir:
      TyrB F 'de 5'-CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3'
      AttyrB R 5'CCCCGAATTCATGGGAGAAAACGGAGCCAAGCGAT-3 '
   2. EcoR1 ve Sal1 PCR fragmanının sindirilmesi ile yeniden birleştirici plazmidleri pET30a :: At5g36160 üretilmesi için plazmid pET30a içine parçası, klon; Aşağıda tarif edildiği gibi T4 DNA ligazı kullanılarak pET30a içine fragmanı ligate. ⁴
   3. Fonksiyonel tamamlama plazmid yaratmak restriksiyon Xbal ve Hindin enzimleri ile pET30a :: At5g36160 sindirmek, T4 DNA ligazı kullanılarak, rekombinant plazmid pBAD33 :: At5g3160 üretmek için aynı kısıtlayıcı enzim sitelerinin kullanılması ile pBAD33 içine ekleme ligate etmek.
      1. geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB plakaları üzerinde koloniler için coli Dh5α hücreleri ve ekran 34 ug / ml ^-1 Chlo ile desteklenmiş24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek ramphenicol. ⁴
3. Klonlanması UDP- K V den -acetylmuramoyl-L-alanil-D-glutamat mezo -2,6-diaminopimelat Ligaz (MURE) fonksiyonel tamamlama için spinosum.
   Not: V. gelen MURE ORF klonlanması spinosum daha önce tarif edilmiştir. ¹⁸
   1. PCR ile açık okuma çerçevesi yükseltin. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO _4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve pFX DNA polimeraz 1 ölçü. Daha sonra plazmid pET100D :: Vs MURE üretilmesi için plazmid pET100D klonlanması.
      NOT: aşağıda Vs MURE klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
      MURE f- 5'CACCATGACCATTTTGCGCGATCTTATCGAGGGT vs -3 '
      VsMURE R 5'GTCGACTCACTGACGGTCATCCCTCCTTTGGCGTGC-3 '
   2. Fonksiyonel olarak tamamlanması plazmid üretmek pET100D sindirimi için :: Vs MURE
      Sınırlama ile Xbal ve Sal1 enzimler ve bunların rekombinant plazmid pBAD33 :: Vs MURE T4 DNA ligazı kullanılarak üretilmesi için pBAD33 içine ekleme ligate.
      1. gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim ile birlikte ekin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si, inkübe edilir. E. içine ligasyonu Dönüşümü 24 saat boyunca 37 ° C inkübe edilerek 34 ug / ml kloramfenikol ^-1 ile desteklenmiş LB plakaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran. ⁸
4. Fonksiyonel tamamlama için Novosphingobium sp Relà / s Pot (rsh) klonlanması.
   Not:. Novosphingobium sp rsh klonlanması daha önce tarif edilmiş ^17.
   1. 599 nükleotid upst ilave olarak rsh ORF yükseltinPCR ile sonlandırma yerinde aşağı başlatma başlangıç ​​site ve 46 nükleotidin delmek. 15 saniye için 94 ° C'de 30 döngü, 30 saniye için 60 ° C ve 2 dakika 72 ° C'de, ardından 2 dk süreyle 94 ° C 'de 1 döngü, kullanın. Her bir primerden 12 pmol, dahil 1 mM MgSO _4, 0.5 mM, dört deoksinükleotid trifosfatın her birinden, şablon DNA, 0.5 ng ve Taq DNA polimerazın 1 ölçü. Daha sonra pCR2.1 :: Nsp rsh üretilmesi için plazmid pCR2.1 klonlamak.
      1. amplifiye edilen PCR fragmanı 1 ul, pCR2.1 vektörü 1 ul, tuz çözeltisi 1 ul su 1 ul inkübe edin. 5 dakika ve ligasyon 2 ul E. içine 25 ° C de inkübe LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli hücreleri, ve ekran 37 inkübe edilerek 50 mg / ml kanamisin ile takviye edilmiş ^-1 24 saat ° C.
         NOT: aşağıda rsh klonlanması için kullanılan primerler şunlardır:
         rsh F 5'- GTTGAAAAACGCCGAATAGC 3 '
         rsh R 5'- GAGACCTGTGCGTAGGTGGT 3 '
      2. Fonksiyonel tamamlama için plazmid pCR2.1 :: Nsp EcoR1 ile rsh sindirmek ve T4 DNA ligaz kullanılarak rsh rekombinant plazmid pRK290 :: Nsp üretmek için geniş konakçı aralığına pRK290 içine insert Arter.
         1. geçmenin 50 ng ve 1 x ligaz tampon maddesi içinde vektörün 20 ng'si ile ve bir gece boyunca 17 ° C'de T4 DNA ligazı 1 birim inkübe edin. E. içine ligasyonu Dönüşümü LB levhaları üzerinde koloniler için E. coli Dh5α hücreleri ve ekran 37 inkübe edilerek 10 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ^-1 24 saat ° C. ¹⁷

Dönüşüm kolaylaştırılması için Elektro-yetkili Bakteriyel Hücre 2. Hazırlık

Not: elektro-kompetan hücrelerin hazırlanması daha küçük bir hacimde (örneğin, 250 mi) aşağı ölçeklendirilebilir kültür 1.0 L için protokol 26 dayanır. Bu protokol b unutmayıne FCA kolaylaştırmak için bu yazıda anlatılan yetkili tüm suşları yapmak için kullanılır. ²²

1. Bir şişe içine tek bir koloni ile sıvı ortam 50 ml inoküle ve bu adımı (Tablo 2) başlamadan önce mutant genotipini kontrol emin, gece boyunca büyümektedir.
2. Günde iki, gece boyunca kültürün 50 ml'si ile uygun bir ortamda (LB, E. coli mutantlarının ve PD Novosphingobium sp) 1.0 L inoküle ve 30 ° 'de (log fazına) 0.4-0.6 bir OD ₆₀₀ büyüyebilir C.
3. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüjleme ile hasat hücreler supernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk saf _H2O 500 ml pelet
4. Santrifüj hücreler, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'de, süpernatant süzün ve steril, buz gibi soğuk% 10 gliserol, 250 ml pelet.
5. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj hücreleri ° C, süper süzünyüzen, ve% 10 gliserol, 2.0 ml pelet tekrar süspansiyon.
6. Bir kuru buz-etanol banyosu içinde tüpler koyarak dondurularak hemen mikro santrifüj tüplerine 50 ul transfer hücreleri eş-payı ve. Elektroporasyon için -80 ° C 'de, yetkili hücreleri saklayın.

Tamamlama plazmid ile bakteriyel hücrelerin 3. elektroporasyonu

1. Elektroporasyon için, yetkili hücrelerin bir tümböleni (50 ul) rekombinant plazmidin 1.0 ul (10-50 ng) ekleyin ve 5 dakika buz üzerine yerleştirin.
2. Bir elektroporasyon küvetine pipetleme yoluyla karışımı aktarın ve aşağıdaki ayarı elektroporasyon aparatı ayarlayın: 25 jxF kapasitansı, 2.5 kV ve 200 Ohm direnci ve darbe teslim.
3. 15 ml konik tüp bir pipet kullanarak kurtarma elektroporasyon küvetine medya (LB) ve transfer 1,0 ml ekleyin. bir çalkalama inkübatöründe 60 dakika boyunca hafif bir döndürme ile yeniden elde.
4. reco kültür 100 ul Plateagar plakaları üzerine çok adım pipetleme transformantların ve steril bir dağıtıcısı kullanarak yaymak için seçin.
   NOT: Uygun agar plakaları yapmak için antibiyotik ve genotipleri kontrol etmek için bu adımı başlamadan önce Tablo 1 ve Tablo 2 kontrol ettiğinizden emin olun.

AOH1 4. Dönüşüm kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması L, L-diaminopimelat Aminotransferaz (dapL)

1. Tamamlama analizi için, boş vektör (pBAD33) ile AOH1 dönüşümü ve bölüm 3.0 özetlenen elektroporasyon protokolü kullanılarak ayrı dönüşüm olaylarda DapL ifade vektörleri ile.
2. 50 ug / ml ^-1 DAP ve 34 ug / ml kloramfenikol ^-1 ve 50 | ig / ml kanamisin ile takviye edilmiş ^-1 LB agar ortamı üzerinde kaplama ile transformantların seçin.
3. LB beni üzerine çizgiler ile çoğaltma kaplama koloniler fonksiyonel tamamlama için test% 0.2 ile 50 ug / ml ^-1 DAP ve 34 ug / ml kanamisin ^-1 olmayan (ağırlık / hacim) arabinoz ile dium.
4. 24 saat 30 ° C'de inkübe ve sonuçları gözlemleyin.
   NOT: Sonuç vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant sadece dapL gen mutant arka planda ifade edilir sadece DAP serbest medyada büyümek mümkün olduğunu göstermek gerekir.

TKL-11 5. Dönüşüm UDP- N -acetylmuramoylalanyl-D-glutamil-2,6-mezo kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için -diaminopimelate Ligaz (MURE)

1. Boş vektör (pBAD33) ve bölüm 3.0 özetlenen protokolü kullanılarak MURE ifade vektörü (pBAD33 :: VsmurE) ile mutant Transform.
2. LB agar ortamı üzerinde plaka seçin transformantlar / ml ^-1 kloramfenikol 50 ug / ml ^-1 timin ve 34 ug ile takviye edilmiş ve 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
3. Kontrol ve iki LB ortamı artı% 0.2 (ağ / hac) arabinoz ve 50 ug / ml ^-1 timin üzerine deney dönüşümler hem koloniler, çizgi ya da kaplama ile tamamlanması için test.
4. görsel olarak büyüme fenotipi değerlendirmek için tek bir 30 ° C 'de plaka ve 24 saat boyunca 42 ° C'de, diğer inkübe edin.
   NOT: Bu sonuçlar, mutant MURE gen vektörü sadece kontrole kıyasla mutant arka ifade yalnızca 42 ° C'de büyüyebilir göstermelidir.

DL39 6. Dönüşüm tirosin aminotransferaz kullanarak fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için (tyrB)

1. LB agar plakaları üzerinde pBAD33 ya pBAD33 :: At5g36160 ile ya DL39 Transform ve Seçenek transformantlar bölümünde belirtilen 50 ug / ml ^-1 tirosin, 50 ug / ml ^-1 fenilalanin ve protokol kullanılarak 34 ug / ml kloramfenikol ile takviye ^-1 3.0.
2. kopya50 ug / ml ^-1 fenilalanin ve 50 | ig / ml ^-1 tirosin, 50 ug / ml ^-1, aspartat, 50 ug / ml ^-1 leusin, 50 ug / ml ^-1 valin ile minimum (M9) ortama -plate koloni / ml ^-1 izolösin 50 ug, 10 ug / ml ^-1 urasil% 0.5 gliserol (ağ / hac),% 0.2 (ağırlık / hacim) arabinoz. Her iki plakaların aynı koloni çizgiler ile fenilalanin ve tirozin eksik plakalar üzerinde de çoğaltma plaka koloniler.
3. büyüme fenotipi gözlemlemek için 48 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   Not: Sonuç vektörü, yalnızca kontrol ile karşılaştırıldığında, mutant yalnızca mutant arka tyrB geninin ifade yalnızca, fenilalanin ve tirosin serbest bir ortam üzerinde yetişebilir mümkün olduğunu göstermesi gerekir.

Hx699 7. Dönüşüm Hypomucoid Fenotip Novosphingobium ve sp fonksiyonel tamamlama kolaylaştırılması için. Gerilme Hx699

1. Bölüm 3.0 özetlenen dönüşüm protokolü kullanılarak 2 ayrı transformasyon olaylar yabani tip suşu Novosphingobium sp Transform. (Rr2-17) ve pRK290 mutant Hx699 ve pRK290 :: rsh _Nsp.
2. Patates dekstroz dönüşümleri plakası (PD) agar 10 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ^-1, ve en az 24 saat boyunca ya da transformantlar görünene kadar inkübe edilir.
3. Çizgi, her iki dönüşümler taze PD agar plakaları üzerinde "X" desen ve 30 inkübe en az 4 gün süreyle ° C. görsel olarak, her iki levha büyüme fenotipi inceleyerek sadece vektör, ve deney fenotipleri dikkate alınmalıdır.
   NOT: Sonuç rsh vektörü sadece kontrol ile karşılaştırıldığında mutant arka planda ifade edildiğinde hipo-sümüksü fenotip tamamlanmaktadır olduğunu göstermelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Çeşitli fonksiyonel tamamlama analizlerde kullanılan bakteriyel suşlar, Tablo 2'de sıralanmıştır.

Fonksiyonel tamamlama analizi: L, L-diaminopimelat aminotransferaz (dapL)

E. E. coli çift mutant AOH1 (Δ DAPD :: Kan2, dapE6) Dape geninde bir mutasyon ve DAPD geninin tam silme (Şekil 1) barın...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Rochester Teknoloji Enstitüsü'nde Biyoteknoloji ve Moleküler Bioscience müfredat ayrılmaz bir parçası olan derslerin çoğu dersin ders kısmına ek olarak laboratuvar bileşeni var. akademik yıl 2014-2015 için müfredat yaklaşık% 60'ını temsil eden bir laboratuvar bileşeni içeren 29 olan 48 ders, toplam içerir. İlkeleri ve Uygulamaları (BPP), bir laboratuvar bazlı ders: Böyle bir ders Bitki Biyokimya ve Patoloji (FPBP), bir harmanlanmış ders / laboratuvar ders ve Biyoseparasyonlara temelle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli mutants	Hudson/Savka lab or CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
Electroporator	Biorad-USA	1652100
Electroporation Cuvettes	Biorad-USA	1652082
Temperature controlled incubator	Generic
Microcentrifuge	Generic
Luria Agar	Thermofisher Scientific	22700025
Luria Broth	Thermofisher Scientific	12795084
M9 Medium	Sigma-Aldrich	63011
Potato Dextrose Medium	Fisher Scientfic	DF0013-15-8
Kanamycin	Sigma-Aldrich	K1377
Diaminopimelate	Sigma-Aldrich	92591
Thymine	Sigma-Aldrich	T0376
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754
Phenlylalanine	Sigma-Aldrich	P2126
Aspartate	Sigma-Aldrich	A9256
Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750
Gylcerol	Sigma-Aldrich	G5516
Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
Tetracyline	Sigma-Aldrich	87128
Taq DNA polymerase	Thermofisher Scientific	10342-020
Platinum pfx DNA polymerase	Thermofisher Scientific	11708-013
T4 DNA ligase	Thermofisher Scientific	15224-041
E. coli Dh5-alpha	Thermofisher Scientific	18258012
E. coli Top10	Thermofisher Scientific	C4040-03
pET100D/topo vector	Thermofisher Scientific	K100-01
pCR2.1 Vector	Thermofisher Scientific	K2030-01