Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

Zusammenfassung

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Zusammenfassung

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Einleitung

Stammzell - Antigen 1 (Sca1 oder Ly6A / E) wurde zuerst als ein Zelloberflächenmarker von hämatopoetischen Stammzellen und mesenchymalen ^5,6 ausgedrückt identifiziert. Die stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von Fettgewebe aus Maus - Fettdepots erhalten ist eine heterogene Population von Zellen von Fibroblasten umfasst, Makrophagen, vaskulären Endothelzellen, Nervenzellen und Adipozyten Progenitorzellen ^7. Adipocyte Vorläuferzellen oder Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASCS) sind nicht-lipidbeladenen Zellen , die in das Kollagen-reiche perivaskulärem extrazellulären Matrix (ECM) ⁸ befinden. Etwa 50% des SVF von ASCS bestehen, die als linien negativ charakterisiert sind (Lin ^-) und CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} Die meisten dieser Zellen sind Sca1 ^+: CD24 ^- Adipozyten - Progenitoren, die von Adipozyten - Differenzierung in vitro geeignet sind; jedoch nur ein Bruchteil der Zellen (0,08% SVF) bildet Sca1 +: CD24 ⁺ Zellen , die durchaus in der Lage vermehren und differenzieren zu Adipozyten in den in - vivo - Bedingungen ⁹ sind. Trotz der möglichen Einschränkung der ohne Unterscheidung CD24 ⁺ Zellen aus CD24 Sca1 ⁺ SVF mit ^- Zellen, Isolierung Sca1 ⁺ ASCS von Fettdepots immunomagnetischer Zelltrennung unter Verwendung ist eine effiziente und praktische Ansatz , um die zellautonome Phänotyp der primären Adipozyten Vorläuferzellen zu bestimmen.

Auf dem Gebiet der Adipositas und Diabetes, Gewebefibrose und Entzündungen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Wartung von Typ-2 - Diabetes ³ ​​spielen. Vor kurzem Tokunaga et al. zeigten , dass von Leisten- isolierten ^High - Zellen Sca1 (oder subkutan, SQ) und perigonadal (oder viszerale, VIS) ¹⁰ verschiedene Gen - Signaturen und ECM - Umbau in vitro C57BL6 / J Fettdepots aufweisen. MMP14 (MT1-MMP), ein prototypisches Mitglied der membran typ Matrix - Metalloproteinase (MMP) Familie vermittelt die Entwicklung von weißen Fettgewebe (WAT) durch seine kollagenolytischer Aktivität ^1.

Beispiele für Experimente , die mit den Zellen kann durch das folgende Protokoll sind die dreidimensionale Kultur, Differenzierung Studien, Kollagenabbau - Assays und RNA - Sequenzierung ^10,11 isoliert und angereichert durchgeführt werden. Der Abbau Assays sollten mit Säure extrahierten Kollagen durchgeführt werden , um die Erhaltung der Telopeptid ^11,12 zu gewährleisten. Das folgende Protokoll wird die Methoden nachweisen primären Zellen vaskuläre Stroma aus verschiedenen Fettdepots zu isolieren und zu Adipozyten-Vorläuferzellen unter Verwendung von immunomagnetischer Zelltrennung zu bereichern. Die Gültigkeit der Zellsortierung mit Fluss bewertet werden Zytometrie und durch den Einsatz von Sca1-GFP - Mäuse , die GFP in Sca1 ⁺ Zellen exprimieren, angetrieben durch einen Sca1 Promotor ^13.

Protokoll

Ethik-Statement: Die University of Michigan Ausschuss für Benutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) hat sich für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Institut für Labortierforschung, National Research Council) alle Methoden und Protokolle gemäß dem Leitfaden genehmigt. Die Mäuse werden in einer von der Universität Michigan Vivarium gehalten und haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser und hielt auf einem 12 Stunden Hell / Dunkel-Zyklus gegeben.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Primärkulturmedien DMEM, 10% FBS, 1 x P / S / G und 1x Antibiotika / Antimykotika. Dies wird verwendet, um Gewebe zu halten, bevor die Verdauung. Legen Sie Lager und aliquoten in 37 ºC Wasserbad.
2. Bereiten fünf Milliliter Typ III Kollagenase-Lösung auf 5 mg / ml in HBSS gelöst (+ Ca + Mg) für jede Art von Fettpolsters isoliert ist, bis zu fünf Mäusen. Wenn zum Beispiel SQ und VIS aus einem einzigen Genotyp zu isolieren, machen 10 ml, wenn Wildtyp und Mutante SQ und VIS, 20 ml zu machen. Der pH-Wert auf 7,4 und sterile Filter. Aliquote in 50-ml-Röhrchen. Nehmen Sie sich weg vom Licht.
3. Verwenden Sie 70% Ethanol Operationsfeld zu desinfizieren. Wischen Sie und Deckel mit einem blauen Pad. Sprühen Sie etwas Ethanol auf dem blauen Kissen.
4. Verwenden Sie die 22 G Nadeln ein absorbierendes Kissen auf der Styroporplatte festzunageln und schneiden mit einer Schere. Sprühen Sie das Pad mit Ethanol dann das Brett auf dem blauen Kissen gesetzt und mit einem anderen blauen Kissen abdecken, bis Dissektion beginnt.
5. Füllen Sie zwei 50-ml-Röhrchen mit Ethanol und in einem Stand neben dem OP-Feld. Legen Sie die Schere und Pinzette in Ethanol.
6. Füllen Sie ein weiteres 50-ml-Röhrchen mit PBS plus 1x anti-anti für Ethanol aus chirurgischen Werkzeugen zu spülen.
7. In der Haube, Etikett 60-mm-Schalen für jeden Gewebetyp und füllen mit Kulturmedien auf 37 ° C erwärmt. Legen Sie die Platten neben dem OP-Bereich.

2. Isolierung von subkutanem (SQ) Fettpolster

1. Euthanize Maus mit einer Überdosis von Isofluran und Pneumothorax.
2. SanftSpray-Maus mit 70% Ethanol und lag dem Rücken. Pin die Pfoten auf die Schaumplatte mit 22 G Nadeln.
3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut des Unterleibs. die Spitze der Schnitt mit der Zange halten, nehmen Sie die Schere und die Haut vor dem Peritoneum trennen.
4. Sobald die Haut aus dem Peritoneum vom Abdomen auf den Thorax getrennt ist, spiegeln die Haut vom Peritoneum in Richtung des Kopfes durch entlang der Seite des Körpers seitliche Schnitte in der Haut.
5. Spiegeln die verbleibende Haut in den Leisten Fett vom Körper weg halten und Stift mit 22 G Nadeln an der Platte nach unten.
6. Wechseln Sie zu einer feinen Schere und Pinzette. Besorgen Sie sich die Leistenfettpolster mit der Zange am Ursprung in der Nähe des Peritoneum und schnippeln entfernt zwischen der Haut und Leisten- Fett in Richtung der Leiste voran Vermeidung der SQ mit der Haut zu kontaminieren.
7. Legen Sie die insolated Leistenfettpolster in der 60-mm-Schale bezeichnet.

3. Isolierung von Visceral (VIS) Fettpolster

1. In ähnlicher Weise zu Schritt 2.5, schneiden Sie das Peritoneum geöffnet, um die viszerale Fettpolster und gut aus.
2. Bewegen Sie den Darm weg in Richtung des Thorax.
3. Besorgen Sie sich die VIS Fettpolster am distalen Ende und sanft nach oben ziehen. Präparieren Sie das VIS Fettpolster, während vorsichtig epididymal auszuschließen (oder des Uterus, wenn weibliche Mäuse verwendet wird) Gewebe.
4. Platz in der Bezeichnung Schale und wiederholen Sie den Schritt 3.3 für den verbleibenden VIS-Pad.

4. Collagenaseverdau von Fettpolstern

1. Verschieben 60 mm-Schalen auf die Gewebekultur Kapuze und absaugen Medien.
2. Mince die Fettpolster mit einer gebogenen Schere fügen Sie dann zu Kollagenase-Lösung. Achten Sie darauf, die Schere und Zange zwischen Gewebetypen mit Ethanol und PBS zu spülen.
3. Schütteln bei 300 rpm und 37 ° C für 10-20 min, bis Gewebe verdaut werden. Es ist akzeptabel, wenn einige Stücke von SQ noch sichtbar sind. Dies wird in einem späteren Schritt zu richten.
4. 25 ml Kulturmedien auf die Kollagenase-Lösung die collag zu stoppenenase Behandlung und Pipette nach oben und unten 10-mal mit einer 10 ml serologische Pipette die verdaute Gewebe zu verteilen.
5. Der Stamm-Zellen eine 100 & mgr; m Zelle Sieb verwendet wird. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g.
6. Sorgfältig Medien abdekantieren nicht das Pellet zu stören und zu 5 ml sterilem Wasser zu dem Pellet hinzu und sanft Pipetten Zellen zu suspendieren. Warten Sie 2 min Erythrozyten zu lysieren.
7. 25 ml Medium mit 10% FBS und Dehnungs Zellen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb.
8. Zentrifuge für 10 min bei 300 x g. Dekantieren Medien und Pellet in 1 ml Kulturmedium.
9. Zählen von Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung von 1: 1 Trypanblau.
10. Platte 1 x 10 ⁶ Zellen in einer Vertiefung auf einer Platte mit 6 Vertiefungen.

5. Magnetzellseparation

1. Nach etwa 4 bis 6 Stunden der Zelladhäsion, spülen die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg). Distanzieren anhaftenden Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin. Verdünnen Trypsin Zellsuspension in 1 ml Trennpuffer und Spin5 min bei 300 x g.
2. Überstand entfernen. Die Zellen in 500 & mgr; l Puffer. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot und zählen Zellen eine Zählkammer.
3. Spin-Zellen für 5 min bei 300 x g.
4. Überstand entfernen vollständig. Die Zellen in 90 & mgr; l Puffer. In 10 ul anti-Sca1-FITC primären Antikörper. Gut mischen und Inkubation für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln.
5. Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g. Vollständig entfernen Überstand.
6. Die Zellen in 80 ul Puffer. In 20 ul anti-FITC-Mikrokügelchen. Gut mischen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
7. Wasche die Zellen mit 1 ml Puffer und Zentrifuge Zellen 5 min bei 300 x g.
8. Überstand entfernen und Pellet in 500 & mgr; l Puffer.
9. Legen Sie Spalte in der Magnethalterung und spülen Säule mit 500 & mgr; l Puffer.
10. Hinzufügen Zellsuspension zu Spalte. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren.
11. Sammeln Sie die unbeschriftete Sca1 ^{- <}/ Sup> Zellen und Säule 3-mal mit 500 & mgr; l Puffer waschen. Nur neue Puffer hinzuzufügen, wenn der Behälter leer ist. Vermeiden Sie Blasen beim Pipettieren.
12. Entfernen Sie Spalte aus dem Magnethalter und in einen 15 ml konischen Röhrchen.
13. 1 ml Säulenpuffer und Sca1 ⁺ eluieren durch geliefert Kolben durch die Säule Reservoir drückt.
14. Spin down Zellfraktionen für 5 Minuten bei 300 x g. Die Zellen in 1 ml Kulturmedium.
15. Entfernen Sie ein 10-ul-Aliquot aus den markierten und unmarkierten Fraktionen und zählen Zellen eine Zählkammer.
16. Platte jede Zellfraktion in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte.

6. Überprüfung der Immunomagnetische Trennung von Sca1 ^hohe ACSs mit Durchflusszytometrie

1. Spülen Sie die Zellen zweimal mit HBSS (-Ca, -Mg) und distanzieren Zellen unter Verwendung von 0,05% Trypsin.
2. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min. Die Zellen in 1 ml Kulturmedien und zählen eine Zählkammer.
3. Erhalten> 10 ⁶ Zellen in 1 ml Kulturmedien und Zentrifuge bei 300 g für 5 min.
4. Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.3 zwei weitere Male.
5. Die Zellen mit 1 ml 2% Ziegenserum + 2% BSA und Block 30 min bei RT.
6. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min.
7. Entfernen Lösung blockiert.
8. Hinzufügen Ratte IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 & mgr; g, 1: 400) oder anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 & mgr; g, 1: 400), in 100 & mgr; l PBS mit 2% Ziegenserum und 2% BSA + PBS bei 4 ° C für 30 min im Dunkeln.
9. 1 ml kaltem PBS zu den Zellen. Zentrifuge 300 xg für 5 min bei 4 ° C.
10. Überstand entfernen und wiederholen Sie den Schritt 6.9 zwei weitere Male.
11. Die Zellen in 1 ml PBS. Pass Zellsuspensionen durch ein 100 & mgr; m Zellsieb in der Vorbereitung für die durchflusszytometrische Analyse.

Ergebnisse

Anreicherung von Sca1 ^hohe ASCS aus verschiedenen Fettpolster.

Die vaskuläre Stromazellen aus SQ Fett Anzeige Fibroblasten-ähnliche isoliert, gestreckt Zellform unabhängig von Sca1 Expressionsniveau (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, VIS (EWAT-derived) Sca1 ^hoch und Sca1 ^niedrigen Zellen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Zellform. Wie SQ (iWAT abgeleitete) Sca1

Diskussion

Hier zeigen wir die Isolierung und immunomagnetischer Zellseparation von murinen ASCS aus verschiedenen Fettpolster und deren Verwendung für die in - vitro - Experimenten. Die vorgestellte Methode ist wirksam für die schnelle Isolierung von großen Anzahl von Sca1-positive ASCS, die über die technisch aufwendige und teure FACS-vermittelte Isolierung von ASCS ^9,14 vorteilhaft ist. Anders als FACS, ist immunomagnetischen Zelltrennung erlauben nicht die Verwendung von mehreren Antigen zur Id...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094