Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

Özet

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Özet

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Giriş

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri ^5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin ⁷ hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) ⁸ ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 ^+: SCA1 ^{+ 9} ve CD29 ^{+ -} yaklaşık SVF% 50 soy-negatif (Lin) olarak karakterize edilmiştir TSK oluşmaktadır. In vitro adiposit farklılaşması edebilen adiposit ataları, ^- CD24: bu hücrelerin çoğu Sca1 ^{+ 'dır} Bununla birlikte, hücrelerin sadece küçük bir kısmı (SVF 0.08%) SCA1 teşkil +: çoğalan ve in vivo koşullarda ⁹ adipositlere farklılaşma tamamen yetenekli CD24 ⁺ hücreler. CD24 gelen CD24 ⁺ hücreler demeden Sca1 ⁺ SVF kullanarak potansiyel ihtar rağmen ^- immunomagnetic hücre ayırma kullanarak yağ depolarından SCA1 ⁺ TSK, hücreler izole birincil adiposit progenitör hücrelerin hücre özerk fenotip belirlemek için etkili ve pratik bir yaklaşımdır.

Obezite ve diyabet, doku fibrozu ve enflamasyon alanına tip-2 diyabet ³ gelişimi ve korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda, Tokunaga ve ark. (VIS veya visseral) inguinal (ya da deri altı, SQ) ve perigonadal izole Sca1 ^yüksek hücreler C57BL6 / J yağ depoları vitro ¹⁰ farklı gen imzalar ve ECM biçimlenme sergilerler gösterdi. MMP14 (MT1-MMP), membran-t prototip üyesiYPE matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi kolajenolitik aktiviteye ¹ ile beyaz adipoz dokuda (WAT) gelişimini aracılık eder.

Aşağıdaki protokol ile izole edilmiş ve zenginleştirilmiş hücreleri ile gerçekleştirilebilir deney örnekleri arasında, üç boyutlu bir kültür, farklılaşma çalışmaları, kolajen alçalmasının tahlilleri ve RNA sıralaması ^10,11 bulunmaktadır. Parçalanma deneyleri telopeptit ^11,12 korunmasını sağlamak için asit ekstre kollajen ile yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol farklı yağ depolarından birincil vasküler stroma hücreleri izole ve immunomagnetic hücre ayırma yöntemi adiposit progenitör hücreler zenginleştirmek için yöntemler gösterecektir. Hücre sıralama geçerliliği akım sitometri ile ve bir Sca1 promotör ¹³ tarafından tahrik SCA1 ⁺ hücrelerde GFP ifade Sca1-GFP fareler kullanılarak yoluyla değerlendirilecektir.

Protokol

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur.

1. hazırlıklar

1. DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin.
2. 5 mg / ml (+ Ca, Mg), yağ yastığı her bir tipi için beş fare kadar yalıtıldıktan HBSS içinde çözülmüş tip III kolajenaz çözeltisi, beş mililitre hazırlayın. Tek bir genotipten SQ ve VIS izole edilirken, vahşi tip ve mutant kare olduğu ve VIS, 20 ml yapmak, örneğin, 10 ml yapmak. 7.4 Ste pH ayarlamaFiltreyi rile. 50 ml tüpler içine kısım. kenara ışıktan uzakta ayarlayın.
3. Cerrahi alan dezenfekte% 70 etanol kullanın. aşağı silin ve mavi ped ile kaplayın. Mavi pad üzerinde bazı etanol püskürtün.
4. strafor kurulu bir emici ped aşağı pin ve makasla kesme 22 G iğne kullanın. sonra mavi pad üzerinde kurulu ayarlayabilir ve diseksiyon başlamadan kadar başka bir mavi ped ile kaplayın etanol ile pedi püskürtün.
5. cerrahi alan bitişik bir stand etanol ve yer ile iki 50 ml tüpler doldurun. Etanol makas ve forseps yerleştirin.
6. cerrahi aletleri etanol kapalı durulama için PBS artı 1x anti-anti başka 50 ml tüp doldurun.
7. kaputu, her bir doku tipi etiket 60 mm yemekleri ve 37 ºC ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Cerrahi alana bitişik tabak yerleştirin.

Subkütan (SQ) Yağ Pads 2. izolasyonu

1. izofluran ve pnömotoraks aşırı dozda fare Euthanize.
2. Nazikçe% 70 etanol ile fare sprey ve sırtüstü yatıyordu. 22 G iğne ile köpük kuruluna pençeleri sabitleyin.
3. Alt karın derisinde küçük bir kesim yapın. forseps ile kesilen üst Holding, makas almak ve periton cilt ayırmak.
4. Cilt karından göğüse periton ayrılır sonra, vücudun yan tarafında deride yan keser yaparak uzak kafasına doğru periton cilt yansıtır.
5. vücuttan uzak kasık yağ tutma kalan cilt yansıtır ve 22 G iğne ile kuruluna aşağı pin.
6. ince makas ve forseps geçin. periton yakın kökeni forseps ile kasık yağ yastığı tut ve deri ile SQ kirletici kaçınarak kasık doğru ilerleyen deri ve kasık yağ arasında uzak snip.
7. etiketli 60 mm çanak güneşe maruz kasık yağ yastığı yerleştirin.

Visseral (VIS) Yağ Pads 3. İzolasyon

1. Benzer bir şekilde, 2.5 adım yağ yastıkları ve bağırsak visseral maruz açık periton kesmek için.
2. uzakta toraks doğru gut hareket ettirin.
3. uzak ucunda VIS yağ yastığı tut ve yavaşça yukarı doğru çekin. doku (dişi fareler kullanıyorsanız, ya da rahim) epididimal dışlamak için dikkat ederek VIS yağ yastığı parçalara ayır.
4. etiketli çanak ve kalan VIS pad adımı yineleyin 3.3 yerleştirin.

Yağ Pads 4. kollajenaz sindirimi

1. doku kültürü kaputu 60 mm yemekleri taşımak ve medya aspire.
2. kavisli makas sonra kollajenaz çözüm eklemek ile yağ yastıkları kıyma. etanol ve PBS ile doku tipleri arasındaki makas ve forseps durulama emin olun.
3. dokular dijeste kadar 300 rpm'de 10-20 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalanır. SQ bazı parçaları hala görünür eğer kabul edilebilir. Bu bir sonraki adımda ele alınacaktır.
4. collag durdurmak için kollajenaz çözeltisine kültür ortamı 25 ml ilave edilir10 ml'lik serolojik pipet ile enase tedavi ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez sindirilmiş dokuları dağıtmak için.
5. 100 mikron hücre süzgeç kullanarak Gerilme hücreleri. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj.
6. Dikkatle pelet rahatsız ve yavaşça hücrelerin askıya pipet pelet steril su 5 ml ekleyin ve için medyayı kapalı süzün. eritrositleri lizise uğratmak üzere 2 dakika bekleyin.
7. yeni bir 100 mikron hücre süzgecinden% 10 FBS ve şekil hücreleri ile ortam 25 ml ilave edilir.
8. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. Durusu medya ve kültür ortamı 1 ml tekrar süspansiyon pelet.
9. 1 tripan mavi: 1 kullanarak bir hemasitometre ile hücre sayımı.
10. 6 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk Levha 1 x 10 ⁶ hücre.

5. Manyetik Hücre Ayırma

1. Hücre yapışması, yaklaşık 4 ila 6 saat sonra, HBSS (-Ca, -mg) ile iki kez hücreleri yıkayın. % 0.05 tripsin kullanılarak yapışkan hücreleri ayırmak. 1 ml ayırma tamponu ve spin tripsin hücre süspansiyonu seyreltilir300 x g 5 dak.
2. Süpernatant aspire. 500 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
3. 300 x g, 5 dakika boyunca Spin hücreleri.
4. Aspire tamamen süpernatanlarına. 90 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul anti-Sca1-FITC ile primer antikor ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
5. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. tamamen süpernatantı.
6. 80 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
7. mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın.
8. 500 ul tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın.
9. Manyetik tutucu sütun yerleştirin ve 500 ul tamponu ile sütun yıkayın.
10. kolonuna hücre süspansiyonu ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
11. Etiketsiz SCA1 toplayın ^{- <}/ Sup> hücreler ve 500 ul tampon ile kolon 3 kere yıkayın. rezervuar boşken sadece yeni tampon ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının.
12. manyetik tutucu sütunu çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin.
13. Kolon rezervuar üzerinden sağlanan pistonu iterek Sca1 ⁺ kolona tampon ve Zehir ml 1 ekleyin.
14. 300 x g'de 5 dakika boyunca hücre kesirler aşağı doğru döndürün. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse hücreleri.
15. etiketli ve etiketsiz kesirler 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
16. 6 plaka 1 kuyuda her bir hücre fraksiyonu Plate.

Akım Sitometrisi ile Sca1 ^yüksek ACSS ve İmmunomanyetik Ayrılık 6. Doğrulama

1. HBSS (-Ca, -MG) ile iki kez hücreleri durulayın ve% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak.
2. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse edin hücreleri ve hemasitometre kullanarak saymak.
3. Elde> 10 ⁶ 1 ml kültür ortamı içinde hücre ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
4. süpernatant ve tekrar adım 6.3 iki kez daha çıkarın.
5. % 2 keçi serumu, 1 ml +% 2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blok ile yeniden süspanse hücreleri.
6. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje hücreleri.
7. çözümü engelleme çıkarın.
8. 4 ° C'de% 2 keçi serumu ve% 2 BSA + PBS ile 100 ul PBS içinde: ya da anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1): sıçan IgG2a Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1) ekleme karanlıkta 30 dakika karıştırıldı.
9. hücreler soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüje 300 x g.
10. süpernatant ve tekrar adım 6.9 iki kez daha çıkarın.
11. 1 ml PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. akım sitometri analizi için hazırlık 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonları iletin.

Sonuçlar

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 ^yüksek TSK zenginleştirilmesi.

SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT ^{türevi), yüksek} Sca1 ve Sca1 ^düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 ^yüksek

Tartışmalar

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK ^9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094