Mürin Prostat Mikro-diseksiyon ve Cerrahi Kastrasyon

Özet

Bu el yazması laboratuvar fare prostat mikro diseksiyon ve cerrahi kastrasyon için protokolleri açıklar. Biz de bu protokoller tarafından üretilen temsilcisi sonuçları tasvir. Son olarak, biz avantaj ve bu protokollerin kullanımını tartışmak.

Özet

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has been used as a surrogate for discoveries in human prostate development and disease. Prostate micro-dissection allows consistent study of lobe-specific prostate anatomy, histology, and cellular characteristics in the absence of contamination of other tissues. Testosterone affects prostate development and disease. Androgen deprivation therapy is a common treatment for prostate cancer patients, but many prostate tumors become castration-resistant. Surgical castration of mouse models allows for the study of castration resistance and other facets of hormonal biology on the prostate. This procedure can be coupled with testosterone reintroduction, or hormonal regeneration of the prostate, a powerful method to study stem cell lineages in the prostate. Together, prostate micro-dissection and surgical castration opens up a multitude of opportunities for robust and consistent research of prostate development and disease. This manuscript describes the protocols for prostate micro-dissection and surgical castration in the laboratory mouse.

Giriş

Prostat ABD'de erkeklerde en sık görülen kanser sitedir. Her yıl prostat kanseri tanısı olacak yaklaşık 220.000 erkek ve yaklaşık 27.000 erkeklerin hastalığa ¹ yenik düşer. Erkekler ABD ¹ bir prostat kanseri tanısı 1 7 ömür boyu riski vardır. İyi huylu prostat hiperplazisi (BPH), prostat yaşla ilgili bir noncancerous genişleme, 80 ² üzerindeki erkeklerin% 80 üzerinde etkileyen, aynı zamanda yaygın bir durumdur. Bu nedenle, prostat önemli araştırmaların odak noktasıdır.

Fare model prostat ³ hastalıklar çalışma yaygın olarak kullanılmaktadır. Genel olarak, fare prostat insan bezinin ⁴ mükemmel bir temsilcisidir, fakat benzerlikler ve fare ve insan prostat anatomisi ve fizyolojisi ⁵ arasında farklar vardır. Her iki türde de, prostat üretra çevresindeki, mesane tabanında yer almaktadır. insan prostat bezi, tek bir lomerkezi, geçiş, periferik ve ön fibromusküler stroma: dört bölgeye ayrılmıştır olmak. anterior, ventral ve dorsolateral: aksine, fare prostat üretra etrafında farklı pozisyonlarda üç eşli lob oluşmaktadır. Hücresel seviyede, temel fark insan lümen hücre oranı bazal hücreli 1 olmasıdır: 1, fakat 1: Farelerde ⁶ 4. fare stroma da insanlara göre farelerde farklı - kas tabakası fare prostat daha incedir iken insanlar, daha kapsamlı düz kas vardır. Fare prostat uygun bir şekilde tanımlanması, diseksiyon ve taşıma fare prostat araştırma için gereklidir.

Hormon düzeyleri ölçüde hem insanlarda hem farelerde prostat bezinin gelişim ve homeostazis etkiler. Östrojen prostat gelişiminde ^7'de bir rol oynadığı gibi görünüyor olsa da, prostat en önemli hormonu testosteron olduğunu. Testosteron glandüler gelişimin için gereklidird bakım. ya fiziksel ya da kimyasal hadım etme sonra, yaklaşık 90 yetişkin prostat apoptoz luminal hücrelerin% ve bez küçülür. Testosteron hadım etme koşulları altında bir bireye yeniden ortaya çıkar, prostat tam kapasite kendini yeniden edebilmektedir. Testosteron ayrıca androjen baskılayıcı tedavi yaygın olarak kullanılan tedavi stratejisi neden olan prostat kanseri, sürücü görünüyor. Ancak, birçok prostat kanseri androjen yoksunluğu dayanıklı hale gelir. Buna ek olarak, prostat kanserinin tedavisi için androjen blokaj tedavisi gören hastalarda hadım edildi ve yeniden koşulları çevrimi geçirmektedir. Fare, cerrahi kastrasyon, testosteron yeniden devreye sokarak prostatın hormonal rejenerasyon ile birlikte, kastrasyon direnci ve prostat üzerinde testosteron bisiklet etkilerini incelemek amacıyla hangi ile önemli bir araçtır.

Bu yazıda tartışmak ve locat tarafından uygun teknikleri gösterecektirE ve mikro-tahlil fare prostat, hem de fare hadım cerrahi olarak.

Protokol

Bu protokol karşılar ve Johns Hopkins Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara uyar.

1. Fare Prostat Mikro diseksiyon

1. Karbondioksit boğulma ya da kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun bir alternatif onaylı yöntemle fare Euthanize.
2. Dört bacak her aracılığıyla bir iğne koyarak bir diseksiyon kurulu bir yatar pozisyonda fare sabitleyin.
3. % 70 etanol ile karın püskürtün.
4. forseps ile alt karın cildi tutun ve deri yoluyla kesilmiş ve herhangi bir organ kesmek için dikkatli penis açılması, yaklaşık 1 cm anterior periton için makas kullanın.
5. periton boşluğuna açığa alt karın, göğüs kafesi karın kadar her iki taraftan deri ve periton kesip.
6. mesane ve ürogenital yolu belirlemek ve yavaşça yanına yağ ve diğer organları hareket ettirerek maruz bırakmaktadır.
7. using forseps, kavrama üretra yakın üssünde vas deferens ve uzak gözyaşı.
8. ters vas deferens ile tekrarlayın.
9. Aynı anda mesane ve ventral prostatın (mesane tabanının altında yaklaşık 1 cm) altında üretra yoluyla kesmek için makas kullanırken, dikkatli, mesane kavrama forseps kullanarak ve yukarı doğru çekin.
   Not: Mesane çekti gibi, tüm ürogenital sistem (içeren mesane, üretra, tüm prostat loblar ve seminal vezikül bir bölümü) onunla gelecektir. Bazı direnç olabilir.
10. 5-10 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ihtiva eden bir 60-100 mm Petri kabı içine ürogenital sistem (UGT) koyun.
11. Bir diseksiyon mikroskobu altında protokolün kalan kısmını gerçekleştirin. İki ince forseps, her el birini kullanın. "Bir kalem gibi" forseps tutun ve onları sakinleştirmeye şekilde tezgah üstünde Dirseklerinizi bekletin.
12. Mesane olduğunu UGT gibi konumlandırmak için ince forseps kullanınüzerine, idrar yolu basılı işaret edilmektedir, ve seminal veziküller mesane her iki tarafında konumlandırılmıştır.
13. Kavrama bir forseps ve dikkatle ile üretra herhangi bir prostat dokusunu uzak yırtmadan diğer forseps ile uzak yağ çekin. Not: Yağ çevre dokuya "parlak" göreli görünecektir.
14. yağ çıkarıldıktan sonra, prostat iki ventral lobları arasındaki bağ dokusunu gözyaşı ve onları ayırmak için forseps kullanabilir.
15. Ventral lobları birini kaldırmak ucuna yakın kavrama tek bir ventral lobu bir forseps kullanabilir ve kavrama diğer forseps kullanmak için mümkün olduğunca üretraya yakın üssünde lob. hala lobun tabanını sıkarken, kavrama diğer forseps üretra kullanın. Bir firma, düzgün hareket ile uzak üretradan lob çekin. olmamasına dikkat prostat dokusu üretra bağlı kalır emin olun. Bir sonraki deneysel aşamada bağlı olarak uygun ortama lob yerleştirin.
    1. düzeltmek ve s parafin gömmek içinbol histolojik analiz için% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ⁸ lob yerleştirin.
    2. Dondurulması için, OKT gibi orta, dondurma ve ⁸ kesit içinde lob yerleştirin.
    3. Kültür için tek bir hücre izolasyonu için soğuk PBS lob yerleştirin veya ⁹ akım sitometri.
16. diğer ventral lobu ile adımı yineleyin 1.15.
17. Emin seminal vezikül delmek değil yapım yavaşça seminal vezikül gelen lob çekmek için forseps kullanabilir, ön lob birini kaldırmak için. lob seminal vezikül bağımsız sonra, adım 1.15 ventral lob aynı şekilde çıkarın.
18. diğer ön lob ile adımı yineleyin 1.17.
19. dorsal prostat görünür şekilde üzerinde kalan ürogenital yolu çevirin.
20. İki dorsolateral lob ve ayrıca loblar ve t arasındaki bağ dokusu arasındaki bağ dokusu gözyaşı forseps kullanabilir, dorsolateral lob birini kaldırmak içinO seminal vezikül posterior bölgeye. Adım 1.15 ventral lob olarak benzer bir şekilde lob çıkarın.
21. diğer dorsolateral lob ile adımı yineleyin 1.20.

2. Cerrahi Hadımlaştırma

Not: Bu bir hayatta kalma ameliyat, bu nedenle asepsi, anestezi ve ağrı yönetimi, bu protokolün etik ve başarılı bir şekilde tamamlanması için önemlidir. tüm kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı yönergeleri izleyin. hipotermi önlemek için cerrahi işlem sırasında, böyle bir çevrimli su battaniye gibi harici ısı kaynağı kullanın. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. cerrahide Kullanmadan önce tüm cerrahi aletler otoklav.

1. Temiz, steril bir yüzey üzerinde uygun önlemleri (örneğin% 2 inhale izofluran) kullanarak fare uyutmak ve m konumlandırmakBir yatar pozisyonda ouse. Not: ketamin gibi alternatif anestezi yöntemleri, de kullanılabilir, onaylanmış hayvan protokolüne göre.
2. ayak kısma farenin refleksleri kontrol edin. Fare tepki vermezse, bir sonraki adıma geçin. o tepki vermezse, 1-3 dakika bekleyin ve tekrar kontrol edin. Bir elektrikli tıraş makinesi ile cerrahi alan tıraş.
3. Aseptik kurumsal veteriner personel veya IACUC tarafından önerilen% 70 etanol ve iyot veya prosedürlerin alternatif scrubs kullanarak fare karın hazırlar.
4. Steril bir neşter kullanılarak, penise, alt karın orta hattında yaklaşık 1.5 cm ön deri yoluyla 1 cm dikey bir kesi yapmak.
5. Dikkatli herhangi organları kesmek için değil, periton içinden küçük bir kesi (<1 cm) olun.
6. Steril forseps, kavrama periton kesim kenarı kullanılarak ve altındaki periton boşluğuna görmek mümkün olacak şekilde yavaşça yukarı kaldırın.
7. başka bir steril forseps kullanarak, th içine ulaşmake mesaneye yanal periton boşluğu ve kavrama ya sol ya da sağ testis yağ yastığı. Testis yanı çıkana kadar periton ve deride açıklıktan yağ yastığı çekin. Bu adımı sırasında başka doku veya organ zarar vermemek için dikkatli olun.
8. Bir koter kalemini kullanarak, testis tutan yağ yastığı kesti. koter kalem Not testis arter yoluyla yavaş yavaş Cut: testiküler arter çok hızlı kesilirse, orada çok fazla kanama olabilir ve fare ötenazi gerekebilir.
9. yağ yastığı ve arter kesilir sonra, testis ve yağ yastığı çıkarın.
10. Dier testisli 2,6-2,9 adımları. Not: Testis kaldırılması için alternatif bir yöntem, cerrahi makas ile kap kesme ardından testis arter bağlanması için olan.
11. Periton emilebilir sütür ile kapatılır dikin.
12. Zımba cilt cerrahi yara klipleriyle kapatılmıştır.
13. ağrı yönetmek için bir ağrı kesici yönetme ve yer5-10 dakika sıcak bir kafes temiz bir kafeste fare. ağrı veya kanama belirtileri için fare izleyin.

Sonuçlar

Altı prostat lobları prostat mikro diseksiyon yoluyla bir fare (Şekil 1) çıkarıldı. Tam ürogenital sistem (UGT) tüm prostat loblar, mesane, seminal veziküller ve üretra (Şekil 1a) oluşmaktadır. Vaz deferens üretra verdiği, ancak prostat mikro diseksiyon için gereksizdir ve böylece idrar yolu (Şekil 1b-1c) keserek UGT sökülmeden önce ayrılabilir. Ürogenital sistem birlikte kalacağız kez karın (Şekil 1d)...

Tartışmalar

Prostat mikro diseksiyon lob özel deney ve fare prostat analizi (Şekil 1) sağlar. genetiği değiştirilmiş fare modellerinde, fenotipleri diğerlerinde görülmez bir lobun görülebilir. Ayrıca, histolojik analiz için, bu protokol, saf prostat dokusunun maksimum miktarı bölümünde mevcut olan diğer ürogenital sistem doku olmadan kesitli ve lekeli edilebilir olmasını sağlar. Son olarak, tek hücreli deneyler için, bu protokol hemen hemen saf prostat hücrelerinin izolasyonu sağlar. Epit...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tools	Roboz	Various
Formaldehyde	Sigma	F8775
OCT medium	VWR	25608-930	Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C
PBS	Life Technologies	10010
Isoflurane	Johns Hopkins		Also available from vendors online
Cautery Pen	Medline	ESCT002
Silk suture	AD Surgical	M-S330R19
Surgical Wound Clips	Roboz	RS-9265