Мышиные простаты Micro-рассечение и хирургическая кастрация

Резюме

Эта рукопись описывает протоколы для простаты микро-рассечение и хирургической кастрации в лабораторной мыши. Мы также изображают репрезентативные результаты, полученные этими протоколами. Наконец, мы обсудим преимущества и использование этих протоколов.

Аннотация

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Введение

Простаты является наиболее распространенным местом рака у мужчин в США. Почти 220 000 человек каждый год будут диагностированы с раком простаты, и приблизительно 27 000 человек будет поддаваться их болезни ^1. Мужчины имеют 1 в 7 пожизненный риск диагноза рака простаты в США ^1. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ), возрастная нераковые увеличение предстательной железы, также широко распространенное заболевание, затрагивающей более 80% мужчин старше 80 лет ^2. Таким образом , простата находится в центре внимания многочисленных исследований.

Мышиные модели широко используются для изучения заболеваний предстательной железы ^3. В целом, простата мыши является отличным представителем человеческой железы ^4, но существуют сходства и различия между мышью и анатомии простаты и физиологии человека ^5. У обоих видов, простата расположена у основания мочевого пузыря, окружающих мочеиспускательный канал. Человеческой предстательной железы является одной лобыть разделена на четыре зоны: центральная, перехода, периферической и передней фиброзно-мышечной стромы. В отличие от этого, простата мыши состоит из трех парных лопастей расположены на разных позициях вокруг мочеиспускательного канала: переднюю, вентральной и дорсолатеральной. На клеточном уровне, основное отличие состоит в том , что базальных клеток к просвету соотношение клеток у человека составляет приблизительно 1: 1, но это 1: 4 у мышей ^6. Мышиный стромы также различна у мышей по отношению к человеку - у людей есть более обширные гладкие мышцы, в то время как мышечный слой гораздо тоньше, в мышиной простаты. Надлежащую идентификацию, рассечение, и обработка простаты мыши имеют важное значение для исследования мыши простаты.

Уровни гормонов существенно влияют на развитие и гомеостаз предстательной железы у людей и мышей. В то время как эстроген - видимому, играет роль в развитии простаты ^7, наиболее важный гормон в предстательной железе тестостерон. Тестостерон имеет важное значение для развития железистой А.Н.d техническое обслуживание. После физических или химической кастрации, примерно 90% от полостной клеток в Apoptose взрослого простаты, и железа сжимается. Если тестостерон повторно вводят человека в условиях кастрации, простата способна самовосстанавливаться на полную мощность. Тестостерон также кажется водить рак простаты, поэтому андрогенов терапия является широко используемым терапевтической стратегией. Тем не менее, многие случаи рака простаты становятся устойчивыми к андрогенной депривации. Кроме того, люди, подвергающиеся андрогенов терапии для лечения рака предстательной железы подвергаются циклы кастрированных и регенерированных условий. У мышей, хирургическая кастрация, наряду с гормональной регенерации простаты путем восстановления тестостерона, является важным инструментом для изучения сопротивления кастрации и влияние велосипедного тестостерона на простату.

В этой статье мы будем обсуждать и демонстрировать правильные методы, с помощью которых к Locatе и микро-рассекают простаты мыши, а также хирургическим путем кастрировать мыши.

протокол

Этот протокол отвечает и соответствует руководящим принципам, установленным в Институциональная уходу и использованию животных комитета Университета Джона Хопкинса по.

1. Микро-рассечение Мышь простаты

1. Эвтаназии мышь асфиксией диоксидом углерода или альтернативным способом, утвержденным в соответствии с руководствами институциональными уходу и использованию животных.
2. Закрепление мышь в положении лежа на спине на рассечение борту, поставив штифт через каждую из четырех лап.
3. Спрей живота с 70% этанола.
4. Держите кожу нижней части живота с пинцетом и использовать ножницы, чтобы вырезать через кожу и брюшину приблизительно 1 см кпереди от отверстия пениса, стараясь не резать любые органы.
5. Срежьте кожу и брюшину от нижней части живота, что на обеих сторонах живота к грудной клетке, выставляя в брюшную полость.
6. Определение мочевого пузыря и мочеполового тракта, и подвергать их, осторожно двигая жир и другие органы в сторону.
7. Usiнг пинцеты, сцепление семяпровода у основания вблизи мочеиспускательного канала, и оторвать ее.
8. Повторите с противоположным проток семявыносящих.
9. Использование щипцов, тщательно хватку мочевой пузырь и потяните его вверх, в то время как одновременно, используя ножницы, чтобы вырезать через мочеиспускательный канал ниже мочевого пузыря и брюшной предстательной железы (примерно на 1 см ниже основания мочевого пузыря).
   Примечание: По мере того как мочевой пузырь вытягивается вверх, весь мочеполового тракта (содержащий мочевой пузырь, участок уретры, все долек предстательной железы и семенных пузырьках) придет с ним. Там может быть некоторое сопротивление.
10. Поместите урогенитального тракта (UGT) в 60-100 мм чашки Петри, содержащие приблизительно 5-10 мл фосфатно-солевой буфер (PBS).
11. Выполните оставшуюся часть протокола под микроскопом рассечение. Используйте два тонких щипцов, по одному в каждой руке. Удерживая пинцет ", как карандаш" и отдохнуть предплечья на скамье так, чтобы стабилизировать их.
12. Используйте тонкий пинцет, чтобы позиционировать ВСТ таким образом, что мочевой пузырьсверху, мочеиспускательный канал направлен вниз, и семенные пузырьки расположены по обе стороны от мочевого пузыря.
13. Возьмитесь за уретра с одним пинцетом и осторожно отодвинуться жир с другими щипцами без отторжения любой ткани простаты. Примечание: Жир появится "блестящий" по отношению к окружающей ткани.
14. После того, как жир удаляется, используйте пинцет, чтобы разорвать соединительной ткани между двумя брюшных долей простаты и разделить их.
15. Для удаления одного из вентральных лопастей, используют один пинцет для захвата одного вентральной мочку вблизи вершины, а также использовать другие пинцет для захвата, что лопасть у основания как можно ближе к уретре, насколько это возможно. В то время как все еще сжимая основание лепестка, используйте другие щипцов для захвата мочеиспускательного канала. Потяните лопасть от уретры с твердым, плавным движением. Убедитесь, что никакие ткани простаты не остается прикрепленной к уретре. Поместите лопасть в соответствующую среду, в зависимости от следующего экспериментального этапа.
    1. Для того, чтобы исправить и парафино-встраивать Sдостаточно для гистологического анализа, поместите лопасть в 10% нейтральном буферном формалине (НСБ) ^8.
    2. Поместите лопасть в морозную среду, такую ​​как ОКТ, для криоконсервации и секционирования ^8.
    3. Поместите лопасть в холодной PBS для выделения отдельных клеток для культивирования или проточной цитометрии ^9.
16. Повторите шаг 1.15 с другой вентральной доли.
17. Для удаления одного из передних лепестков, используйте пинцет, чтобы осторожно потяните мочку подальше от семенных пузырьках, убедившись в том, чтобы не проколоть семенных пузырьках. После того, как лопасть не зависит от семенных пузырьках, удалите его таким же образом, как брюшной доли на этапе 1.15.
18. Повторите шаг 1,17 с другой передней доли.
19. Флип оставшиеся урогенитальный тракт над таким образом, что спинной железы видна.
20. Чтобы удалить одну из дорсолатеральных лепестков, используйте пинцет, чтобы разорвать соединительной ткани между двумя дорсолатеральных долей, а также соединительной ткани между роторами и тон задней области семенных пузырьков. Удалить мочку аналогичным образом, как брюшной доли на этапе 1.15.
21. Повторите шаг 1.20 с другой дорсолатеральной доли.

2. Хирургическая кастрация

Примечание: Это операция выживания, поэтому асептики, анестезии и лечения боли имеют важное значение для этического и успешного завершения этого протокола. Следуйте всем рекомендациям институциональных уходу и использованию животных. Используйте внешний источник тепла, например, циркулирующей воды одеяло, во время хирургической процедуры, чтобы предотвратить переохлаждение. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел. Автоклав все хирургические инструменты перед использованием в хирургии.

1. На чистой стерильной поверхности анестезию мыши с помощью соответствующих мер (например , 2% вдыхании изофлуран) и поместите мУз в положении лежа на спине. Примечание: Альтернативные методы анестезии, такие как кетамин, также могут быть использованы в зависимости от утвержденного протокола животного.
2. Проверить рефлексы мыши, зажимая пальцами. Если мышь не реагирует, переходите к следующему шагу. Если это не реагирует, подождите 1-3 мин и снова проверьте. Бритье хирургическую область с электрической бритвы.
3. Консерванта подготовить живот мыши с помощью чередующихся скрабы из 70% этанола и йода или процедур, рекомендованных институциональном ветеринарных работников или IACUC.
4. Используя стерильный скальпель, сделайте 1 см вертикальный разрез через кожу в средней линии нижней части живота, примерно 1,5 см впереди полового члена.
5. Сделайте небольшой надрез (<1 см) через брюшину, стараясь не резать любые органы.
6. Использование стерильного пинцета, захватывают обрезанный край брюшины и поднимите ее осторожно, чтобы быть в состоянии видеть в брюшную полость под ним.
7. С помощью другого стерильного пинцета, достигают в тысе брюшной полости и захват левой или правой тестикул жировой ткани, сбоку от мочевого пузыря. Вытяните жировой ткани через отверстие в брюшине и коже, пока яичко не выходит, а также. Будьте осторожны, чтобы не повредить какие-либо другие ткани или органы во время этого шага.
8. Используя прижиганием ручку, прорезать жировое, который держит яичко. Медленно Прорубленный тестикулярной артерии с прижигания пера Примечание: Если тестикулярной артерии вырезают слишком быстро, может быть слишком много кровотечение и мышь, возможно, придется быть умерщвлены.
9. После того, как жировой ткани и артерии вырезают, удалите семенников и жировой ткани.
10. Повторите шаги 2.6-2.9 с другими семенника. Примечание: альтернативный способ удаления семенников к хирургическим путем лигирования тестикулярной артерии, с последующим разрезанием на судно с помощью ножниц.
11. Ушивания брюшины закрыта с рассасывающиеся швом.
12. Скоба кожа закрыта с хирургической раны клипов.
13. Администрирование обезболивающее, чтобы управлять болью, и местомышь в чистой клетке на клетке теплее в течение 5-10 мин. Монитор мыши на наличие признаков боли или кровотечения.

Результаты

Все шесть лепестков простаты были удалены из мыши через простаты микро-рассечение (рисунок 1). Полный мочеполового тракта (ВСТ) состоит из всех долей простаты, мочевого пузыря, семенные пузырьки и мочеиспускательный канал (рис 1а). Семяпровода прикреп?...

Обсуждение

Простата микро-рассечение позволяет лепестка конкретных экспериментов и анализа предстательной железы мыши (рисунок 1). В генетически сконструированных моделях мышей, фенотипы можно видеть в одной доле, не видели в других. Кроме того, для гистологического анализа, этот проток...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265