הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

Summary

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Abstract

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introduction

תאי גזע אנטיגן 1 (Sca1, או Ly6A / E) זוהה לראשונה כסמן פני התא הביע על ידי תאים hematopoietic ו גזע mesenchymal ^5,6. השבר וסקולרית סטרומה (SVF) של רקמת שומן המתקבלת מאגרי שומן עכבר הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים הכוללים פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי אנדותל של כלי דם, תאים עצביים, ועל ובתאים adipocyte ^7. ובתאי adipocyte, או תאי גזע שמקורם שומן (ASCs) הם תאים שאינם שומנים-לאדן כי מתגוררים מטריקס perivascular עשיר קולגן (ECM) ^8. כ -50% של SVF מורכב ASCs, המאופיינים שלילי השושלת (לין ^-) ו CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} רוב של תאים אלה הם Sca1 ^+: CD24 ^- אבות adipocyte, המסוגלים בידול adipocyte במבחנה; עם זאת, רק חלק קטן של תאים (0.08% של SVF) מהווה Sca1 +: CD24 ⁺ תאים המסוגלים מלא של מתרבים ומבדל לתוך adipocytes בתנאים vivo ב ^9. למרות הסייגים הפוטנציאל של שימוש Sca1 ⁺ SVF ללא אפלית CD24 ⁺ תאי CD24 ^- תאים, לבודד Sca1 ⁺ ASCs מן מחסני שומן באמצעות פרדת תא immunomagnetic היא גישה יעילה ומעשית כדי לקבוע את הפנוטיפ-אוטונומי תא של ובתאים adipocyte העיקרי.

בתחום השמנת יתר וסוכרת, סיסטיק לרקמות ודלקת לשחק תפקיד קריטי בפיתוח ותחזוקה של סוכרת מסוג 2 ^3. לאחרונה, Tokunaga et al. הראה כי תאי ^גבוה Sca1 המבודד מפשעתי (או תת עורית, SQ) ו perigonadal (או קרבי, VIS) מאגרי שומן C57BL6 / J להפגין חתימות גנטיות שונות שיפוץ ECM במבחנה ^10. MMP14 (MT1-MMP), חבר אבטיפוס של-t הממברנהמטלו מטריקס ype (MMP) המשפחה מתווכת בפיתוח שומן לבן (WAT) דרך פעילותה collagenolytic ^1.

דוגמאות של ניסויים שעלולים להתנהל עם התאים מבודדים והעשירו באמצעות הפרוטוקול הבא כוללות תרבות תלת ממדים, מחקרי בידול, מבחני שפלת קולגן, ו- RNA רצף ^10,11. מבחני שפלה צריכים להתנהל עם קולגן חומצת חילוץ כדי להבטיח את השימור של telopeptide ^11,12. הפרוטוקול הבא יהיה להדגים את השיטות לבודדות תאי סטרומה וסקולרית ראשית ממנהל מאגרי שומן שונים ולהעשיר ובתאי adipocyte באמצעות פרדת תא immunomagnetic. תוקפו של מיון התא יוערכו עם זרימת cytometry ובאמצעות באמצעות עכברים Sca1-GFP המבטאים GFP ב Sca1 ⁺ תאים, מונע על ידי האמרגן Sca1 ^13.

Protocol

משפט ואתיקה: אוניברסיטת מישיגן ועדת על השימוש והטיפול של בעלי חיים (UCUCA) ואישר את כל שיטות ופרוטוקולים בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון מעבדה בבעלי חיים למחקר, המועצה הלאומית למחקר). עכברים נשמרות ביבר אוניברסיטת מישיגן מקבלים גישה חופשית למזון ומים ושמר על מחזור 12 שעות חושך / אור.

1. הכנות

1. כן תקשורת התרבות העיקרית עם DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G ו- 1x אנטיביוטיקה / antifungals. זה ישמש כדי לשמור רקמות לעיכול לפני. מניח מניות aliquot באמבט מים 37 ºC.
2. כן חמישה מיליליטר של תמיסת collagenase Type III ב 5 מג / מיליליטר מומס HBSS (+ Ca, Mg +) עבור כל סוג של כרית שומן מבודדת, עד חמישה עכברים. לדוגמה, כאשר לבודד SQ ו VIS מ גנוטיפ יחיד, לעשות 10 מ"ל, אם סוג-בר SQ מוטנטים VIS, לעשות 20 מ"ל. התאם ל- pH 7.4 ו STEלהרגיז מסנן. Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל. מניחים בצד הרחק מאור.
3. השתמש 70% אתנול לחיטוי בתחום כירורגית. נגב ולכסות עם כרית כחולה. לרסס קצת אתנול על כרית כחולה.
4. השתמש 22 מחטי G כדי להצמיד כרית ספיגה ללוח הקלקר לקצץ במספריים. תרסיס כרית עם אתנול ולאחר מכן להגדיר את הלוח על כרית כחולה ומכסים כרית כחולה אחרת עד תחילת לנתיחה.
5. מלאו שני צינורות 50 מ"ל עם אתנול ומניחים עמדה סמוך בתחום כירורגית. מניח את מספרי מלקחיים של אתנול.
6. מלאו אחר צינור 50 מ"ל עם PBS בתוספת 1x אנטי-אנטי לשטיפה אתנול מחוץ כלים כירורגיים.
7. ב למכסה המנוע, מנות התווית 60 מ"מ לכל סוג רקמה ולמלא עם התקשורת והתרבות חימם עד 37 ºC. מניח את הצלחות סמוכות לאזור כירורגית.

בידוד 2. של תת עורי (SQ) רפידות שומן

1. להרדים עכבר עם ממנת יתר של isoflurane ו pneumothorax.
2. בעדינותלרסס עכבר עם 70% אתנול ושכב פרקדן. הצמד את הכפות אל קאפה עם 22 מחטים G.
3. ביצוע חתך קטן בעור של הבטן התחתונה. החזקת החלק העליון של החתך עם מלקחיים, לקחת את המספריים ולהפריד את העור מפני הצפק.
4. לאחר העור מופרד הצפק מן הבטן אל החזה, לשקף את העור הרחק הצפק לכיוון הראש על ידי ביצוע חתכים לרוחב בעור לאורך צדי הגוף.
5. לשקף את העור שנותר מחזיק את השומן מפשעתי מהגוף להצמיד ללוח עם 22 מחטים G.
6. Switch to מספרי מלקחיים בסדר. תפוס את כרית השומן מפשעתי עם מלקחיים בראשית הצירים ליד הצפק לגזוז בין עור ושומן מפשעתי התקדמות לקראת במפשעה הימנעות זיהום SQ עם העור.
7. מניחים את כרית השומן מפשעתי insolated בצלחת שכותרתו 60 מ"מ.

3. בידוד של הקרביים (VIS) רפידות שומן

1. באופן דומה לשלב 2.5, לחתוך הצפק פתוח לחשוף את רפידות ובמעיים שומן הקרביים.
2. הזז את הבטן משם לכיוון בית החזה.
3. תפוס את כרית השומן VIS בקצה הדיסטלי ולמשוך בעדינות. לנתח את כרית שומן VIS תוך הקפדה שלא לכלול epididymal (או רחם, אם באמצעות נקבת עכברים) רקמות.
4. מקום בצלחת שכותרתו וחזור על שלב 3.3 עבור כרית VIS הנותרים.

4. עיכול Collagenase של רפידות שומן

1. הזז 60 מ"מ צלחות למכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב את התקשורת.
2. לרכך את רפידות שומן עם מספריים מעוקל מכן להוסיף לפתרון collagenase. הקפידו לשטוף את המספריים מלקחיים בין סוגי רקמות עם אתנול PBS.
3. Shake ב 300 סל"ד ו -37 ºC עבור 10-20 דקות עד רקמות מתעכלות. מקובל אם כמה חתיכות של SQ עדיין גלויות. זה יטופל בשלב מאוחר יותר.
4. הוסף 25 מ"ל של התקשורת בתרבות לפתרון collagenase לעצור את collagטיפול enase, ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם טפטף סרולוגיות 10 מיליליטר לפזר את הרקמות המעוכלות.
5. תאי זנים באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x.
6. בזהירות למזוג את התקשורת לא להפריע גלולה ולהוסיף 5 מ"ל של מים סטריליים כדי גלולה ו פיפטה בעדינות להשעות תאים. חכה 2 דקות כדי lyse אריתרוציטים.
7. הוסף 25 מ"ל של התקשורת עם תאים FBS ומתח 10% דרך מסננת תא חדש 100 מיקרומטר.
8. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. התקשורת למזוג ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של התקשורת והתרבות.
9. ספירת תאים עם hemocytometer באמצעות 1: 1 trypan כחול.
10. פלייט 1 x 10 ⁶ תאים היטב אחד על צלחת 6 באר.

5. הפרדת Cell מגנטית

1. לאחר כ -4 עד 6 שעות של הידבקות התא, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg). לנתק תאים חסידים באמצעות טריפסין 0.05%. לדלל השעית תא טריפסין חיץ הפרדה 1 מיליליטר ספין עבור5 דקות ב g 300 x.
2. לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר 500 μl. הסרת aliquot 10 μl ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
3. ספין תאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם.
4. לשאוב supernatant לחלוטין. תאי Resuspend ב 90 חיץ μl. הוסף 10 μl נוגדן ראשוני נגד Sca1-FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
5. שטפו תאים עם 1 מ"ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. הסר supernatant לחלוטין.
6. תאי Resuspend ב 80 חיץ μl. הוסף 20 μl microbeads אנטי FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך.
7. שטפו תאים עם 1 מ"ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x.
8. הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 μl.
9. מקום עמודה בעל מגנטית ולשטוף טור עם 500 חיץ μl.
10. הוסף השעית תא לעמודה. הימנע בועות תוך pipetting.
11. אסוף את Sca1 ללא תווית ^{- <}/ Sup> תאים ולשטוף פעמים בטור 3 עם 500 חיץ μl. רק להוסיף למאגר חדש כאשר המאגר ריק. הימנע בועות תוך pipetting.
12. הסר עמודה מבעל מגנטי ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.
13. הוסף 1 מ"ל חיץ לעמודה ו elute Sca1 ⁺ על ידי דחיפת הבוכנה המסופק באמצעות המאגר טור.
14. ספין למטה שברי תא במשך 5 דקות ב 300 x ז. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ"ל.
15. הסרת aliquot 10 μl מן השברים שכותרתו ללא תווית ולספור תאים באמצעות hemocytometer.
16. פלייט כל שבריר תא 1 גם צלחת 6 באר.

6. אימות של הפרדת immunomagnetic של ACSs Sca1 ^הגבוה עם cytometry הזרימה

1. יש לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg) ו לנתק תאים באמצעות טריפסין 0.05%.
2. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ"ל ולספור באמצעות hemocytometer.
3. השג> 10 ⁶ תאים 1 מ"ל התקשורת בתרבות צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות.
4. הסר צעד supernatant וחזור 6.3 פעמיים נוספות.
5. תאים Resuspend עם 1 מ"ל של סרום עיזים 2% + 2% BSA ולחסום במשך 30 דקות ב RT.
6. תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
7. הסר חסימת פתרון.
8. להוסיף עכברוש IgG2a אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400) או אנטי-Sca1 אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400), ב 100 μl של PBS עם 2% נסיוב עז ו -2% BSA + PBS ב 4 ° C במשך 30 דקות בחושך.
9. הוסף 1 מ"ל של קר PBS לתאים. צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. הסר צעד supernatant וחזור 6.9 פעמיים נוספות.
11. תאים Resuspend ב 1 מ"ל PBS. Pass השעיות התא דרך מסננת התא 100 מיקרומטר כהכנה ניתוח תזרים cytometric.

תוצאות

העשרה של ASCs ^הגבוהה Sca1 מ רפידות שומן שונות.

תאי סטרומה וסקולרית המבודדים תצוגת שומן SQ פיברובלסטים דמויים, נמתחו צורת תא ללא קשר לרמת ביטוי Sca1 (איור 1 א). מצד השני, VIS (eWAT נגזרת) תאי ^...

Discussion

בזאת אנו מדגימים את הבידוד והפרדה תא immunomagnetic של ASCs בעכברים מ רפידות שומן שונים והשימוש בהם לניסויים במבחנה. השיטה המוצגת היא יעילה עבור הבידוד המהיר של מספר רב של ASCs Sca1 החיובי, המהווה יתרון על FACS בתיווך מורכב ויקר טכניים הבידוד של ASCs ^9,14. בניגוד FACS, הפרדת תא im...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094