التعبير وتنقية جزيئات تشبه الفيروسات للتطعيم

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتجميع جزيئات تشبه الفيروس باستخدام الفيروسة العصوية أو الأنظمة التعبير الثدييات، وتنقية تنبيذ فائق. يستخدم هذا النهج عالية للتخصيص لتحديد المضادات الفيروسية كأهداف لقاح بطريقة آمنة ومرنة.

Abstract

جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) والجسيمات subviral (SVPs) هي مقاربة بديلة لتصميم لقاح فيروسي التي توفر مزايا زيادة السلامة الأحيائية والاستقرار على استخدام مسببات الأمراض الحية. غير المعدية وتجميع الذات، وتستخدم VLPs لتقديم البروتينات الهيكلية كما immunogens، تجاوز الحاجة لمسببات الأمراض حية أو ناقلات فيروسية المؤتلف للتسليم المستضد. في هذه المقالة، ونحن لشرح مراحل مختلفة من التصميم فلب والتنمية للتطبيقات المستقبلية في التجارب على الحيوانات قبل السريرية. ويشمل الإجراء المراحل التالية: مجموعة مختارة من مستضد والتعبير عن مستضد في خط الخلية في الاختيار، وتنقية VLPs / SVPs، وتقدير للمستضد الجرعات. ونحن لشرح استخدام كل من خطوط خلايا الثدييات والحشرات للتعبير عن المستضدات لدينا وإظهار كيف تختلف المنهجيات في العائد. قد يتم تطبيق منهجية عرضها على مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض ويمكن أن يتحقق عن طريق استبدال مولدات المضادات مع شارع مناعةالبروتينات uctural من الكائنات الحية الدقيقة المستخدم من الفائدة. VLPs وSVPs تساعد مع توصيف مستضد واختيار أفضل المرشحين لقاح.

Introduction

جزيئات الفيروسات مثل (VLPs) هي تكنولوجيا معتمدة للتطعيم البشري. في الواقع، بعض اللقاحات المرخصة أكثر معاصرون، بما في ذلك فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) وΒ التهاب الكبد (HepΒ) اللقاحات تستخدم هذا النهج. تتشكل VLPs من البروتينات الهيكلية قادرة على التجميع الذاتي. الجسيمات تجميعها تحاكي الأشكال التضاريسية الفيروسية، ولكن لا يمكن أن تصيب أو تكرار لأنها تفتقر إلى الجينوم الفيروسي. VLPs يمكن التعبير عن وتنقيته من عدد من أنظمة بدائية النواة وحقيقية النواة. كشفت مراجعة للأدبيات التي نظم التعبير المختلفة ويعمل على أساس المعدلات التالية: البكتيريا - 28٪، الخميرة - 20٪، والنبات - 9٪، الحشرات - 28٪، والثدييات - 15٪ ^1. من المذكرة، ويتم إنتاج لقاحات فيروس الورم الحليمي البشري على أساس L1 البروتين قفيصة في الخميرة (جارداسيل) أو في نظام خلية الحشرات (سيرفاريكس) ^2. اللقاحات HepΒ، Recombivax وEngerix-Β، وتنتج أيضا في الخميرة، وتتألف من HepΒ سطح المستضد ³، 4.

نحن نستخدم أنظمة التعبير خلايا الثدييات والحشرات لإنتاج VLPs تتطلب شارك في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة للتجميع. يركز عملنا على تصميم وانتاج، ولقاحات من فلب تنقية ضد مسببات الأمراض البشرية: فيروس الإنفلونزا، الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV)، فيروس حمى الضنك (DENV)، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV). طرقنا مرنة بما يكفي للسماح للمشاركة في التعبير عن البروتينات الهيكلية متعددة من البلازميدات التعبير متعددة، أو التعبير البلازميد واحد (الشكل 1). سابقا، وأنتجنا وتنقيته H5N1 VLPs تجميعها من شارك في التعبير عن البلازميدات ترميز هيماغلوتينين الإنفلونزا (HA)، النورامينيداز (NA)، ومصفوفة (M1) في الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية ^5،6. الجينات وكودون الأمثل للتعبير في خلايا الثدييات والمستنسخة في pTR600، ناقل التعبير حقيقية النواة تحتوي على الفيروس المضخم للخلايا فوري أوائل المروج بالإضافة إلى إنترون ألف لبدء transcription من إدراج حقيقية النواة والأبقار هرمون النمو إشارة تذييل بعديد الأدينيلات لإنهاء النسخ ^7. تم استخدام نهج مماثل باستخدام ثلاث البلازميد شارك في التعبير عن HA، NA (الشكل 1A) والبروتين مصفوفة الفيروسي بديل، فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة P55، لجيل من البشر سلالة الانفلونزا الموسمية H3N2 VLPs في هذه الدراسة، ولقد ثبت لتوليد VLPs مشابهة من حيث الحجم على شكل جسيمات أنفلونزا ^8. على الرغم من أن لقاحات الأنفلونزا تثير في الغالب الأجسام المضادة-HA، إضافة نورامينيداز الإنفلونزا تتوسط النشاط سياليداز لتمكين فلب في مهدها من خلايا transfected ⁹ و أيضا أهدافا مناعة إضافية الحالية. لإنتاج RSV VLPs، اخترنا أيضا جوهر لا علاقة لها من فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة لتصميم اللقاحات نموذجية التي تقدم بروتينات سكرية سطح RSV حصرا لمواصلة إبداء المرونة من تشكيل فلب باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة، كما هو موضح سابقا والتي تتميز المجهر الإلكتروني ^6،10. آخرونوقد أظهرت في وقت سابق ان VLPs تقديم بروتينات سكرية RSV يمكن تجميعها باستخدام مكونات فيروسية مختلفة من فيروس مرض نيوكاسل (نيوكاسل) ^11، ومصفوفة أنفلونزا ^12. واستخدمت كامل طول سطح تسلسل بروتين سكري في هذه الدراسة إلى الإبقاء على التشكل الأصلية التي قد تكون ضرورية لمستقبل وظيفي ملزمة والأجسام المضادة الاعتراف الفحص من خلال الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).

لدينا أمثلة لاستخدام نظم التعبير البلازميد واحدة لتوليد الجسيمات DENV وCHIKV. في حالة DENV، فإننا يمكن أن تنتج جزيئات subviral (SVPs) مع عدم وجود القفيصة في الخلايا 293T من البلازميد واحد يحتوي على PRM / E الجينات الهيكلي التعبير كاسيت ^13. يتم استخدام SVP المصطلح للدلالة على عدم وجود الأساسية أو قفيصة البروتين في تجميع البروتينات الهيكلية الفيروسية. ويمكن أيضا أن تنتج تشيك VLPs استخدام البلازميد واحد يحتوي على CHIKV كاسيت الجين الهيكلي، القفيصة الترميز والمغلف البروتينات، أو في الاولخلايا nsect عن طريق إصابة مع الفيروسة العصوية المؤتلف ترميز نفس كاسيت الجين الهيكلي الأمثل للتعبير عن خلية الحشرات (الشكل 1B - C).

النتيجة النهائية للتعبير النهج التي نوقشت أعلاه هي الافراج عن VLPs إلى مستنبت الخلية التي يمكن بعد ذلك تنقيته عبر تنبيذ فائق من خلال 20٪ وسادة الجلسرين. في هذا التقرير، ونحن نقدم طرق للتعبير عن وتنقية هذه VLPs من أنظمة خلايا الثدييات والحشرات.

Protocol

1. نظام التعبير الثدييات لتوليد الأنفلونزا H3N2 فلب

1. Subclone الفيروسي الهيكلي بروتين هيماغلوتينين (HA)، النورامينيداز (NA)، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) الكمامة P55 في ناقلات التعبير حقيقية النواة، مثل pTR600 سبق وصفها ^7.
2. تضخيم الحمض النووي في القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال، DH5α) وعزل ترنسفكأيشن الصف البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. كمية من الحمض النووي يعتمد على المحصول واحتياجات المستخدم.
3. الحفاظ على خط خلية الثدييات، 293T، في وسائل الإعلام نمو تحتوي على 10٪ مصل الجنين-البقري (FBS) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ في حاضنة مرطب.
4. تنمو الخلايا مثل أن T-150 زراعة الأنسجة قارورة تحتوي على 45-75 × 10 ⁶ خلايا في قارورة بحيث قارورة يحصل الالتزام خلية كاملة و85-95٪ confluency خلية في اليوم التالي. تفقد الخلايا تحت المجهر لconflu المطلوبency.
   ملاحظة: عادة ما ينصح ارتفاع كثافة الخلية لانتاج بروتين تعبير الأمثل مع الحد الأدنى من السمية الخلوية عند استخدام الكواشف ترنسفكأيشن التجارية ولكن الإفراط في confluency قد يؤدي إلى تراكم النفايات الخلوية من المنتجات والحد من بقاء الخلية.
5. يوم ترنسفكأيشن، وإعداد الحويصلية وخليط الحمض النووي حسب توصيات الشركة الصانعة وtransfect خلايا الحمض النووي مع تركيبة الحمض النووي من 1: 1: 2 من HA: NA: الكمامة بلغ إجمالي كمية الحمض النووي من 40 ميكروغرام لكل T-150 قارورة. تمييع حلول الحمض النووي والحويصلية في وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل خالية دون المضادات الحيوية مثل أن كل قارورة تحتوي على إجمالي حجم 20-30 مل.
   ملاحظة: نسبة يبني الجين قد تتطلب التحسين المستخدم. على الرغم من أن لم تظهر هنا، وقد تم تنفيذ إجراء ترنسفكأيشن مماثلة مع الجهاز التنفسي المخلوي فيروس (RSV) F وفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة في نسبة 1: 1. لDENV وCHIKV البلازميدات تعبير واحد، أي ما مجموعه 20 ميكروغرام من الحمض النووي في T-150 قارورة تستخدم له الأمثلxpression. الحمض النووي: ترنسفكأيشن نسب الكاشف هي الاستعمال الأمثل. استخدام أوصى المتوسطة ترنسفكأيشن تعتمد على طريقة ترنسفكأيشن، أي تعداء الدهون polycationic يوصي تخفيض أو عدم وجود مصل بقري الجنين وبالتالي يمكن استكمال وسائل الإعلام مع هرمونات النمو والعناصر النزرة لدعم النمو في غياب المصل.
6. العودة قوارير إلى 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ الحاضنة. لحجم 200 مل، استخدم 9 T-150 قوارير. يتم الاحتفاظ الخلايا في مستنبت ترنسفكأيشن حتى يوم الحصاد فلب.
7. طاف الثقافة الحصاد من الخلايا بعد 72-96 ساعة بعد ترنسفكأيشن اعتمادا على المستضد، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪، حسب تقديرات التفتيش المجهري. نقل طاف في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية.
   ملاحظة: استبدال 3 طاف اليوم مع الطازج قبل تحسنت، وسائل الإعلام ترنسفكأيشن خالية من المصل إلى الخلايا الملتصقة سوف yielدا الكثير الثاني من VLPs مع العائد مماثل أو انخفاض طفيف، وينبغي أن يكون الأمثل من قبل المستخدم.
8. تجمع طاف ومرشح من خلال غشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق.
9. اختبار التراص النشاط من VLPs HA معربا عن طريق معيار فحص التراص ¹⁴ باستخدام 0.8٪ الديك الرومي أو خلايا الدم الحمراء الثدييات أو المضي قدما مع مستضد معين ELISA. انظر الشكل 2 للحصول على نتائج تمثيلية.

2. تشيك فلب التعبير عن طريق نظام الخلايا الفيروسة العصوية / الحشرات

1. توليد الفيروسة العصوية المؤتلف التعبير قفيصة فيروس شيكونغونيا والبروتينات المغلف (C-E3-E2-6K-E1) من S-27 سلالة باستخدام نظام التعبير الفيروسة العصوية التجاري.
2. خلايا Sf9 الثقافة ورق القطن frugiperda في Sf9 متوسط ​​النمو خالية من المصل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل عند 28 درجة مئوية. استخدام 3-5 × 10 ⁵ ج / مل لبدء الثقافات الدوار قارورة لsuspensنمو الخلايا أيون. مرور روتينية عندما تصل كثافة خلية من 2-4 × 10 ⁶ ج / مل (كل 3-4 أيام).
3. خلايا الثقافة Sf9 معلق في قوارير الدوار مع التحريك في 130 دورة في الدقيقة على نظام متعددة النمام لوحة. للتهوية المناسبة، الحفاظ على أحجام الثقافة في أي أكثر من نصف حجم القارورة الدوار.
4. للتعبير عن تشيك VLPs، ويصيب خلايا Sf9 في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 ⁶ خلية / مل مع الفيروسة العصوية المؤتلف في عدد وافر من إصابة 1 والعودة إلى 28 درجة مئوية الحاضنة. عادة، ويصيب واحد أو اثنين من قوارير الدوار، تحتوي على 250 مل خلايا Sf9.
   ملاحظة: في حين أننا لا تستخدم هذا الأسلوب، وخلايا Sf9 قد يكون مثقف في قوارير شاكر عند 28 درجة مئوية باستخدام منصة شاكر.
5. الثقافات الحصاد بعد 72-96 ساعة بعد الإصابة، أو عندما انخفض بقاء الخلية إلى 70-80٪ كما هو محدد من قبل الاستبعاد التريبان الأزرق وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   ملاحظة: تواصل الخلايا على التكاثر حين المصابين وهناكوالجدوى ~ 80٪ في الثقافات Sf9 المصابين المؤتلف الفيروسة العصوية تشيك فلب في 3 أيام بعد العدوى (نقطة في البوصة). الخلايا المصابة الفيروسة العصوية أكبر في المظهر. مورفولوجيا قد تغير أيضا من جولة إلى مستطيل. في أواخر مراحل العدوى الفيروسة العصوية، بدأت الخلايا ليز.
6. الثقافات نقل مباشرة من ثقافة تعليق في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور الخلايا في أسفل 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
7. جمع supernatants وتصفية من خلال الغشاء 0.22 ميكرون المسام قبل الترسيب عبر تنبيذ فائق.

3. الترسيب / تنقية فلب / SVPs

1. تعقيم 25 ملم × 89 ملم مكشوفة أنابيب نابذة مع 70٪ من الإيثانول في مجال السلامة الأحيائية غطاء محرك السيارة. ضمان قد جفت الإيثانول الكهربائي قبل استخدامه.
2. تحميل ما يصل إلى 32 مل من طاف في أنبوب نظيفة. ينصح حجم الحد الأدنى من 25 مل لمنع انهيار وتلف أنابيب نابذة شغل غير الكافية.
3. الأساس الذي تقوم عليه بعناية supernatants خفة دمح معقم 3 مل 20٪ الجلسرين في برنامج تلفزيوني (ت / ت). تأكد من أنابيب متوازنة.
4. تدور في 135000 x ج لمدة 4 ساعات في 4 درجات مئوية.
5. نضح طاف، وضمان بيليه لا طرد من الأنبوب.
6. و resuspend الرسوبية VLPs في الجزء السفلي من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة من قبل pipetting بقوة صعودا وهبوطا. كمية من برنامج تلفزيوني حاجة ل resuspend VLPs يعتمد على فلب محصول البروتين والتطبيقات المصب. عادة، resuspend كل بيليه فلب لا تقل عن 100 ميكرولتر.
7. تخزين عينات 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى القصير و-80 ° C تخزين لتخزين على المدى الطويل.

4. تحديد العائد البروتين والعائد مستضد معين

1. تحديد محتوى البروتين الكلي باستخدام طريقة البروتين الكمي التجاري، مثل فحص BCA حسب بروتوكول الشركة الصانعة.
2. لتقييم محتوى مستضد معين، نفذ انزيم مرتبط مباشرة المناعي فحص (ELISA) من خلال طلاء التخفيفات المسلسل من المستضدات القياسية و2-51؛ غرام من إجمالي العينة البروتين الدخول إلى ELISA 96-جيدا لوحة مسطحة القاع.
   1. اتبع مع الأجسام المضادة مستضد معين للتحقيق في وجود مستضدات على لوحة واستخدام ركائز التنمية ELISA التقليدية لإنتاج الامتصاصية للكشف عن قارئ صفيحة. انظر الشكل 2 لنتائج ممثلة من HA و ELISA فحص لعينة HA، معربا عن فلب. العديد من مجموعات من HA و NA هي ربما ولكن قد تختلف العوائد على HA-NA توافق ^15.
      ملاحظة: الأجسام المضادة مستضد محددة لها الانتماءات المتغيرة وينصح أن نقطة النهاية تخفيف معايرة الأجسام المضادة يتم تحديدها قبل تنفيذ فلب الكمي. والأجسام المضادة التجارية لديها تركيز أو تخفيف نطاقات المقترحة للاستخدام في ELISA، وكذلك البروتوكولات المقترحة.

النتائج

وكانت غلة فلب المتغيرة التي كتبها الفيروسي تصميم مستضد بناء. في هذا البروتوكول، ونحن أثبتنا استخدام خلايا الحشرات والثدييات لإنتاج SVP أو VLPs في طاف وتنقية من قبل تنبيذ فائق. تم استخدام أربعة أنواع فرعية من DENV PRM / E الجينات الهيكلي أشرطة التعبير لبناء ?...

Discussion

وقد استخدمنا الأساليب المذكورة أعلاه للتعبير عن بنجاح وتنقية SVPs وVLPs تتكون من البروتينات الهيكلية المتعددة لمختلف مسببات الأمراض. بشكل عام، ونحن نستخدم أنظمة التعبير الثدييات لتوليد VLPs لدينا. ومع ذلك، في أيدينا، المستمدة من الثدييات خلية كانت تشيك عوائد فلب منخفضة. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096