Murine הערמונית מיקרו לנתיחה סירוס כירורגי

Summary

כתב יד זה מתאר את פרוטוקולי ערמונית מייקרו לנתיחה וסירוס כירורגית עכבר המעבדה. כמו כן, אנו מתארים תוצאות נציג המיוצר על ידי הפרוטוקולים הללו. לבסוף, אנו דנים ביתרונות וסילוק הפרוטוקולים הללו.

Abstract

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Introduction

הערמונית היא האתר השכיח ביותר של סרטן אצל גברים בארה"ב. כמעט 220,000 גברים מדי שנה תאובחן עם סרטן הערמונית, וכ -27,000 גברים יחלו במחלה שלהם ^1. לגברים יש סיכון 1 ב -7 שלמים של אבחנה של סרטן הערמונית בארה"ב ^1. היפרפלזיה הערמונית (BPH), הגדלה סרטני כתוצאה מהזדקנות של הערמונית, הוא גם מצב נפוץ, המשפיע יותר מ -80% מהגברים מעל גיל 80 ^2. ככזה, הערמונית היא מוקד למחקר רב.

מודלים עכבר כבר בשימוש נרחב כדי לחקור מחלות של הערמונית ^3. בסך הכל, ערמונית העכבר הוא נציג מעולה של בלוטת האדם ^4, אבל יש קווי דמיון ושוני בין העכבר ואנטומיה ערמונית אדם והפיסיולוגיה ^5. בשני המינים, הערמונית ממוקמת בבסיס שלפוחית ​​השתן, המקיפה את השופכה. בלוטת הערמונית האנושית היא lo יחידלהיות, התפצל לארבעה אזורים: stroma fibromuscular, היקפי מרכזי, מעבר, ואת הקדמי. לעומת זאת, ערמונית העכבר מורכבת משלוש אונות לזווג בנקודות שונות סביב השופכה: קדמי, גחון, ואת דורסולטרלי. ברמה התאית, ההבדל העיקרי הוא כי התאים הבזליים יחס תא לומינל ב האדם הוא כ 1: 1, אבל זה 1: 4 בעכברים ^6. את stroma בעכברים הוא גם שונה בעכברים ביחס לבני אדם - יש בני אדם נרחב יותר שריר חלק, בעוד שכבת השריר היא הרבה מדלל ערמונית בעכברים. זיהוי הנכון, לנתיחה, והטיפול של ערמונית העכבר חיוני מחקר ערמונית עכבר.

רמות הורמון דרסטי להשפיע על התפתחות הומאוסטזיס של בלוטת הערמונית בשני בני אדם ועכברים. בעוד אסטרוגן נראה לשחק תפקיד ערמונית פיתוח ^7, ההורמון החשוב ביותר הערמונית הוא טסטוסטרון. טסטוסטרון הוא חיוני עבור פיתוח בלוטותתחזוקת ד. בעקבות או סירוס פיזי או כימי, כ 90% מכלל התאים לומינל ב apoptose הערמונית המבוגרת, ואת הבלוטה מתכווצים. אם טסטוסטרון הוא מחדש ליחיד בתנאי סירוס, הערמונית היא מסוגלת לחדש את עצמו עד אפס מקום מלא. טסטוסטרון גם נראה לנהוג סרטן ערמונית, ולכן טיפול להפחתת אנדרוגן הוא אסטרטגיה טיפולית נפוצה. עם זאת, סרטן הערמונית רב פתח עמידים להפחתה אנדרוגן. בנוסף, גברים שעברו טיפול להפחתת אנדרוגן לטיפול בסרטן הערמונית לעבור מחזורים של תנאים סורסו מחדש. בשנת העכבר, סירוס כירורגי, יחד עם התחדשות הורמונלית של הערמונית על ידי reintroducing טסטוסטרון, הוא כלי חשוב שבה ללמוד התנגדות סירוס ואת ההשפעות של אופניים טסטוסטרון על הערמונית.

במאמר זה, נדונו ולהדגים את השיטות הנכונות שבאמצעותו locatדואר ומיקרו לנתח ערמונית העכבר, כמו גם כמנתח לסרס עכבר.

Protocol

פרוטוקול זה תואם והוא פועל בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת ג'ונס הופקינס ועדת שימוש.

1. מיקרו לנתח עכבר הערמונית

1. להרדים את העכבר על ידי מחנק פחמן דו חמצני או שיטה שאושרה חלופית בהתאם להנחיות לטיפול ולשימוש חיה מוסדיות.
2. הצמד את העכבר במצב שכיבה על קרש החיתוך על ידי הצבת סיכה דרך כל אחד מארבעת הכפות.
3. רסס את הבטן עם אתנול 70%.
4. מתח את העור של הבטן התחתונה עם מלקחיים, ולהשתמש מספריים לחתוך את העור הצפק כ 1 סנטימטר קדמי פתיחת הפין, לא זהירה לחתוך כל איברים.
5. לחתוך את העור הצפק מן הבטן התחתונה, את שני הצדדים של הבטן אל כלוב הצלעות, חושף חלל הצפק.
6. זהה את שלפוחית ​​השתן בדרכי השתן ואברי המין, ולחשוף אותם על ידי הזזת איברים שומן בעדינות אחרים הצידה.
7. Usiמלקחי ng, לאחוז את זרע הזרע בבסיס ליד השופכה, ולקרוע אותו.
8. חזור עם זרע זרע ההפך.
9. בעזרת מלקחיים, בזהירות אחיזה שלפוחית ​​השתן למשוך אותו למעלה, תוך שימוש במספריים זמנית לחתוך דרך השופכה מתחת לשלפוחית ​​השתן והערמונית הגחון (כ 1 ס"מ מתחת לבסיס של שלפוחית ​​השתן).
   הערה: כפי השלפוחית ​​עצרה, בדרכי השתן ואברי המין כולו (שלפוחית ​​המכילה, קטע של השופכה, כל האונות הערמונית, שלפוחית ​​הזרע) יגיע עם זה. ייתכנו כמה התנגדות.
10. מניחים את מערכת ואברי המין (UGT) לתוך צלחת 60-100 מ"מ פטרי המכילה כ מלוחים 5-10 מ"ל פוספט שנאגרו (PBS).
11. בצע את החלק הנותר של הפרוטוקול תחת מיקרוסקופ לנתיחה. השתמש בשני מלקחיים בסדר, אחד בכל יד. החזק מלקחיים "כמו עיפרון" ולנוח אמות הידיים על גבי ספסל כדי לייצב אותן.
12. שימוש במלקחיים בסדר למקם את UGT כך השלפוחיתעל גבי, השופכה הוא הצביע למטה, ואת שלפוחית ​​הזרע ממוקמת משני צדי השלפוחית.
13. גריפ השופכה עם מלקחיים ובזהירות למשוך משם שומן עם המלקחיים האחרים מבלי לקרוע את כל רקמת ערמונית. הערה: השומן יופיע קרוב "מבריקים" אל הרקמה שמסביב.
14. לאחר שומן מוסר, להשתמש במלקחיים כדי לקרוע את רקמת חיבור בין שתי אונות הגחון של הערמונית ולהפריד אותם.
15. כדי להסיר אחת אונות הגחון, השתמש באחת מלקחי אחיזת אונת גחון אחת ליד הקצה, ולהשתמש המלקחיים האחרים לאחוז שאונה בבסיס קרוב השופכה ככל האפשר. ועדיין לופת את הבסיס של האונה, להשתמש במלקחיים אחרים לאחוז את השופכה. משוך את האונה מן השופכה עם חברה, תנועה חלקה. ודא שאין רקמות הערמונית נשארת מחוברת השופכה. מניחים את האונה לתוך המדיום המתאים, בהתאם לשלב הניסוי הבא.
    1. כדי לתקן פרפין להטביע את היםמספיק לניתוח היסטולוגית, למקם את האונה ב 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו (NBF) ^8.
    2. מניחים את האונה מקפיא בינוני, כגון אוקטובר, עבור cryopreservation ו חתך ^8.
    3. מניחים את האונה ב PBS קר בידוד תא יחיד לתרבות או cytometry זרימה ^9.
16. חזור על שלב 1.15 עם אונת הגחון האחרת.
17. כדי להסיר אחת האונות הקדמיות, להשתמש במלקחיים כדי למשוך את האונה בעדינות מן שלפוחית ​​הזרע, כדי לוודא שלא לנקב את שלפוחית ​​הזרע. לאחר באונה היא עצמאית של שלפוחית ​​הזרע, להסיר אותו באותה צורה כמו האונה הגחון בשלב 1.15.
18. חזור על שלב 1.17 עם האונה הקדמית האחרת.
19. תהפוך בדרכי השתן ואברי המין הנותר לאורך כך ערמונית הגב גלויה.
20. כדי להסיר אחת האונות דורסולטרלי, להשתמש במלקחיים כדי לקרוע את רקמת החיבור בין שתי האונות דורסולטרלי וגם רקמת החיבור בין האונות tהוא אחורי באזור של שלפוחית ​​הזרע. הסר את האונה באופן דומה כמו אונת הגחון בשלב 1.15.
21. חזור על שלב 1.20 עם האונה דורסולטרלי האחרת.

2. סירוס כירורגי

הערה: זהו ניתוח הישרדות, כך asepsis, הרדמה, וניהול כאב חשוב להשלמה האתית המוצלחת של פרוטוקול זה. מלאו אחר כל הנחיות לטיפול ולשימוש חיה המוסדיות. השתמש במקור חום חיצוני, כגון שמיכת מים הסירקולציה מחודשת, במהלך ההליך הכירורגי כדי למנוע היפותרמיה. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד התאושש לחלוטין. חיטוי את כל מכשירי הניתוח לפני השימוש בניתוח.

1. על משטח נקי, סטרילי להרדים את העכבר באמצעות אמצעים מתאימים (למשל 2% isoflurane בשאיפה) ומקם את מ 'Ouse בעמדה פרקדן. הערה: שיטות הרדמה חלופיות, כגון קטמין, עשויות לשמש גם, בהתאם לפרוטוקול שאושר החיה.
2. בדוק את הרפלקסים של העכבר על ידי צובט את הבהונות. אם העכבר אינו מגיב, המשך לשלב הבא. אם זה מגיב, לחכות 1-3 דקות ולבדוק שוב. לגלח את אזור הניתוח עם סכין גילוח חשמלי.
3. בסביבה נקיה מחיידקים, להכין את הבטן של העכבר באמצעות סקראבס לסירוגין של 70% אתנול ו יוד או נהלים מומלצים על ידי צוות הווטרינרים המוסדי או IACUC.
4. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך אנכי 1 ס"מ דרך העור קו האמצע של הבטן התחתונה, כ -1.5 ס"מ קדמית הפין.
5. לעשות חתך קטן (<1 ס"מ) דרך הצפק, נזהרים שלא לחתוך כל האיברים.
6. בעזרת מלקחיים סטריליות, אחיזה קצה חתך של הצפק והרם אותו בעדינות כדי להיות מסוגל לראות את חלל הצפק מתחת.
7. שימוש אחר מלקחיים סטריליות, להגיע אל הדואר הצפק חלל אחיזה או כרית שמאלה או ימינה שומן האשכים, לרוחב לשלפוחית ​​השתן. משוך את כרית השומן דרך הפתח הצפק והעור עד testis יוצא גם כן. היזהר שלא לפגוע בכל רקמות אחרות או איברים במהלך שלב זה.
8. באמצעות עט כווייה, בקע את כרית השומן כי הוא מחזיק לאשכים. חותך לאט דרך עורק האשכים עם ההערה עט כווייה: אם עורק האשכים הוא חתך מהר מדי, ייתכנו מדי דימום והעכבר עשוי להיות מורדם.
9. לאחר פנקס העורק שומן נחתכים, להסיר את כרית testis ושומן.
10. חזור על שלבי 2.6-2.9 עם האשך האחר. הערה: שיטה חלופית להסרת האשכים היא בניתוח ולקשור את העורק האשכים, ואחריו חיתוך כלי במספריים.
11. לתפור את הצפק סגור עם תפר נספג.
12. העור סיכות סגור עם קליפים הפצע כירורגית.
13. נהל משכך כאבים לטיפול בכאב, ומקוםהעכבר בכלוב נקי על כלוב חם למשך 5-10 דקות. צג את העכבר על סימנים של כאב או דימום.

תוצאות

כל שש אונות הערמונית הוסרו בעכבר באמצעות ערמונית מייקרו לנתיחה (איור 1). בדרכי השתן ואברי המין המלא (UGT) מורכב מכל האונות הערמונית, שלפוחית ​​השתן, שלפוחית ​​הזרע, ואת השופכה (איור 1 א). זרע הזרע מצרף את השופכה, אבל הוא מיותר עבור לנת?...

Discussion

ערמונית דיסקציה מיקרו מאפשרת לניסויים ספציפיים באונה וניתוח של ערמונית העכבר (איור 1). במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, פנוטיפים ניתן לראות אונה אחת כי לא ראיתי אצל אחרים. כמו כן, לניתוח היסטולוגית, פרוטוקול זה מבטיח כי הסכום המקסימאלי של רקמת ערמונית טהורה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265