Murine Prostata Micro-Dissektion und chirurgische Kastration

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die Protokolle für Prostata-Mikrodissektion und chirurgische Kastration im Labor Maus. Wir zeigen auch Vertreter von diesen Protokollen erzeugt Ergebnisse. Schließlich diskutieren wir die Vorteile und die Nutzung dieser Protokolle.

Zusammenfassung

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Einleitung

Die Prostata ist die häufigste Stelle von Krebs bei Männern in den USA. Fast 220.000 Menschen jedes Jahr wird mit Prostatakrebs diagnostiziert und etwa 27.000 Menschen werden auf ihre Krankheit ¹ erliegen. Männer haben eine 1 in 7 Lebensdauer Risiko einer Prostatakrebsdiagnose in den USA ^1. Benigner Prostatahyperplasie (BPH), eine altersbedingte noncancerous Vergrößerung der Prostata, ist ebenfalls ein weitverbreiteter Zustand, beeinflussen über 80% der Männer über 80 ^2. Als solche kann die Prostata ist im Mittelpunkt der Beträchtliche Forschung.

Mausmodelle wurden weitgehend zu studieren Erkrankungen der Prostata ³ verwendet. Insgesamt ist die Maus Prostata eine ausgezeichnete Vertreter der menschlichen gland ^4, aber es gibt Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Maus und menschlichen Prostata Anatomie und Physiologie ^5. Bei beiden Arten wird die Prostata an der Basis der Blase, umgibt die Harnröhre entfernt. Die menschliche Prostata ist eine einzige losein, aufgeteilt in vier Zonen: zentral, Übergang, periphere und vordere fibromuskuläre Stroma. Im Gegensatz dazu besteht die Maus Prostata von drei gekoppelten Lappen an verschiedenen Positionen um die Harnröhre: vordere, ventralen und dorsolateralen. Auf zellulärer Ebene ist der Hauptunterschied , dass die basalen Zelle luminalen Zellverhältnis in menschlichen etwa 1: 1, aber es beträgt 1: 4 in Mäusen ^6. Die murine Stroma unterscheidet sich auch bei Mäusen auf den Menschen - Menschen weitergehende glatte Muskulatur haben, während die Muskelschicht viel dünner in murinen Prostata ist. Die richtige Identifizierung, Präparation und Handhabung der Maus Prostata sind unerlässlich, um Maus Prostata Forschung.

Hormonspiegel beeinflussen stark die Entwicklung und die Homöostase der Prostata in Menschen und Mäusen. Während Östrogen ⁷ eine Rolle bei Prostata - Entwicklung zu spielen scheint, ist das wichtigste Hormon , das in der Prostata Testosteron. Testosteron ist für Drüsenentwicklung eind Wartung. Im Anschluss an entweder physikalische oder chemische Kastration, etwa 90% der luminalen Zellen im adulten Prostata apoptose und die Drüse schrumpft. Wenn Testosteron an ein Individuum unter Kastrationsbedingungen wieder eingeführt wird, ist die Prostata kann sich der vollen Kapazität zu regenerieren. Testosteron scheint auch Prostatakrebs zu fahren, weshalb Androgenentzugtherapie eine häufig verwendete therapeutische Strategie ist. Allerdings werden viele Prostatakarzinome auf Androgen Deprivation resistent. Darüber hinaus Männer Androgenentzugtherapie für die Behandlung von Prostatakrebs unterziehen laufen Zyklen kastriert und regeneriert Bedingungen. Bei der Maus chirurgische Kastration, zusammen mit hormonellen Regeneration der Prostata durch Testosteron wieder einzuführen, ist ein wichtiges Werkzeug, mit dem Kastrationsbeständigkeit und die Wirkung von Testosteron-cycling auf die Prostata zu studieren.

In diesem Artikel werden wir die richtigen Techniken, mit denen zu diskutieren und demonstrieren zu LOCATe und Mikro sezieren eine Maus Prostata sowie chirurgisch kastriert eine Maus.

Protokoll

Dieses Protokoll erfüllt und folgt den Richtlinien festgelegt von der Johns Hopkins University Institutional Animal Care und Use Committee.

1. Mikro-Dissektion einer Maus Prostata

1. Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid oder einem alternativen genehmigten Verfahren in Einklang mit den institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung.
2. Pin der Maus in Rückenlage auf eine Dissektion Bord durch einen Stift, der durch jede der vier Pfoten setzen.
3. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
4. Halten Sie die Haut des Unterleibs mit einer Pinzette, und mit einer Schere durch die Haut zu schneiden und ca. 1 cm vor der Öffnung des Penis, vorsichtig, nicht zu schneiden alle Organe Bauchfell.
5. Schneiden Sie die Haut und Bauchfell von den unteren Bauch weg, bis beide Seiten des Bauches auf den Brustkorb, die Bauchhöhle ausgesetzt wird.
6. Identifizieren Sie die Blase und Urogenitaltrakt, und setzen sie durch leichtes Fett und andere Organe zur Seite bewegt.
7. Using Pinzette greifen die Samenleiter an der Basis in der Nähe der Harnröhre, und reißen sie weg.
8. Wiederholen Sie mit den gegenüberliegenden Samenleiter.
9. Mit einer Pinzette vorsichtig in die Blase Griff und nach oben ziehen, während gleichzeitig der Schere unter der Blase und ventralen Prostata (ungefähr 1 cm unterhalb der Basis der Blase) durch die Harnröhre zu schneiden.
   Hinweis: Da die Blase nach oben gezogen wird, die gesamte Urogenitaltrakts (mit Blase, einen Abschnitt der Harnröhre, alle Prostatalappen und den Samenbläschen) mit ihm kommen. Es kann eine gewisse Resistenz sein.
10. Platzieren Sie den Urogenitaltrakt (UGT) in eine 60-100 mm Petrischale, die etwa 5-10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
11. Führen Sie den verbleibenden Teil des Protokolls unter einem Präpariermikroskop. Verwenden Sie zwei feinen Pinzette, eine in jeder Hand. Halten Sie die Zange "wie ein Bleistift" und die Unterarme auf der Tischplatte ruhen, um sie zu beruhigen.
12. Verwenden feinen Pinzette die UGT so zu positionieren, dass die Blaseoben, wird die Harnröhre nach unten gerichtet, und die Samenbläschen sind auf beiden Seiten der Harnblase angeordnet.
13. Fassen Sie die Harnröhre mit einer Zange und ziehen Sie sie vorsichtig Fett weg mit den anderen Zange, ohne Prostatagewebe Abreißen. Hinweis: Fat "glänzend" in Bezug auf das umgebende Gewebe erscheint.
14. Sobald das Fett entfernt worden ist, Pinzette das Bindegewebe zwischen den beiden ventralen Lappen der Prostata und trennen sie zu zerreißen.
15. Um einen der Bauchlappen entfernen, verwenden Sie eine Zange zum Greifen eines einzigen Bauchlappen in der Nähe der Spitze, und verwenden Sie die andere Zange zu greifen, daß Lappen an der Basis so nah an der Harnröhre wie möglich. Während noch die Basis des Lappens Greif, verwenden Sie die andere Zange die Harnröhre zu greifen. Ziehen Sie den Lappen weg von der Harnröhre mit einer festen, glatten Bewegung. Achten Sie darauf, kein Prostatagewebe bleibt an der Harnröhre befestigt. Platzieren Sie den Lappen in dem geeigneten Medium, in Abhängigkeit von der nächsten Versuchsstufe.
    1. Um dies zu beheben und in Paraffin eingebettet werden, die sausreichend für die histologische Analyse, setzen Sie den Lappen in 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF) ^8.
    2. Platzieren Sie den Lappen in Gefriermedium, wie OAT für die Kryokonservierung und sectioning ^8.
    3. Platzieren Sie den Lappen in kaltem PBS für Einzelzellisolierung für Kultur oder Durchflusszytometrie ^9.
16. Wiederholen Sie Schritt 1.15 mit der anderen Bauchlappen.
17. Um einen der Vorderlappen zu entfernen, verwenden Pinzette vorsichtig auf die Lappen ziehen weg von der Samenblase, so dass Sie sicher, dass nicht die Samenblase zu durchstechen. Sobald der Lappen unabhängig von der Samenblase, entfernen Sie sie in der gleichen Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15.
18. Wiederholen Sie Schritt 1.17 mit dem anderen Vorderlappen.
19. Klappen Sie den restlichen Urogenitaltrakt über, so dass die Rücken Prostata sichtbar ist.
20. Um einen der dorsolateralen Lappen entfernen, Zangen verwenden das Bindegewebe zwischen den beiden dorsolateralen Lappen und auch das Bindegewebe zwischen den Lappen und t zu reißener posterioren Bereich der Samenblasen. Entfernen Sie die Lappen in ähnlicher Weise wie die Bauchlappen in Schritt 1.15.
21. Wiederholen Sie Schritt 1.20 mit dem anderen dorsolateralen Lappens.

2. Chirurgische Kastration

Hinweis: Dies ist ein Überleben der Operation, so asepsis, Anästhesie und Schmerztherapie sind wichtig, um die ethischen und erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls. Folgen Sie alle institutionellen Tierpflege und Richtlinien zur Verwendung. Eine externe Wärmequelle, wie beispielsweise einem rezirkulierenden Wasserdecke, während des chirurgischen Eingriffs Hypothermie zu verhindern. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. Autoklav alle chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch in der Chirurgie.

1. Auf einem sauberen, sterilen Oberfläche der Maus durch geeignete Maßnahmen (zB 2% inhaliert Isofluran) betäuben und die Position mOuse in Rückenlage. Hinweis: Alternative Anästhesieverfahren, wie Ketamin, kann auch verwendet werden, abhängig von dem zugelassenen Tier Protokoll.
2. Überprüfen Sie die Reflexe der Maus durch die Zehen einklemmen. Wenn die Maus nicht reagiert, gehen Sie zum nächsten Schritt. Wenn es nicht reagiert, warten 1-3 min und erneut prüfen. Rasieren Sie den OP-Bereich mit einem elektrischen Rasierer.
3. Aseptisch bereiten den Bauch der Maus durch die institutionellen Tierärzten oder IACUC empfohlen scheuert von 70% Ethanol und Jod oder Verfahren anwenden abwechseln.
4. Mit einem sterilen Skalpell, machen Sie eine 1 cm vertikalen Schnitt durch die Haut in der Mittellinie der Unterbauch, ca. 1,5 cm vor den Penis.
5. Machen Sie einen kleinen Schnitt (<1 cm) durch das Peritoneum, vorsichtig keine Organe zu schneiden.
6. Mit einer sterilen Pinzette, greifen die Schnittkante des Peritoneum und heben Sie sie vorsichtig nach oben so in der Lage sein, unter die Bauchhöhle zu sehen.
7. Unter Verwendung eines anderen sterilen Zange greifen in the Peritonealhöhle und Griff entweder die linke oder rechte Hodenfettpolster, lateral in die Blase. Ziehen Sie die Fettpolster durch die Öffnung in das Peritoneum und die Haut, bis die Hoden als auch herauskommt. Seien Sie nicht vorsichtig alle anderen Geweben oder Organen bei diesem Schritt zu verletzen.
8. Mit einem Kauter Stift, schneiden durch die Fettpolster, die die Hoden hält. Schneiden Sie langsam durch die Hodenarterie mit dem Kauter Stift Hinweis: Wenn die Hodenarterie zu schnell geschnitten wird, kann es zu viel Blutungen und die Maus kann eingeschläfert werden.
9. Sobald die Fettpolster und Arterie geschnitten werden, entfernen Sie den Hoden und Fettpolster.
10. Wiederholen Sie die Schritte 2,6-2,9 mit dem anderen Hoden. Hinweis: Ein alternatives Verfahren zur Entfernung der Hoden ligieren die Hodenarterie operativ ist, worauf das Schiff mit einer Schere schneiden.
11. Vernähen das Peritoneum mit resorbierbaren Naht verschlossen.
12. Staple die Haut geschlossen mit chirurgischen Wundklammern.
13. Verwalten Sie eine analgetische Schmerzen zu verwalten, und Platzdie Maus in einem sauberen Käfig auf einem Käfig Wärmer für 5-10 min. Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Schmerzen oder Blutungen.

Ergebnisse

Alle sechs Prostatalappen wurden aus einer Maus über Prostata Mikrodissektion (Abbildung 1) entfernt wird . Der komplette Urogenitaltrakt (UGT) aus allen Prostatalappen besteht, die Harnblase, Samenbläschen und der Harnröhre (Abbildung 1a). Die Samenleiter wird an der Harnröhre, ist aber für Prostata - Mikrodissektion unnötig, und somit vor dem Entfernen des UGT gelöst werden kann durch die Harnröhre (1b-1c) zu schneiden. Der Uro...

Diskussion

Prostate Mikrodissektion ermöglicht lappen spezifische Experimente und die Analyse der Maus Prostata (Abbildung 1). In gentechnisch veränderten Maus-Modellen, in einem Lappen kann Phänotypen gesehen, die nicht in anderen gesehen wird. Auch für die histologische Analyse, versichert dieses Protokoll, dass die maximale Menge an reinem Prostatagewebe kann, ohne andere Urogenitaltrakt Gewebe in dem Abschnitt geschnitten und gefärbt werden. Schließlich ist für Single-Cell-Experimente ermöglicht dieses...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265