Экспрессия и очистка вирусоподобных частиц для вакцинации

Резюме

Здесь мы приводим протокол для синтеза вирусоподобных частиц, используя либо бакуловируса или системы экспрессии млекопитающих и очистки ультрацентрифугирования. Этот высоко настраиваемый подход используется для выявления вирусных антигенов в качестве мишеней вакцины в безопасной и гибкой основе.

Аннотация

Вирусоподобные частицы (VLP) и субвирусного частицы (СВП) являются альтернативный подход к вирусным конструкции вакцины, которая предлагает преимущества повышенной биологической безопасности и стабильности по сравнению с использованием живых микроорганизмов. Неинфекционные и самосборки, VLPs используются, чтобы представить структурные белки в качестве иммуногенов, обходя потребность живых патогенов или рекомбинантных вирусных векторов для доставки антигена. В этой статье мы покажем различные стадии проектирования и разработки VLP для будущих применений в доклинических испытаний на животных. Процедура включает в себя следующие этапы: выбор антигена, экспрессию антигена в клеточной линии выбора, очистки VLPs / СВП и количественному отношению к антигену дозирования. Показано использование обеих клеточных линий млекопитающих и насекомых для экспрессии наших антигенов и продемонстрировать, как методологии отличаются доходности. Методология, представленная может применяться к различным патогенам и может быть достигнуто путем замены антигенов с иммуногенной улuctural белки микроорганизмов пользователя интерес. VLPs и СВП помочь с антигенной характеризации и отбора лучших вакцин-кандидатов.

Введение

Вирусные частицы (VLP) являются утвержденной технологии для вакцинации человека. На самом деле, некоторые из более современно лицензированных вакцин, в том числе вируса папилломы человека (ВПЧ) и гепатита В (HepΒ) вакцины используют этот подход. VLPs образуются из структурных белков, способных к самоорганизации. Собранные частицы имитируют вирусные морфологию, но не может инфицировать или репликации, поскольку они испытывают недостаток в вирусных геномов. VLP, может быть экспрессирован и очищен от ряда прокариотических и эукариотических систем. Обзор литературы показал , что различные системы экспрессии используются в следующих размерах: бактерии - 28%, дрожжи - 20%, завод - 9%, насекомых - 28%, а у млекопитающих - 15% ^1. Следует отметить, что вакцины против ВПЧ на основе капсидного белка L1 продуцируются в дрожжах (Гардасил) или в системе клеток насекомых (Церварикс) ^2. Вакцины HepΒ, Recombivax и Engerix-Β, также производятся в дрожжах, и состоят из HepΒ поверхностного антигена ³, 4.

Мы используем системы экспрессии клеток млекопитающих и насекомых для производства VLPs, требующих совместного экспрессию нескольких структурных белков для сборки. Наша работа сосредоточена на разработке, производстве и очистки VLP на основе вакцин против патогенов человека: вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус денге (DENV), и вирус чикунгуньи (CHIKV). Наши методы являются достаточно гибкими , чтобы обеспечить коэкспрессией многочисленных структурных белков из нескольких плазмид экспрессии, или одной плазмиды экспрессии (рисунок 1). Ранее мы получали и очищали вирус H5N1 VLPs собранный из коэкспрессией плазмид , кодирующих гемагглютинин гриппа (HA), нейраминидаза (NA) и матрица (M1) в эмбриональной почки человека 293Т ^5,6. Гены оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих, и клонировали в pTR600, эукариотической вектор экспрессии, содержащий промотор цитомегаловируса немедленного раннего промотора плюс Интрон А для инициирования TransCription эукариотических вставок и бычий сигнал полиаденилирования гормона роста для прекращения транскрипции ^7. Аналогичный подход с использованием трех плазмидной коэкспрессии HA, NA (рис 1А) и альтернативного вирусного белка матрикса, ВИЧ Gag p55, был использован для генерации человеческого подтипа сезонного гриппа H3N2 VLPs в данном исследовании , и было показано , для генерации VLPs такого же размера , как частицы гриппа ^8. Хотя вакцины против гриппа преимущественно вызывают анти-HA антитела, добавление нейраминидазы вируса гриппа посредничает сиалидазу активность , чтобы позволить VLP многообещающий из трансфецированных клеток ⁹ , а также представить дополнительные иммуногенных целей. Для получения RSV VLPs, мы также выбрали неродственного ядро ВИЧ Gag для разработки прототипические вакцин , которые представляют исключительно RSV поверхностных гликопротеинов для дальнейшей демонстрации гибкости формирования VLP с использованием ВИЧ - Gag, как описано выше , и характеризуется с помощью электронной микроскопии ^6,10. другиеРанее было показано , что VLP , представляя RSV гликопротеины могут быть собраны с использованием различных вирусных компонентов от вируса болезни Ньюкасла (NDV) ¹¹ и матрицы ¹² гриппа. гликопротеин последовательности поверхности Полноразмерные были использованы в этом исследовании, чтобы сохранить нативные конформации, которые могут быть необходимы для функционального связывания рецептора и анализа распознавания антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Наши примеры использования отдельных систем плазмида экспрессии для получения частиц являются DENV и CHIKV. В случае DENV, мы можем производить субвирусного частицы (СВП) без капсида в клетках 293Т из одной плазмиды , содержащей кассету экспрессии PRM / Е структурный ген ^13. Термин SVP используется для обозначения отсутствия белка ядра или капсида в сборке вирусных структурных белков. CHIK VLP, также могут быть получены с помощью одной плазмиды, содержащей CHIKV структурный ген кассетные, кодирующий капсида и белки оболочки, или в Insect клетки путем инфицирования рекомбинантным бакуловирусом , кодирующей тот же структурный ген , кассету , оптимизированные для экспрессии клеток насекомых (Фиг.1В - C).

Конечный результат выражения рассмотренных выше подходов является высвобождение VLPs в среду для культивирования клеток, которые затем могут быть очищены с помощью ультрацентрифугирования через 20% глицерина демпфировать. В этом отчете мы представляем методы, чтобы выразить и очистить эти VLPs от клеточных систем млекопитающих и насекомых.

протокол

1. млекопитающим Expression System для генерации гриппа H3N2 VLP

1. Подклон вирусные структурные гликопротеины гемагглютинин (НА), нейраминидаза (NA), и вирус иммунодефицита человека Затычка р55 (ВИЧ) в эукариотические экспрессирующие векторы, такие , как описано ранее pTR600. ⁷
2. Amplify ДНК в химически компетентной Escherichia coli (например, DH5 & alpha ; ) и изолировать плазмиды трансфекции класса с использованием набора для очистки плазмидной в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество ДНК зависит от урожайности и потребностей пользователей.
3. Поддержание линии клеток млекопитающих, 293T, в питательной среды , содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) , при температуре 37 ° С с 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе.
4. Рост клеток таким образом, что Т-150 тканевой культуры флакон содержит 45-75 х 10 ⁶ клеток на колбу таким образом, что колба получает полную приверженность клеток и 85-95% слитности клеток на следующий день. Проверьте клетки под микроскопом для желаемого confluобразность.
   Примечание: Высокая плотность клеток, как правило, рекомендуется, чтобы получить оптимальную экспрессию белка с минимальным цитотоксичности при использовании коммерческих реагентов трансфекции Однако чрезмерно сплошности может привести к накоплению клеточных отходов побочных продуктов и снижают жизнеспособность клеток.
5. В день трансфекции готовят липосом и смесь ДНК в соответствии с рекомендациями производителя и трансфекции клеток ДНК с композицией ДНК 1: 1: 2 ГА: NA: Gag с общим количеством ДНК 40 мкг на Т-150 колбу. Развести ДНК и липосомных растворов в не содержащей сыворотки среде без трансфекции антибиотиков, таких, что каждый флакон содержит общий объем 20-30 мл.
   Примечание: Коэффициент генных конструкций может потребовать оптимизации пользователя. Хотя это и не как здесь было показано, аналогичная процедура трансфекции была выполнена с респираторно-синцитиальный вирус (RSV) F и ВИЧ Gag в соотношении 1: 1. Для одного плазмид экспрессии DenV и CHIKV, в общей сложности 20 мкг ДНК на Т-150 колбы используются для оптимального еXpression. ДНК: трансфекцией отношения реагентов оптимизированы для пользователей. Используйте рекомендуемые трансфекции среду на основе метода трансфекции, т.е. поликатионные липидные трансфекцию рекомендуют снижение или отсутствие сыворотки плода коровы , таким образом , средства массовой информации , могут быть дополнены гормонов роста и микроэлементов для поддержания роста в отсутствие сыворотки.
6. Возвращение колб до 37 ° С с 5% СО ₂ инкубатора. Для получения объема 200 мл, используют 9 колбах Т-150. Клетки не поддерживаются в трансфекции культуральной среде до дня урожая VLP.
7. Урожай супернатант культуры из клеток после 72-96 ч после трансфекции в зависимости от антигена, или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80%, по оценкам микроскопического обследования. Передача супернатант в 50 мл конические пробирки и спина клетки вниз при 500 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, чтобы осадить клеточный дебрис.
   Примечание: Замена 3 дня супернатанта со свежим подогретого бессывороточной трансфекции СМИ к прилипшие клетки будут yielда второй много VLPs с аналогичной или слегка пониженным выходом и должен быть оптимизирован пользователем.
8. Бассейн супернатант и фильтруют через 0,22 мкм поры мембраны перед осаждением посредством ультрацентрифугирования.
9. Проверьте гемагглютинации активность HA-экспрессирующих VLPs с помощью стандартных гемагглютинации анализа ¹⁴ с использованием 0,8% индейки или млекопитающих красных кровяных клеток или продолжить антиген-специфического ELISA. На рисунке 2 репрезентативных результатов.

2. CHIK VLP Expression Использование элементной системы бакуловируса / насекомых

1. Генерирование рекомбинантного бакуловируса, выражающие вирус чикунгуньи капсида и белки оболочки (C-E3-E2-6K-E1) от S-27 штамма с использованием коммерческой системы бакуловируса экспрессии.
2. Культура Spodoptera frugiperda Sf9 клеток в бессывороточной среде для роста sF9 со 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 28 ° С. Используйте 3-5 × 10 ⁵ копий / мл , чтобы начать вращающаяся колба культур для suspensрост клеток ионов. Прохождение обычно , когда они достигают плотности клеток от 2-4 х 10 ⁶ копий / мл (каждые 3-4 дня).
3. Культура Sf9 клетки в суспензии в колбах с центрифужных перемешивании со скоростью 130 оборотов в минуту в системе многоточечной мешалка пластины. Для правильной аэрации, сохранить объемы культуры на уровне не более половины объема вращающуюся колбу.
4. Для экспрессии CHIK VLPs, инфицировать клетки Sf9 при плотности 2 х 10 ⁶ клеток / мл с рекомбинантным бакуловирусом при множественности инфекции 1 и вернуться к 28 ° C инкубаторе. Как правило, заражает один или два вращающихся колбах, содержащих 250 мл клеток Sf9.
   Примечание: В то время как мы не используем этот метод, Sf9 клетки могут быть выращены в шейкер колбах при 28 ° С с использованием шейкера платформы.
5. Урожай культур после 72-96 ч после инфицирования, или когда жизнеспособность клеток снизилась до 70-80%, как определено трипанового синего в соответствии с протоколом производителя.
   Примечание: Клетки продолжают размножаться в то время как зараженный и естьжизнеспособность ~ 80% в Sf9 культурах, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом VLP CHIK на 3-й день после заражения (точек на дюйм). Инфицированных бакуловирусом клетки больше по внешнему виду. Морфология также может меняться от раунда к продолговатые. В конце-стадии бакуловирусом инфекций, клетки стали лизировать.
6. Передача культуры непосредственно из культуральной суспензии в 50 мл конические пробирки и спин клетки вниз при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
7. Собирают супернатанты и фильтруют через 0,22 мкм пор мембрану перед тем осаждения с помощью ультрацентрифугирования.

3. Осаждение / Очистка VLP / СВП

1. Стерилизовать 25 мм х 89 мм с открытым верхом Ультрацентрифуга трубы с 70% этанола в биологической безопасности капюшоном. Убедитесь, что этанол высохла перед использованием.
2. Нагрузка до 32 мл супернатанта в чистую пробирку. Минимальный объем 25 мл, рекомендуется, чтобы предотвратить коллапс и повреждение недостаточно заполненных Ультрацентрифуга трубок.
3. Тщательно подкладывать супернатанты остроумиеч стерильный 3 мл 20% глицерина в PBS (об / об). Убедитесь, что трубки сбалансированы.
4. Спин в 135000 мкг в течение 4 ч при 4 ° С.
5. Отберите супернатант, обеспечивая осадок не выбивать из трубки.
6. Ресуспендируют осаждали VLPs на дне пробирки стерильной PBS энергично пипетированием вверх и вниз. Количество PBS требуется для ресуспендирования VLP, зависит от того, VLP общий выход белка и последующих применений. Как правило, каждый ресуспендируют осадок в VLP, по меньшей мере 100 мкл.
7. Образцы Хранить 4 ° C для кратковременного хранения и хранения -80 ° C для длительного хранения.

4. Определение протеина урожайностью и специфического антигена Урожайность

1. Определить общее содержание белка с использованием коммерческого способа Количественную оценку белка, такие как BCA анализа в соответствии с протоколом производителя.
2. Для оценки конкретного содержания антигена, выполняют прямую иммуноферментного анализа (ELISA) путем нанесения серийных разведений стандартного антигена и 2-51; г общего образца белка на ИФА 96-луночных плоскодонных пластины.
   1. Последующие с антиген-специфических антител, чтобы исследовать на наличие антигенов на пластине и использовать традиционные основания разработки ELISA для производства обнаруживаемыми абсорбцию для микропланшет-ридером. На рисунке 2 репрезентативных результатов HA и ELISA анализа для образца HA-VLP , выражающей; многие комбинации HA и NA являются , возможно , но выходы могут отличаться от совместимости HA-NA ^15.
      Примечание: Антиген-специфические антитела имеют вариабельные сродства и рекомендуется, чтобы конечная точка разведения титрование антител определяется перед выполнением VLP количественной оценки. Коммерческие антитела Предложили концентрации или разбавления диапазоны для использования в ELISA, а также предлагаемые протоколы.

Результаты

выходы VLP были переменными с помощью вирусного антигена дизайн конструкции. В этом протоколе, мы продемонстрировали использование насекомых и млекопитающих клеток для производства СВП или VLPs в супернатанте и очистки с помощью ультрацентрифугирования. Четыре подтип?...

Обсуждение

Мы использовали методы, описанные выше, чтобы успешно экспрессировать и очистить СВП и VLPs, состоящие из нескольких структурных белков для различных патогенов. В общем, мы используем системы экспрессии в клетках млекопитающих, чтобы произвести наши VLPs. Тем не менее, в наших руках, млекоп...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096