الفصل Immunomagnetic من Sca1 الدهون مستودع محددة<sup&gt; عالية</sup&gt; الدهنية المشتقة من الخلايا الجذعية (مخولا لصيانة طائرات)

Summary

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Abstract

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introduction

الخلايا الجذعية مستضد 1 (Sca1، أو Ly6A / E) كان أول من عرف كعلامة سطح الخلية التي عبرت عنها المكونة للدم والخلايا الجذعية الوسيطة ^5،6. جزء الأوعية الدموية اللحمية (صندوق التبرعات الخاص) من الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من مستودعات الماوس الدهون هي مجموعة متغايرة من الخلايا التي تتكون من الخلايا الليفية، الضامة، وخلايا بطانة الأوعية الدموية، والخلايا العصبية، وخلايا خلية شحمية السلف ^7. الخلايا الاولية خلية شحمية، أو الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة (مخولا لصيانة طائرات) هي خلايا غير الدهون لادن الموجودة في المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأوعية الكولاجين الغني (ECM) ^8. ما يقرب من 50٪ من صندوق التبرعات الخاص تتكون من مخولا لصيانة طائرات، والتي وصفها بأنها نسب سلبية (لين ^-) وCD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} معظم هذه الخلايا هي Sca1 ^+: CD24 ^- الأسلاف خلية شحمية، والتي هي قادرة على التمايز خلية شحمية في المختبر. ومع ذلك، سوى جزء صغير من الخلايا (0.08٪ من صندوق التبرعات الخاص) يشكل Sca1 +: CD24 ⁺ الخلايا التي هي قادرة تماما على المتكاثرة والتفريق في الخلايا الشحمية في ظروف في الجسم الحي ^9. وعلى الرغم من التحذير المحتمل لاستخدام Sca1 ⁺ صندوق التبرعات الخاص دون تمييز الخلايا CD24 ⁺ CD24 من ^- الخلايا، عزل Sca1 ⁺ مخولا لصيانة طائرات من مخازن الدهون باستخدام فصل الخلية immunomagnetic هو نهج فعال وعملي لتحديد النمط الظاهري خلية مستقلة الخلايا الاصلية خلية شحمية الأولية.

في مجال السمنة ومرض السكري، تليف الأنسجة والتهاب تلعب دورا حاسما في تطوير وصيانة النوع 2 من داء السكري ^3. في الآونة الأخيرة، توكوناجا وآخرون. أظهرت أن Sca1 خلايا ^عالية معزولة عن الاربية (أو تحت الجلد، SQ) وperigonadal (أو الحشوية، VIS) C57BL6 / J مستودعات الدهون يحمل توقيعات الجينات المختلفة، وECM إعادة عرض في المختبر ^10. MMP14 (MT1-MMP)، وهو عضو تنميط للغشاء تييب] مصفوفة الفلزي (MMP) أسرة تتوسط تطوير الأنسجة الدهنية البيضاء (وات) من خلال النشاط حال للكولاجين ^ل1.

وتشمل الأمثلة من التجارب التي يمكن أن تجري مع الخلايا المعزولة والتخصيب من خلال بروتوكول التالي ثقافة ثلاثية الأبعاد، دراسات التمايز، المقايسات تدهور الكولاجين، وRNA تسلسل ^10،11. وينبغي إجراء فحوصات تدهور مع الكولاجين حمض المستخرجة لضمان الحفاظ على telopeptide ^11،12. فإن بروتوكول التالية لشرح طرق لعزل خلايا انسجة الوعائية الأولية من مستودعات الدهون المختلفة، وإثراء الخلايا الاولية خلية شحمية باستخدام فصل الخلية immunomagnetic. وسيتم تقييم صلاحية فرز الخلايا مع التدفق الخلوي ومن خلال استخدام-Sca1 GFP الفئران التي تعبر عن GFP في Sca1 ⁺ الخلايا، يقودها Sca1 المروج ^13.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: جامعة ميشيغان اللجنة على استخدام ورعاية الحيوانات (UCUCA) تمت الموافقة على جميع الطرق والبروتوكولات وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (معهد مختبر أبحاث الحيوان، المجلس الوطني للبحوث). تتم المحافظة على الفئران في جامعة ميشيغان الحظيرة وتعطى حرية الوصول إلى الغذاء والماء وأبقى على 12 ساعة الظلام دورة / الخفيفة.

1. التحضيرات

1. إعداد وسائل الإعلام ثقافة الأساسي مع DMEM، و 10٪ FBS، 1X P / S / G، و1X المضادات الحيوية / مضادات الفطريات. وسوف تستخدم هذه للحفاظ على الأنسجة الدخول قبل الهضم. وضع الأسهم وقسامة في 37 حمام ماء درجة مئوية.
2. إعداد خمسة ملليلتر من النوع الثالث حل كولاجيناز في 5mg / حل مل في HBSS (+ الكالسيوم، المغنيسيوم +) لكل نوع من منصة الدهون عزله، ما يصل إلى خمسة الفئران. على سبيل المثال، عندما عزل SQ وVIS من النمط الجيني واحد، وجعل 10 مل، إذا من النوع البري ومتحولة SQ وVIS، وجعل 20 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والظريفيثير غضب التصفية. قسامة إلى 50 مل أنابيب. جانبا بعيدا عن الضوء.
3. استخدام الايثانول 70٪ لتطهير الجراحي الميداني. مسح أسفل، وتغطي مع لوحة زرقاء. رش بعض الإيثانول على لوحة زرقاء.
4. استخدام الإبر 22 G ليتعرفوا على وسادة ماصة لمجلس الستايروفوم وتقليم مع مقص. رش لوحة مع الإيثانول ثم تعيين مجلس على لوحة زرقاء وتغطية مع لوحة زرقاء آخر حتى يبدأ تشريح.
5. ملء اثنين من 50 مل أنابيب مع الإيثانول وضعها في موقف مجاور للالجراحي الميداني. وضع مقص وملقط في الإيثانول.
6. ملء أنبوب آخر 50 مل مع برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 1X مكافحة المضادة للشطف الإيثانول من الأدوات الجراحية.
7. في غطاء محرك السيارة، والتسمية 60 أطباق مم لكل نوع من أنواع الأنسجة وتمتلئ وسائل الإعلام ثقافة تحسنت إلى 37 درجة مئوية. وضع لوحات المتاخمة لمنطقة العمليات الجراحية.

2. عزل تحت الجلد (SQ) الدهون وسادات

1. الموت ببطء الفأر مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين واسترواح الصدر.
2. بلطفرذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ ووضع مستلق. دبوس الكفوف إلى مجلس رغوة مع 22 الإبر G.
3. جعل قطع صغير في الجلد من أسفل البطن. عقد قمة للقطع مع ملقط، واتخاذ مقص وفصل الجلد من البريتوني.
4. مرة واحدة يتم فصل الجلد من البريتوني من البطن إلى القفص الصدري، يعكس الجلد بعيدا عن الصفاق نحو الرأس من خلال جعل التخفيضات الجانبية في الجلد على طول الجانب من الجسم.
5. تعكس الجلد المتبقية عقد الدهون الإربي بعيدا عن الجسم ويتعرفوا إلى لوحة مع 22 الإبر G.
6. التبديل إلى مقص الجميلة وملقط. الاستيلاء على لوحة الدهون الأربية مع ملقط في أصل قرب الصفاق وقص بعيدا بين الجلد والدهون الإربي تتقدم نحو الفخذ تجنب تلويث SQ مع الجلد.
7. وضع insolated الأربية منصة الدهون في الطبق المسمى 60 ملم.

3. عزل الحشوية (VIS) وسادات الدهون

1. بطريقة مماثلة إلى الخطوة 2.5، وقطع الصفاق مفتوحة لفضح منصات الدهون والأمعاء الحشوية.
2. نقل القناة الهضمية بعيدا نحو الصدر.
3. الاستيلاء على VIS منصة الدهون في نهاية القاصي وسحب بلطف صعودا. تشريح خارج VIS وحة الدهون مع الحرص على استبعاد بربخي (أو الرحم، إذا كان استخدام إناث الفئران) الأنسجة.
4. مكان في صحن وصفت وكرر الخطوة 3.3 لوحة VIS المتبقية.

4. كولاجيناز هضم الدهون وسادات

1. نقل 60 ملم الأطباق إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة، ونضح من وسائل الإعلام.
2. تخطر على منصات الدهون مع مقص منحني ثم يضاف إلى حل كولاجيناز. يجب التأكد من شطف مقص وملقط بين أنواع الأنسجة مع الايثانول وبرنامج تلفزيوني.
3. هزة في 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة حتى يتم هضمها الأنسجة. كان مقبولا إذا كان بعض القطع من SQ لا تزال مرئية. وسيتم تناول ذلك في خطوة لاحقة.
4. إضافة 25 مل من وسائل الاعلام والثقافة في حل كولاجيناز لوقف collagالعلاج enase، وماصة صعودا وهبوطا 10 مرات مع 10 مل ماصة المصلية لتفريق الأنسجة هضمها.
5. خلايا السلالة باستخدام مصفاة الخلية 100 ميكرون. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز.
6. صب بعناية من وسائل الإعلام على عدم تعكير صفو بيليه وإضافة 5 مل من الماء المعقم لبيليه وبلطف ماصة لتعليق الخلايا. الانتظار 2 دقيقة لليز كريات الدم الحمراء.
7. إضافة 25 مل من وسائل الاعلام مع FBS 10٪ وسلالة الخلايا من خلال جديدة 100 ميكرومتر مصفاة الخلية.
8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. وسائل الإعلام صب وبيليه resuspend في 1 مل من ثقافة وسائل الإعلام.
9. عدد الخلايا مع عدادة الكريات باستخدام 1: 1 التريبان الأزرق.
10. لوحة 1 × 10 ⁶ خلايا في بئر واحدة على لوحة 6 جيدا.

5. المغناطيسي فصل خلية

1. بعد حوالي 4-6 ساعة من التصاق الخلية، وشطف الخلايا مرتين مع HBSS (-CA، -Mg). فصل الخلايا الملتصقة باستخدام التربسين 0.05٪. تمييع تعليق خلية التربسين في المخزن الفصل 1 مل وتدور ل5 دقائق في 300 × ز.
2. نضح طاف. Resuspend الخلايا في 500 العازلة ميكرولتر. إزالة قسامة 10 ميكرولتر وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
3. خلايا تدور لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
4. نضح طاف تماما. خلايا resuspend في 90 العازلة ميكرولتر. إضافة 10 الأجسام المضادة الأولية مكافحة Sca1-FITC ميكرولتر. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
5. غسل الخلايا مع 1 مل العازلة والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز. إزالة طاف تماما.
6. خلايا resuspend في 80 العازلة ميكرولتر. إضافة 20 ميكرولتر ميكروبيدات مكافحة FITC. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
7. غسل الخلايا مع 1 مل العازلة والخلايا الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
8. إزالة وطاف بيليه resuspend في 500 ميكرولتر عازلة.
9. وضع عمود في حامل المغناطيسي وشطف العمود مع 500 العازلة ميكرولتر.
10. إضافة تعليق الخلية إلى العمود. تجنب فقاعات في حين pipetting ل.
11. جمع Sca1 الخالي من الملصقات ^{- <}/ sup> في الخلايا وغسل العمود 3 مرات مع 500 ميكرولتر عازلة. فقط إضافة عازلة الجديد عند الخزان فارغ. تجنب فقاعات في حين pipetting ل.
12. إزالة عمود من حامل المغناطيسي والمكان الى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
13. إضافة 1 مل العازلة إلى العمود وأزل Sca1 ⁺ عن طريق دفع المكبس توفيره من خلال الخزان العمود.
14. تدور باستمرار كسور خلية لمدة 5 دقائق في 300 × ز. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة 1 مل.
15. إزالة قسامة 10 ميكرولتر من الكسور وصفت وغير المسماة وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
16. لوحة كل جزء الخلية في 1 بئر من لوحة 6 جيدا.

6. التأكيد من الفصل Immunomagnetic من Sca1 ^عالية ACSS مع التدفق الخلوي

1. شطف الخلايا مرتين مع HBSS (-CA، -Mg) وفصل الخلايا باستخدام 0.05٪ التربسين.
2. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة 1 مل وتحسب باستخدام عدادة الكريات.
3. الحصول على> 10 ⁶ الخلايا في 1 مل سائل الإعلام والثقافة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
4. إزالة طاف وكرر الخطوة 6.3 مرتين أخريين.
5. Resuspend الخلايا مع 1 مل من 2٪ مصل الماعز + 2٪ BSA وكتلة لمدة 30 دقيقة في RT.
6. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
7. إزالة عرقلة الحل.
8. إضافة الفئران IgG2a اليكسا فلور 647 (0.25 ميكروغرام، 1: 400) أو مكافحة Sca1 اليكسا فلور 647 (0.25 ميكروغرام، 1: 400)، في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع 2٪ مصل الماعز و 2٪ BSA + برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
9. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى الخلايا. الطرد المركزي 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
10. إزالة طاف وكرر الخطوة 6.9 مرتين أخريين.
11. Resuspend الخلايا في 1 مل برنامج تلفزيوني. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر في إعداد لتحليل تدفق cytometric.

النتائج

إثراء مخولا لصيانة طائرات ^عالية Sca1 من سادات الدهون المختلفة.

خلايا انسجة الوعائية معزولة عن مثل الخلايا الليفية عرض SQ الدهون، امتدت شكل الخلية بغض النظر عن مستوى التعبير Sca1 (الشكل 1A)....

Discussion

وهنا علينا أن نبرهن على العزلة والانفصال خلية immunomagnetic من مخولا لصيانة طائرات الفئران من منصات الدهون المختلفة واستخدامها لاجراء تجارب في المختبر. الطريقة المعروضة فعال لعزل سريعة لعدد كبير من مخولا لصيانة طائرات-Sca1 إيجابي، وهو أمر مفيد على العزلة معقدة ومكلفة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094