표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

요약

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

초록

바이러스 유사 입자 (VLP를) 및 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)은 살아있는 병원체의 사용을 통해 증대 바이오 안정성의 이점을 제공하는 바이러스 백신 디자인에 대한 대체 방법이다. 비 감염성 및자가 조립 VLPs를 살아있는 병원체 또는 항원 전달을위한 재조합 바이러스 벡터의 필요성을 우회 면역원으로 구조 단백질을 제공하는 데 사용된다. 이 글에서, 우리는 전임상 동물 실험에서 미래의 애플리케이션을위한 VLP 설계 및 개발의 여러 단계를 보여줍니다. 절차는 다음 단계를 포함 항원 투여에 대한 항원의 선택, 선택의 세포주, VLP를 / SVPs의 정제 항원의 발현 및 정량화. 우리는 우리의 항원의 발현 모두 포유 동물 및 곤충 세포 라인의 사용을 설명하고 방법은 수율이 다른 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 병원체의 종류에 적용 할 수있는 면역 원성 항원 STR로 대체함으로써 달성 될 수있다관심 사용자 미생물 uctural 단백질. VLP를하고 SVPs는 항원의 특성과 최고의 백신 후보의 선택에 도움이됩니다.

서문

바이러스 유사 입자 (VLP를)은 인간의 예방 접종에 대한 승인 된 기술입니다. 실제로, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 간염 Β 포함한 더 현대적 허가 백신의 일부 (HepΒ) 백신이 방법을 사용한다. VLP를이 자기 ​​조립이 가능한 구조 단백질로부터 형성된다. 조립 된 입자는 바이러스 모폴로지을 모방하지만, 감염 또는 바이러스 성 게놈이 부족하기 때문에 복제 할 수 없습니다. VLP를가 표현 원핵 생물과 진핵 생물 시스템의 수와 정제 할 수있다. - 28 %, 효모 - 20 %, 식물 - 9 %, 곤충 - 28 %, 그리고 포유류 - 15 % ¹ 박테리아 : 문헌의 검토는 서로 다른 발현 시스템은 다음과 같은 비율로 사용되는 것으로 나타났습니다. 참고로, L1 캡시드 단백질을 기반으로 HPV 백신은 효모 (가다실) 또는 곤충 전지 시스템 ^{(서바릭스)이} 생산됩니다. HepΒ 백신, 및 Recombivax Engerix-Β 또한 효모에서 생산 한 HepΒ 표면 항원 ^(3)로 구성되는4.

우리는 여러 조립 구조 단백질의 공동 발현을 요구하는 VLPs를 생성하는 포유 동물 및 곤충 세포 발현 시스템을 사용한다. 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 뎅기열 바이러스 (DENV), 및 chikungunya 바이러스 (CHIKV) : 우리의 작업은 인간의 병원균에 대한 설계, 생산 및 정화 VLP 기반 백신에 초점을 맞추고 있습니다. 우리의 방법은 다수의 발현 플라스미드의 다중 구조 단백질의 공동 발현 또는 단일 발현 플라스미드 (도 1)을 허용 할 정도로 유연하다. 이전에는 제조 및 정제 H5N1 VLPs를 인간 배아 신장 293T 세포 ^5,6-에서 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 매트릭스 (M1)을 코딩하는 플라스미드의 공동 발현 조립. 유전자는 포유 동물 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화 pTR600, transc을 개시 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 플러스 인트론을 포함하는 진핵 세포 발현 벡터에 클로닝진핵 삽입의 ription 및 전사 ^(7)의 종료에 대한 소 성장 호르몬 폴리아 데 닐화 신호. HA, NA (도 1A) 및 다른 바이러스의 매트릭스 단백질, HIV 개그 P55,의 3 플라스미드의 공동 발현을 사용하여 유사한 접근 방식이 연구에서 인간 계절 인플루엔자 아형 H3N2 VLPs를 생성을 위해 사용하고, 생성하는 것으로 나타났다 인플루엔자 입자 ^(8)과 비슷한 크기의 VLP를. 인플루엔자 백신은 주로 항 HA 항체를 유도하지만, 인플루엔자 뉴 라미니다 제를 첨가하는 형질 세포 ^(9)와 같은 본 추가 면역 원성 표적에서 신진 VLP 있도록 시알 리다 아제 활성을 매개한다. RSV VLP를 생산하기 위해, 우리는 또한 이전에 기술과 전자 현미경 ^6,10 특징으로 추가, HIV 개그를 사용하여 VLP 형성의 유연성을 보여주기 위해 독점적 RSV 표면 당 단백질을 제시 원형 백신을 설계하는 HIV 개그의 관련이없는 코어를 선택했다. 기타이전 즉 RSV 당 단백질 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV) ^(11), 및 인플루엔자 매트릭스 ^{(12)로부터} 각종 바이러스 요소를 사용하여 조립 될 수 제시 VLPs를 보여 주었다. 전체 길이 표면 당 단백질 서열은 효소 면역 분석법 (ELISA)을 통해 기능성 수용체 결합 및 항체 인식의 분석에 대한 필요가있을 수있다 천연 배좌를 유지 본 연구에 이용 하였다.

입자를 생성하는 하나의 플라스미드 발현 시스템의 사용에 대한 우리의 예는 DENV 및 CHIKV 있습니다. DENV의 경우에, 우리는 PRM / E 구조 유전자 발현 카세트 ^(13)를 함유 한 플라스미드를 293T 세포 없음 캡시드와 서브 바이러스 레 입자 (SVPs)를 생산할 수있다. 용어 SVP가 바이러스 구조 단백질의 조립에서 코어 또는 캡시드 단백질의 부재를 나타 내기 위해 사용된다. CHIK VLP를도 CHIKV 구조 유전자 카세트 부호화 캡시드 및 외피 단백질을 함유 한 플라스미드를 사용하여 제조 될 수 있고, 또는 I의재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 발현 (- C도 1b)을 위해 최적화 동일한 구조 유전자 카세트를 인코딩 감염시켜 세포 nsect.

상술 된 접근법 식의 최종 결과는 20 % 글리세롤 쿠션을 초 원심 분리를 통해 정제 할 수있는 세포 배양 배지에 VLP를 릴리스한다. 이 보고서에서 우리는 표현과 포유 동물 및 곤충 세포 시스템에서 이러한 VLP를 정화하는 방법을 제시한다.

프로토콜

인플루엔자 H3N2 VLP의 생성 1.​​ 포유 동물 발현 시스템

1. 이러한 서브 클론 전술 pTR600 진핵 발현 벡터 내로 구조적 바이러스 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA), 뉴 라미니다 제 (NA), 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 개그 P55. ⁷
2. 화학적 능력 대장균 (예 DH5α)에서 DNA를 증폭하고 제조자의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 형질 급 플라스미드를 분리. DNA의 양 수율 및 사용자의 필요에 따라 달라집니다.
3. 가습 인큐베이터에서 5 % CO _2, 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 성장 배지에서 포유 동물 세포주 293T를 유지한다.
4. 은 T-150 조직 배양 플라스크 플라스크 다음 하루 전체 세포 부착 및 85-95% 세포 포화 상태를 취득하도록 플라스크 당 45-75 × 10 ⁶ 세포를 포함하도록 세포를 성장. 원하는 conflu에 대한 현미경으로 세포를 검사ency.
   참고 : 높은 세포 밀도는 전형적 그러나 과도한 컨 플루 세포 부산물 폐기물의 축적의 결과 및 세포 생존을 감소 상업적 형질 전환 시약을 사용하는 경우 최소한의 세포 독성을 최적 단백질 발현을 생성 할 것을 권장한다.
5. NA : 1 : HA의 두 형질의 날 (1)의 DNA 조성물 DNA 세포를 제조자의 권장 사항에 따라 리포솜과 DNA 혼합물을 제조 및 형질 개그 T-150 플라스크 당 40 μg의 총 DNA 양으로. 각각의 플라스크를 20 내지 30 ml의 총 부피가 포함되도록 항생제없이 무 혈청 배지에서 형질 전환 DNA와 리포좀 용액을 희석.
   참고 : 유전자 구조의 비율은 사용자 최적화가 필요할 수 있습니다. : 1 비율 여기서 증명되지 않았지만, 유사한 형질 전환 절차는 1에서 호흡기 합 포체 바이러스 (RSV) F 및 HIV 개그 수행되었다. DENV 및 CHIKV 하나의 발현 플라스미드, T-150 플라스크 당 DNA의 20 μg의 총 최적의 전자에 사용되는xpression. DNA : 형질 전환 시약 비율은 사용자에 최적화되어 있습니다. 사용은 형질 전환 방법에 기초하여 형질 매체 추천 즉, 다가 양이온 지질 형질 따라서 미디어 성장 호르몬 보충 될 수 감소 또는 소 태아 혈청의 부재를 추천 및 혈청의 부재하에 성장을 지원하기 위해 미량 원소.
6. 5 % CO ₂ 배양기에 37 ° C로 플라스크를 돌려줍니다. 200 ML의 볼륨의 경우, 9 T-150 플라스크를 사용합니다. 세포는 VLP 수확의 날까지 형질 전환 배양 배지에서 유지됩니다.
7. 72-96 시간 포스트 형질이 항원에 따라, 또는 현미경 검사를 통해서 추정으로 세포 생존율이 70 ~ 80 %로 감소 할 때 후 세포에서 수확 배양 상청. 전송 50 ML 원뿔 튜브에 뜨는 및 세포 파편 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 500 × g에서 세포를 스핀 다운.
   참고 : yiel 것이다 부착 세포에 신선한 사전 예열, 무 혈청 형질 미디어 3 일 뜨는 교체와 비슷하거나 약간 감소 수율 VLP를의 다 두 번째 많은 사용자가 최적화되어야한다.
8. 초 원심 분리를 통해 침전 전에 0.22 μm의 기공 멤브레인을 통해 풀 뜨는 및 필터.
9. 0.8 % 칠면조 또는 포유류의 적혈구를 사용하여 표준 혈구 응집 분석 ^(14)에 의해 HA-표현 VLP를의 혈구 응집 활성을 테스트 또는 항원 특이 적 ELISA를 진행합니다. 대표적인 결과 그림 2를 참조하십시오.

배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템을 사용하여 2 CHIK의 VLP 식

1. 상업적 배큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 S-27 균주 chikungunya 바이러스 캡시드 및 외피 단백질 (C-E3-E2-6K-E1)를 발현하는 재조합 배큘로 바이러스를 생성한다.
2. 28 ° C에서 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 혈청 인 Sf9 성장 배지에서 배양 스포 도프 테라 프 루기 페르 Sf9 세포. suspens에 대한 스피너 플라스크 배양을 시작하는 데 3 ~ 5 × 10 ⁵ C / ㎖를 사용하여이온 세포 증식. 통로 일상적 이들은 2-4 × ¹⁰⁶ C / ㎖ (3-4 일마다)의 세포 밀도에 도달했을 때.
3. 지점 교반기 플레이트 시스템에서 130 rpm으로 교반와 스피너 플라스크에서 서스펜션 문화 인 Sf9 세포. 적절한 통기를 들어, 스피너 플라스크없이 절반 이상 볼륨에서 문화 볼륨을 유지한다.
4. CHIK VLP를 발현를 들어, 1의 복수개 감염으로 재조합 바쿠 바이러스로 2 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 밀도로 Sf9 세포를 감염 28 ° C의 배양기로 복귀. 통상적으로, 250 ㎖의 Sf9 세포를 함유하는 하나 또는 두 개의 스피너 플라스크, 감염.
   참고 : 우리는이 방법을 사용하지 않지만, Sf9 세포가 통 플랫폼을 사용하여 28 ℃에서 진탕 플라스크에서 배양 할 수있다.
5. 세포 생존율이 70~80%로 감소되었을 때 수확 문화는 72-96 시간 게시물 감염 후 또는 제조사의 프로토콜에 따라 트리 판 블루 배제에 의해 결정.
   참고 : 세포가 감염된 상태에서 증식을 계속하고있다삼일 후 감염 수 (dpi)에 재조합 CHIK VLP의 배큘로 바이러스에 감염된 인 Sf9 문화의 ~ 80 %의 생존. 배큘로 바이러스에 감염된 세포는 모양이 크다. 형태는 직사각형에 둥근에서 변경 될 수 있습니다. 바큘로 바이러스 감염의 후기 단계에서, 세포를 용해시키기 시작했다.
6. 직접 현탁 배양에서 50 ML 원뿔 튜브에 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 스핀 다운 전송 문화.
7. 상층 액을 수집하고 초 원심 분리를 통해 침전하기 전에 0.22 μm의 기공 막을 통해 필터링합니다.

VLP / SVPs 3. 침전 / 정제

1. 바이오 안전성 후드 70 % 에탄올로 25mm X 89mm 열린 정상 초원 심 분리기 튜브를 소독. 에탄올을 사용하기 전에 오프 마른 확인합니다.
2. 깨끗한 튜브에 뜨는 32 ml의 최대로드합니다. 25 ㎖의 최소한의 볼륨이 붕괴하고 부적절하게 작성 초원 심 분리기 튜브의 손상을 방지하는 것이 좋습니다.
3. 조심스럽게 상층 액 재치를 밑받침PBS의 시간 멸균 3 ㎖의 20 % 글리세롤 (v / v)로. 확인 튜브가 균형을 확인합니다.
4. 4 ° C에서 4 시간 동안 135,000 XG에 스핀.
5. 대기음 뜨는은 펠렛을 보장하는 것은 관에서 꺼 내려하지 않습니다.
6. 재현 탁 적극적로 pipetting 아래로 멸균 PBS로 튜브의 하단에 VLP를을 침전. PBS의 양은 VLP를가 VLP 총 단백질 수율 및 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 다릅니다 재현 탁 할 필요가 있었다. 통상적으로, 적어도 100 ㎕를 각각 VLP 펠렛을 재현 탁.
7. 샘플을 저장 장기 저장 단기 저장 및 -80 ° C에 보관 4 ° C.

4. 단백질 수율 및 특이 항원 (PSA)의 금리 결정

1. 같은 제조사의 프로토콜에 따라, BCA 분석과 같은 상업용 단백질 정량 방법을 사용하여 총 단백질 함량을 측정.
2. 특정 항원 함량을 평가하기 위해, 표준 항원 2-5의 희석액을 직접 도포하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행1; ELISA 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 총 단백질 시료의 g.
   1. 플레이트의 항원의 존재를 조사하고 마이크로 플레이트 리더 검출 흡광도를 생성하기 위해 종래의 ELISA 개발 기판을 사용하여 항원 - 특이 적 항체에 따른다. VLP를 HA가 발현 샘플에 대한 HA 및 ELISA 분석의 대표적인 결과는 그림 2를 참조하십시오; HA와 NA의 많은 조합이 가능하지만 수익률은 HA-NA 호환성 ^(15)에 따라 다를 수 있습니다.
      참고 : 항원 특이 항체는 변수 친 화성을 가지고 있고 항체의 엔드 포인트 희석 적정는 VLP 정량을 수행하기 전에 결정하는 것이 좋습니다. 상업적인 항체를 ELISA에 사용하기 위해 제안 된 농도 또는 희석 범위뿐만 아니라 제안 된 프로토콜을 가질 것이다.

결과

VLP 수익률은 바이러스 항원 구조 설계에 의한 변수했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 초 원심 분리하여 상층 액의 SVP 또는 VLP를 생산 및 정제를위한 곤충과 포유 동물 세포의 사용을 증명하고있다. DENV PRM / E 구조 유전자 발현 카세트의 네 아형 표 1 (1-4으로 경계가) DENV SVPs의 버전을 구성하고 0.6 ml의 양으로 총 단백질 mg을 1.1-2.6의 범위를 보여주기 위해 사용되?...

토론

우리는 성공적으로 SVPs 다양한 병원균에 대해 여러 구조 단백질로 구성 VLP를 표현하고 정화 위에서 설명한 기술을 사용했다. 일반적으로, 우리는 VLPs를 생성하는 포유류 발현 시스템을 사용한다. 그러나, 우리의 손에, 포유 동물 세포는 CHIK의 VLP 수익률이 낮았다 산출했다. 재조합 배큘로 바이러스 곤충 세포 시스템을 사용하는 경우 CHIK VLP의 수율은보다 강력했다. 일반적으로, 배큘로 바이러스 곤...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096