Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; Cellules souches adipeuses (CSA)

Résumé

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1^high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Résumé

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function^1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance^3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1^high ASCs.

Introduction

La tige antigène de cellule 1 (SCA1 ou Ly6A / E) a d' abord été identifié comme un marqueur de surface cellulaire exprimée par hématopoïétiques et les cellules souches mésenchymateuses ^5,6. La fraction stroma vasculaire (FSV) du tissu adipeux obtenu à partir de dépôts de graisse de la souris est une population hétérogène de cellules comprenant des macrophages, des fibroblastes, des cellules endothéliales vasculaires, les cellules neuronales et les cellules progénitrices adipocytaires ^7. Les cellules progénitrices d'adipocytes ou cellules souches dérivées de tissu adipeux (ASC) sont des cellules non-lipidiques chargées qui résident dans la matrice extracellulaire périvasculaire riche en collagène (ECM) ^8. Environ 50% de la SVF se composent de ASCs, qui sont caractérisés comme lignée négative (Lin ^-) et CD29 ^+: CD34 ^+: Sca1 ^{+ 9.} La plupart de ces cellules sont Sca1 ^+: CD24 ^- progéniteurs adipocytaires, qui sont capables de différenciation des adipocytes in vitro; cependant, seule une fraction des cellules (0,08% de SVF) constitue Sca1 ^{+: CD24 + cellules qui sont parfaitement capables de proliférer et de se différencier en adipocytes dans les conditions in vivo 9. Malgré la mise en garde potentiel d'utilisation Sca1 + SVF sans discrimination des cellules CD24 + de CD24 - cellules, isolement Sca1 + ASCs de dépôts de graisse à l' aide de la séparation cellulaire immunomagnétique est une approche efficace et pratique pour déterminer le phénotype cellulaire autonome des cellules progénitrices d'adipocytes primaires.}

Dans le domaine de l' obésité et le diabète, la fibrose des tissus et de l' inflammation joue un rôle essentiel dans le développement et l' entretien du diabète de type 2 ^3. Récemment, Tokunaga et al. ont montré que SCA1 ^élevé des cellules isolées de inguinale (ou sous - cutanée, SQ) et perigonadal (ou viscérale, VIS) C57BL6 / J dépôts de graisse présentent différentes signatures génétiques et ECM remodelage in vitro ^10. MMP14 (MT1-MMP), un élément prototypique de la membrane tmatrice ype métalloprotéinase (MMP) famille médiatise le développement du tissu adipeux blanc (WAT) à travers son activité collagénolytique ^1.

Des exemples d'expériences qui peuvent être effectués avec les cellules isolées et enrichies par le protocole suivant comprennent la culture en trois dimensions, des études de différenciation, des essais de dégradation du collagène, et le séquençage de l' ARN ^10,11. Des essais de dégradation doivent être menées avec le collagène acide extrait pour assurer la préservation de télopeptide ^11,12. Le protocole suivant démontrera les méthodes pour isoler les cellules stromales vasculaires primaires de différents dépôts de graisse et d'enrichir les cellules progénitrices d'adipocytes en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique. La validité du tri cellulaire sera évaluée avec cytométrie en flux et par l' utilisation de Sca1-GFP souris qui expriment la GFP dans Sca1 ⁺ cellules, entraînée par un promoteur Sca1 ^13.

Protocole

Déclaration éthique: L'Université du Michigan Comité sur l'utilisation et l'entretien des animaux (UCUCA) a approuvé toutes les méthodes et protocoles en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Institute for Laboratory Animal Research, Conseil national de recherches). Les souris sont maintenues dans une Université du Michigan vivarium et bénéficient d'un accès libre à la nourriture et de l'eau et maintenus sur un cycle de 12 heures foncé / lumière.

1. Préparatifs

1. Préparer les milieux de culture primaire avec DMEM, 10% de FBS, 1x P / S / G, et 1x antibiotiques / antifongiques. Il sera utilisé pour garder les tissus à la digestion avant. Placez stock et aliquote dans 37 ºC bain d'eau.
2. Préparer cinq millilitres de solution de collagénase de type III à 5 mg / ml dissous dans du HBSS (+ Ca + Mg) pour chaque type de coussinet adipeux étant isolés jusqu'à cinq souris. Par exemple, lors de l'isolation SQ et le VIS à partir d'un seul génotype, faire 10 ml, si de type sauvage et mutant SQ et le VIS, faire 20 ml. Ajuster le pH à 7,4 et sterile filtre. Aliquoter en tubes de 50 ml. Mettez de côté de la lumière.
3. En utilisant 70% d'éthanol pour la désinfection champ opératoire. Essuyez et couvrir avec un tampon bleu. Vaporisez un peu d'éthanol sur le pavé bleu.
4. Utilisez les 22 G aiguilles à cerner un tampon absorbant à la planche de styromousse et de couper avec des ciseaux. Vaporiser le tampon avec de l'éthanol puis définissez le conseil sur le pavé bleu et couvrir avec un autre tampon bleu jusqu'au début de la dissection.
5. Remplir deux tubes de 50 ml avec de l'éthanol et le placer dans une position adjacente au champ opératoire. Placez les ciseaux et des pinces dans l'éthanol.
6. Remplir un autre tube de 50 ml avec du PBS 1x, plus anti-anti rinçage à l'éthanol hors des outils chirurgicaux.
7. Dans la hotte, l'étiquette des boîtes de 60 mm pour chaque type de tissu et de remplir avec des milieux de culture chauffée à 37 ºC. Placez les plaques adjacentes à la zone chirurgicale.

2. Isolement des sous-cutanée (SQ) Fat Pads

1. Euthanasier souris avec une surdose d'isoflurane et de pneumothorax.
2. Doucementvaporisez souris avec 70% d'éthanol et de jeter supination. Epingler les pattes à la planche en mousse avec 22 G aiguilles.
3. Faire une petite incision dans la peau de l'abdomen inférieur. En tenant le haut de la coupe avec la pince, prendre les ciseaux et séparer la peau du péritoine.
4. Une fois que la peau est séparée du péritoine de l'abdomen au niveau du thorax, reflètent la peau loin du péritoine vers la tête en effectuant des coupes latérales dans la peau le long du côté du corps.
5. Refléter la peau restante tenant la graisse inguinale loin du corps et de cerner à la carte avec 22 G aiguilles.
6. Passer à des ciseaux fins et des pinces. Prenez le coussinet adipeux inguinal avec la pince à l'origine près du péritoine et snip loin entre la peau et la graisse inguinale progressant vers l'aine en évitant de contaminer la SQ avec la peau.
7. Placez le coussin de graisse inguinale insolated dans le mm plat marqué 60.

3. Isolement de Visceral (VIS) Pads Fat

1. De façon similaire à l'étape 2.5, couper le péritoine ouvert pour exposer la viscérale coussinets adipeux et de l'intestin.
2. Déplacer l'intestin loin vers le thorax.
3. Prenez le coussinet adipeux VIS à l'extrémité distale et tirez doucement vers le haut. Disséquer le coussinet adipeux VIS tout en veillant à exclure l'épididyme (ou de l'utérus, en cas d'utilisation des souris femelles) tissus.
4. Placer dans un plat marqué et répétez l'étape 3.3 pour le pad restant VIS.

4. collagénase Digestion de Fat Pads

1. Déplacer 60 mm plats à la culture de tissus capot et aspirer hors médias.
2. Émincer les coussinets adipeux avec des ciseaux courbes, puis ajouter à la solution de collagénase. Assurez-vous de rincer les ciseaux et des pinces entre les types de tissus avec de l'éthanol et du PBS.
3. Agiter à 300 tours par minute et 37 ° C pendant 10-20 min jusqu'à ce que les tissus sont digérés. Il est acceptable si certains morceaux de SQ sont encore visibles. Cette question sera abordée dans une étape ultérieure.
4. Ajouter 25 ml de milieu de culture à la solution de collagénase pour arrêter le collagtraitement enase, et la pipette de haut en bas 10 fois avec 10 ml pipette sérologique pour disperser les tissus digérés.
5. cellules souches en utilisant un tamis cellulaire 100 um. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g.
6. Décanter avec soin hors médias de ne pas perturber le culot et ajouter 5 ml d'eau stérile au culot et doucement la pipette de suspendre les cellules. Attendre 2 min pour lyser les érythrocytes.
7. Ajouter 25 ml de milieu avec des cellules de FBS et de déformation de 10% grâce à une nouvelle cellule crépine 100 um.
8. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Décanter les médias et remettre le culot dans 1 ml de milieu de culture.
9. Compter les cellules avec un hémocytomètre en utilisant 1: 1 bleu trypan.
10. Plate 1 x 10 ⁶ cellules dans un puits sur une plaque à 6 puits.

5. magnétique de séparation cellulaire

1. Au bout d'environ 4 à 6, h d'adhérence cellulaire, rincer deux fois les cellules avec du HBSS (-Ca, Mg). Dissocier les cellules adhérentes en utilisant 0,05% de trypsine. Diluer la trypsine suspension cellulaire dans 1 ml de tampon de séparation et de spin pour5 min à 300 x g.
2. surnageant Aspirer. Resuspendre les cellules dans 500 pi de tampon. Retirer une partie aliquote de 10 pl et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
3. les cellules d'essorage pendant 5 min à 300 x g.
4. Aspirer le surnageant complètement. Resuspendre les cellules dans 90 ul de tampon. Ajouter 10 anticorps primaire anti-Sca1-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 ° C dans l'obscurité.
5. Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g. Retirer le surnageant complètement.
6. Resuspendre les cellules dans 80 ul de tampon. Ajouter 20 microbilles anti-FITC ul. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
7. Laver les cellules avec 1 ml de tampon et des cellules de centrifugation pendant 5 min à 300 x g.
8. Retirer le surnageant et remettre le culot dans 500 ul de tampon.
9. Placer la colonne dans le support magnétique et rincer la colonne avec 500 pi de tampon.
10. Ajouter la suspension cellulaire à la colonne. Éviter les bulles tout pipetage.
11. Recueillir le Sca1 non marqué ^{- <}/ Sup> cellules et laver la colonne 3 fois avec un tampon de 500 pi. Seulement ajouter un nouveau tampon lorsque le réservoir est vide. Éviter les bulles tout pipetage.
12. Retirer la colonne du support magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml.
13. Ajouter 1 ml de tampon à la colonne et éluer Sca1 ⁺ en poussant le piston fourni par le réservoir de la colonne.
14. Isoler les fractions de cellules pendant 5 min à 300 x g. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture.
15. Retirer une partie aliquote de 10 ul des fractions marquées et non marquées et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
16. Plaquer chaque fraction cellulaire dans une cupule d'une plaque à 6 puits.

6. Vérification de la séparation immunomagnétique de Sca1 ^haute ACS avec cytométrie de flux

1. Rincer les cellules deux fois avec HBSS (-Ca, -Mg) et dissocier les cellules en utilisant 0,05% de trypsine.
2. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu de culture et comptent au moyen d'un hémocytomètre.
3. Obtenir> 10 ⁶ cellules dans 1 ml de milieu de culture et centrifuger à 300 g pendant 5 min.
4. Retirer le surnageant et répétez l'étape 6.3 plus de deux fois.
5. Resuspendre les cellules avec 1 ml de sérum de chèvre à 2% + 2% de BSA et de bloquer pendant 30 min à température ambiante.
6. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min.
7. Retirer la solution de blocage.
8. Ajouter le rat IgG2a Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400) ou anti-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 pg, 1: 400), dans 100 ul de PBS avec 2% de sérum de chèvre et 2% de BSA + PBS à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité.
9. Ajouter 1 ml de PBS froid aux cellules. Centrifugeuse 300 g pendant 5 min à 4 ° C.
10. Retirer le surnageant et répétez l'étape 6.9 plus de deux fois.
11. Resuspendre les cellules dans 1 ml de PBS. Passer des suspensions de cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um pour préparer une analyse cytométrique de flux.

Résultats

Enrichissement de ASCs ^élevés SCA1 de différents Pads Fat.

Les cellules stromales vasculaires isolées à partir de l' affichage de la graisse SQ fibroblaste, étirées la forme des cellules , indépendamment du niveau d'expression Sca1 (figure 1A). D'autre part, le VIS (EWAT-dérivée) des cellules à ^faible SCA1 ^élevé et SCA1 démontrent nette différence dan...

Discussion

Ici , nous démontrons l'isolement et la séparation cellulaire immunomagnétique de ASCs souris provenant de différents tampons de graisse et leur utilisation pour des expériences in vitro. La méthode présentée est efficace pour l'isolement rapide d' un grand nombre de ASCs de SCA1 positif, ce qui est avantageux par rapport à l'isolement techniquement complexe et coûteux FACS médiée par des ASCs ^9,14. A la différence FACS, la séparation cellulaire immunomagnétique ne perm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Type 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004182	Tissue digestion
DMEM	Gibco	11965-092	High-glucose culture medium
Pen/Strep/Glutamine (100x)	Gibco	10378-016	Media antibiotic
Anti-anti (100x)	Gibco	15240-062	Media antifungal
FBS	Gibco	16000-044
PBS (1x, pH 7.4)	Gibco	10010-023
Trypsin (0.05%)	Gibco	25300-054
Cell strainer	BD Bioscience	352360	100-μm cell strainer
60 mm plates	BD Falcon	353004
Scissors	FST	14001-12	Large
Scissors	FST	14091-11	Fine, curved tip
Large Forceps	FST	11000-12
Fine Forceps	Any vendor
25G 5/8” needles	BD	305122
22G 1.5” needles	BD	305159
15 ml conical tubes	BD Falcon	352097
50 ml conical tubes	BD Falcon	352098
MACS separation columns	Miltenyi Biotec	130-042-201
Anti-Sca1 microbead kit (FITC)	Miltenyi Biotec	130-092-529	FITC-anti-Sca1 1ºAb and anti-FITC microbeads 2ºAb
AutoMACS running buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
MiniMACS separator	Miltenyi Biotec	130-042-102
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Blue chux pads	Fisher	276-12424
Absorbent pads	Fisher	19-165-621
Styrofoam board			Use from 50 ml tubes
70% ethanol
Isoflurane	Any vendor
Rat IgG2a Alexa Fluor 647	Invitrogen	R2a21
Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647	Invitrogen	MSCA21
Rat IgG2a R-PE	Invitrogen	R2a04
Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE	Invitrogen	MF48004
Round-bottom tube	BD Falcon	352058
HBSS (–Ca, –Mg)	Gibco	14175-095
HBSS (+Ca, +Mg)	Gibco	14025-092	For collagenase solution
Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid	Prepare in house12
10x MEM	Gibco	11430-030
1 M HEPES	Gibco	15630-080
0.34 N NaOH	Prepare in house
Cover slips	Corning	2870-22
Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers	Invitrogen	A-20004
0.89 M NaHCO3	Gibco	25080-094