الفئران البروستاتا الجزئي تشريح والإخصاء الجراحي

Summary

توضح هذه المخطوطة بروتوكولات البروستاتا الدقيقة تشريح والإخصاء الجراحي في مختبر الفار. نحن أيضا تصوير النتائج التمثيلية التي تنتجها هذه البروتوكولات. وأخيرا، ونحن نناقش مزايا والاستفادة من هذه البروتوكولات.

Abstract

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Introduction

البروستاتا هي الموقع الاكثر شيوعا من سرطان بين الرجال في الولايات المتحدة. فإن ما يقرب من 220،000 من الرجال وسيتم تشخيص كل عام مع سرطان البروستاتا، وحوالي 27،000 الرجال فريسة لمرضهم ^1. الرجال لديهم خطر 1 في 7 مدى الحياة لتشخيص سرطان البروستاتا في الولايات المتحدة ^1. البروستات الحميدة تضخم (BPH)، وتوسيع المرتبطة بالعمر غير سرطاني في البروستاتا، هو أيضا شرط على نطاق واسع، مما يؤثر على أكثر من 80٪ من الرجال فوق 80 ^2. وعلى هذا النحو، والبروستاتا هي محور قدرا كبيرا من البحث.

وقد استخدمت نماذج الماوس على نطاق واسع لدراسة أمراض البروستاتا ^3. وعموما، فإن البروستاتا الماوس هو ممثل ممتاز للغدة الإنسان ^4، ولكن هناك أوجه التشابه والاختلاف بين الفأر وتشريح البروستات البشري وعلم وظائف الأعضاء ^5. في كلا النوعين، وتقع البروستاتا عند قاعدة المثانة، التي تحيط مجرى البول. غدة البروستاتا الإنسان هو لو واحديكون، تنقسم إلى أربع مناطق: المركزي، والانتقال، الطرفية، والأمامي سدى عضلي ليفي. في المقابل، فإن البروستاتا الماوس تتكون من ثلاثة فصوص يقترن في مواقع مختلفة حول الإحليل: الأمامي، بطني، وظهراني جانبي. على المستوى الخلوي، والفرق الرئيسي هو أن الخلايا القاعدية إلى نسبة الخلايا اللمعية في الإنسان حوالي 1: 1، ولكن من 1: 4 في الفئران ^6. سدى الفئران هي أيضا مختلفة في الفئران النسبية على البشر - البشر لديهم العضلات الملساء أكثر اتساعا، في حين أن طبقة العضلات هو أرق بكثير في البروستاتا في الفئران. والصحيح تحديد وتشريح، والتعامل مع البروستاتا الماوس ضرورية لبحث الماوس البروستاتا.

مستويات الهرمون يؤثر بشكل كبير على التنمية والتوازن للغدة البروستاتا لدى كل من البشر والفئران. في حين يبدو الاستروجين للعب دور في تنمية البروستاتا ^7، الهرمون الأكثر أهمية في البروستاتا هو هرمون تستوستيرون. هرمون التستوستيرون هو ضروري لتطور غديد الصيانة. التالية إما الإخصاء البدني أو الكيميائي، ما يقرب من 90٪ من الخلايا اللمعية في apoptose البروستات الكبار، والغدة تتقلص. إذا كان يعيد التستوستيرون للفرد في ظل ظروف الإخصاء، والبروستاتا هي قادرة على تجديد نفسها بكامل طاقتها. يبدو هرمون تستوستيرون أيضا لدفع سرطان البروستاتا، وهذا هو السبب العلاج الحرمان الاندروجين هو استراتيجية علاجية شائعة الاستخدام. ومع ذلك، العديد من أنواع السرطان البروستاتا تصبح مقاومة للالحرمان الاندروجين. وبالإضافة إلى ذلك، الرجال الذين يخضعون للعلاج الحرمان من الأندروجين لعلاج سرطان البروستاتا الخضوع لدورات الظروف مخصي ومجدد. في الماوس، الإخصاء الجراحي، جنبا إلى جنب مع تجديد الهرموني للالبروستاتا عن طريق إعادة تقديم التستوستيرون، هو أداة هامة لدراسة مقاومة الإخصاء وآثار الدراجات التستوستيرون في البروستات.

في هذه المقالة، وسوف نناقش وإظهار التقنيات المناسبة التي يمكن من خلالها المستخدمانه والصغرى تشريح البروستات الماوس، فضلا عن جراحيا يخصوا على فأرة الحاسوب.

Protocol

هذا البروتوكول يلتقي ويتبع المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جونز هوبكنز.

1. الصغرى تشريح البروستات ماوس

1. الموت ببطء الماوس خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون أو أسلوب معتمد بديل وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية.
2. دبوس الماوس في موقف ضعيف إلى لوحة تشريح عن طريق وضع دبوس من خلال كل من الكفوف الأربعة.
3. رش البطن مع الايثانول 70٪.
4. عقد الجلد من أسفل البطن مع ملقط، واستخدام المقص لقطع طريق الجلد أو الغشاء البريتوني حوالي 1 سم الأمامي إلى فتحة القضيب، والحرص على عدم قطع أي أجهزة.
5. قطع الجلد والغشاء البريتوني من أسفل البطن، بزيادة جانبي البطن إلى القفص الصدري، وفضح التجويف البريتوني.
6. التعرف على المثانة والمسالك البولية التناسلية، وكشف لهم عن طريق تحريك بلطف أجهزة الدهون وغيرها إلى الجانب.
7. باليودملقط نانوغرام، وقبضة الأسهر في قاعدة بالقرب من مجرى البول، والمسيل للدموع بعيدا.
8. كرر مع الأسهر المعاكس.
9. باستخدام ملقط، بعناية قبضة المثانة وسحب عنه، بينما في وقت واحد باستخدام مقص لقطع طريق مجرى البول أسفل المثانة والبروستاتا البطنية (حوالي 1 سم تحت قاعدة المثانة).
   ملاحظة: كما يتم سحبها المثانة، وسوف في (المثانة تحتوي على، قسم من مجرى البول، كل فصوص البروستاتا، والحويصلات المنوية) كامل الجهاز البولي التناسلي تأتي معها. قد يكون هناك بعض المقاومة.
10. وضع الجهاز البولي التناسلي (الاتحاد العام للعمال) إلى 60-100 مم طبق بتري تحتوي على ما يقرب من 5-10 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
11. تؤدي الجزء المتبقي من بروتوكول تشريح تحت المجهر. استخدام اثنين من ملقط غرامة، واحد في كل يد. عقد ملقط "مثل قلم رصاص" وراحة الساعدين على أعلى مقاعد البدلاء وذلك لتحقيق استقرار لهم.
12. استخدام ملقط غرامة لوضع الاتحاد العام للعمال بحيث المثانةعلى القمة، وأشار مجرى البول أسفل، ويتم وضع الحويصلات المنوية على جانبي المثانة.
13. قبضة مجرى البول مع ملقط واحد وبعناية سحب الدهون بعيدا مع ملقط أخرى دون تمزيق أي نسيج البروستاتا. ملاحظة: سوف تظهر الدهون "لامعة" نسبة إلى الأنسجة المحيطة بها.
14. وبمجرد إزالة الدهون، واستخدام ملقط لتمزيق النسيج الضام بين اثنين من فصوص البطنية من البروستاتا وفرقوا بينهم.
15. لإزالة واحدة من الفص بطني، استخدم واحد ملقط لقبضة الفص البطني واحد بالقرب من الحافة، واستخدام الملقط أخرى إلى قبضة أن الفص في قاعدة أقرب إلى مجرى البول ممكن. في حين لا تزال تخيم على قاعدة من الفص، استخدام الملقط أخرى إلى قبضة مجرى البول. سحب الفص بعيدا عن مجرى البول مع شركة، الحركة السلسة. تأكد بعدم بقاء أنسجة البروستاتا تعلق على مجرى البول. وضع الفص في الوسط المناسب، اعتمادا على الخطوة التجريبية المقبلة.
    1. لإصلاح والبارافين تضمين لياليوافرة للتحليل النسيجي، وضع الفص في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (NBF) ^8.
    2. وضع الفص في تجميد المتوسطة، مثل أكتوبر، لحفظ البرودة وباجتزاء ^8.
    3. وضع الفص في برنامج تلفزيوني الباردة لعزل خلية واحدة للثقافة أو التدفق الخلوي ^9.
16. كرر الخطوة 1.15 مع الفص البطني الآخرين.
17. لإزالة واحدة من الفص الأمامي، واستخدام الملقط لسحب بلطف الفص بعيدا عن الحويصلة المنوية، والتأكد من عدم ثقب الحويصلة المنوية. مرة واحدة الفص مستقلة عن الحويصلة المنوية، إزالته في نفس منوال الفص البطني في خطوة 1.15.
18. كرر الخطوة 1.17 مع الفص الأمامي الآخرين.
19. الوجه الجهاز البولي التناسلي المتبقية على مثل هذا البروستاتا ظهري مرئيا.
20. لإزالة واحدة من الفص الظهرية الوحشية، واستخدام ملقط لتمزيق النسيج الضام بين اثنين من الفص الظهرية الوحشية وكذلك النسيج الضام بين الفصوص ورانه الخلفية منطقة الحويصلات المنوية. إزالة الفص بطريقة مماثلة كما الفص البطني في خطوة 1.15.
21. كرر الخطوة 1.20 مع الفص ظهراني الآخرين.

2. الإخصاء الجراحي

ملاحظة: هذا هو عملية جراحية البقاء على قيد الحياة، لذلك عقامة، والتخدير، وإدارة الألم مهمة لاستكمال الأخلاقي والناجح لهذا البروتوكول. متابعة جميع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية. استخدام مصدر حراري خارجي، مثل بطانية المياه إعادة تدوير، أثناء إجراء العمليات الجراحية لمنع انخفاض حرارة الجسم. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل استخدامها في الجراحة.

1. على سطح نظيف ومعقم تخدير الماوس باستخدام التدابير المناسبة (على سبيل المثال 2٪ استنشاقه الأيزوفلورين) وموقف م[أوس] في موقف ضعيف. ملاحظة: يمكن أيضا أساليب التخدير البديلة، مثل الكيتامين، يمكن استخدامها، اعتمادا على بروتوكول الحيوان المعتمدة.
2. تحقق ردود الفعل الماوس عن طريق معسر أصابع القدم. إذا لم الماوس رد فعل، انتقل إلى الخطوة التالية. إذا لم تتفاعل، الانتظار 1-3 دقائق والتحقق مرة أخرى. حلق المنطقة الجراحية مع الحلاقة الكهربائية.
3. جو معقم و مطهر إعداد البطن من الفأرة باستخدام الدعك بالتناوب من 70٪ من الإيثانول واليود أو الإجراءات الموصى بها من قبل الموظفين البيطريين المؤسسي أو IACUC.
4. باستخدام مشرط معقم، وجعل شق عمودي 1 سم من خلال الجلد في خط الوسط من أسفل البطن، حوالي 1.5 سم الأمامي للقضيب.
5. إجراء شق صغير (<1 سم) من خلال الغشاء البريتوني، الحرص على عدم قطع أي أجهزة.
6. باستخدام ملقط معقم، وقبضة قطع حافة الصفاق ورفعه برفق بحيث تكون قادرا على رؤية التجويف البريتوني تحت.
7. باستخدام ملقط معقم آخر، والوصول إلى الالبريد التجويف البريتوني وقبضة إما إلى اليسار أو اليمين منصة الدهون الخصية، الأفقي إلى المثانة. سحب لوحة الدهون من خلال فتحة في الصفاق والجلد حتى تأتي الخصية بها كذلك. احرص على عدم إصابة أي أنسجة أو أعضاء أخرى خلال هذه الخطوة.
8. باستخدام قلم الكي، وقطع من خلال لوحة الدهون التي تحتجز الخصية. خفض ببطء من خلال شريان الخصية مع الكي القلم ملاحظة: إذا تم قطع شريان الخصية سريع جدا، قد يكون هناك الكثير من نزيف قد يكون الماوس ليتم التخلص.
9. مرة واحدة يتم قطع لوحة الدهون والشرايين، وإزالة الخصية والدهون وسادة.
10. كرر الخطوات من 2،6-2،9 مع الخصية الأخرى. ملاحظة: أسلوب بديل لإزالة الخصيتين هو ligate جراحيا شريان الخصية، تليها قطع السفينة مع مقص.
11. خياطة الصفاق مغلق مع خياطة للامتصاص.
12. أغلق التيلة الجلد مع مقاطع الجرح الجراحية.
13. إدارة مسكن لإدارة الألم، ومكانالماوس في قفص نظيفة في قفص دفئا لمدة 5-10 دقائق. رصد الماوس لعلامات الألم أو النزيف.

النتائج

تم إزالة كل فصوص البروستاتا ستة من الماوس عن طريق البروستاتا الصغيرة تشريح (الشكل 1). ويتكون الجهاز البولي التناسلي كامل (UGT) من كل فصوص البروستاتا، والمثانة، الحويصلات المنوية، والإحليل (الشكل 1A). الأسهر يعلقها على مجرى البول، ولكن...

Discussion

البروستاتا الصغيرة تشريح يسمح للتجريب الفص محددة وتحليل البروستاتا الماوس (الشكل 1). في نماذج الفئران المعدلة وراثيا، ويمكن اعتبار الظواهر في فص واحد أن لا ينظر في غيرها. أيضا، للتحليل النسيجي، يؤكد هذا البروتوكول الذي أقصى قدر ممكن من أنسجة البروستات نقية ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265