Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Zusammenfassung

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) und subvirale Partikel (SVPs) sind ein alternativer Ansatz zu viraler Impfstoff-Design, das die Vorteile der erhöhten biologischen Sicherheit und Stabilität gegenüber der Verwendung von lebenden Pathogenen bietet. Nicht-infektiös und selbstorganisierenden, VLPs werden verwendet, Strukturproteine ​​als Immunogene darzustellen, wodurch die Notwendigkeit für lebende Pathogene oder rekombinanter viraler Vektoren für die Antigenabgabe umgehen. In diesem Artikel zeigen wir die verschiedenen Stadien der VLP-Design und Entwicklung für zukünftige Anwendungen in der präklinischen Tierversuche. Das Verfahren umfasst die folgenden Phasen: Auswahl des Antigens, die Expression von Antigen in Zelllinie der Wahl, Reinigung von VLPs / SVP und Quantifizierung für Antigen Dosierung. Wir demonstrieren den Einsatz beider Säugetier- und Insektenzelllinien zur Expression unserer Antigene und zeigen, wie Methoden der Ausbeute unterscheiden. Die Methodik dargestellt kann auf eine Vielzahl von Pathogenen anwendbar und kann durch Einsetzen der Antigene mit immunogenen str erreicht werdenuctural Proteine ​​des Mikroorganismus von Interesse des Benutzers. VLPs und SVP unterstützen mit Antigen Charakterisierung und Auswahl der besten Impfstoffkandidaten.

Einleitung

Virus-ähnliche Partikel (VLPs) sind eine bewährte Technologie für die menschliche Impfung. In der Tat beschäftigen einige der contemporarily zugelassene Impfstoffe, einschließlich der humanen Papillomviren (HPV) und Hepatitis Β (HepΒ) Impfstoffe diesen Ansatz. VLPs sind in der Lage die Selbstorganisation von Strukturproteinen gebildet. Die zusammengesetzten Teilchen nachahmen viral Morphologien, kann aber nicht infizieren oder zu replizieren, weil sie viralen Genomen fehlt. VLPs können aus einer Reihe von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen exprimiert und gereinigt werden. Eine Überprüfung der Literatur ergab , dass unterschiedliche Expressionssysteme mit den folgenden Raten eingesetzt werden: Bakterien - 28%, Hefe - 20%, Pflanzen - 9%, Insekten - 28%, und Säuger - 15% ^1. Zu beachten ist , Protein - Impfstoffe HPV basierend auf L1 - Kapsid in Hefe (Gardasil) oder in einer Insektenzellsystem (Cervarix) ² hergestellt. HepΒ Impfstoffe, Recombivax und Engerix-Β, werden auch in Hefe hergestellt und bestehen aus HepΒ Oberflächenantigen ³, 4.

Wir verwenden Säuger- und Insektenzellexpressionssysteme VLPs herzustellen erfordern Coexpression von mehreren Strukturproteinen für die Montage. Unsere Arbeit konzentriert sich auf die Gestaltung, Herstellung und Reinigung von VLP-basierte Impfstoffe gegen humanpathogene Erreger: Influenza-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Dengue-Virus (DENV) und Chikungunya-Virus (CHIKV). Unsere Verfahren sind flexibel genug , um die Coexpression der mehreren Strukturproteinen aus mehreren Expressionsplasmiden oder einem einzigen Expressionsplasmid (Figur 1) zu ermöglichen. Zuvor produzierten wir und gereinigter H5N1 VLPs zusammengesetzt aus der Co-Expression von Plasmiden codiert , Influenza - Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Matrix (M1) in humane embryonale Nierenzellen 293T ^5,6. Die Gene wurden für die Expression in Säugerzellen-Kodon-optimierten und kloniert in pTR600, einem eukaryotischen Expressionsvektor, der Cytomegalovirus-immediate-early-Promotor und Intron A zum Initiieren umschrift enthaltendription von eukaryotischen Einsätze und das Rinderwachstumshormon - Polyadenylierungssignal für die Beendigung der Transkription ^7. Ein ähnlicher Ansatz der drei Plasmid Co-Expression von HA, NA (1A) und eine alternative virale Matrix - Protein, HIV Gag p55, wurde unter Verwendung von für die Erzeugung von menschlichen saisonalen Influenza - Subtyp H3N2 VLPs in dieser Studie verwendet und wurde zu generieren gezeigt VLPs von ähnlicher Größe wie Influenza Partikel ^8. Obwohl überwiegend Influenza - Impfstoffe Anti-HA - Antikörper hervorzurufen, vermittelt die Zugabe von Influenza - Neuraminidase Sialidaseaktivität VLP zu ermöglichen , von transfizierten Zellen ⁹ und auch vorhanden zusätzliche immunogene Ziele Knospung. Um RSV VLPs herzustellen, wählten wir auch die in keinem Zusammenhang Kern von HIV - Gag zu prototypische Impfstoffe entwickeln , die weiter ausschließlich RSV Oberfläche Glykoproteine ​​präsentieren Flexibilität der VLP - Bildung zeigen , unter Verwendung von HIV - Gag, wie zuvor durch Elektronenmikroskopie ^6,10 beschrieben und charakterisiert. AndereVerwendung zusammengebaut werden verschiedene virale Komponenten von Newcastle Disease Virus (NDV) ^11, und Influenza - Matrix ¹² , dass VLPs präsentiert RSV - Glykoproteine ​​können zuvor gezeigt haben. Voller Länge Oberfläche Glykoprotein-Sequenzen wurden in dieser Studie verwendet, um nativen Konformationen behalten, die für funktionelle Rezeptorbindung und Antikörper-Erkennungs Assay durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) notwendig sein kann.

Unsere Beispiele für die Verwendung von einzelnen Plasmid-Expressionssysteme Partikel sind DENV und CHIKV zu erzeugen. Im Falle von DENV können wir subvirale Partikel (SVPs) ohne Kapsid in 293T - Zellen aus einem einzelnen Plasmid , das ein prM / E - Strukturgens Expressionskassette enthält ¹³ herzustellen. Der Begriff SVP wird verwendet, um das Fehlen eines Kerns oder Kapsidprotein in der Montage von viralen Strukturproteine ​​zu bezeichnen. CHIK VLPs können auch ein einzelnes Plasmid, das ein CHIKV strukturelle Gen-Kassette, die Codierung Kapsid und Hüllproteine ​​gewonnen werden, enthält, oder in insect Zellen mit einem rekombinanten Baculovirus codiert , die gleiche strukturelle Genkassette optimiert für Insektenzellexpressions (1B - C) zu infizieren.

Das Endergebnis des Ausdrucks oben diskutierten Ansätze ist die Freisetzung von VLPs in den Zellkulturmedium, das dann über Ultrazentrifugation durch einen 20% Glycerin Kissen leicht gereinigt werden. In diesem Bericht stellen wir Methoden, um diese VLPs aus Säugetier- und Insektenzellsysteme, zum Ausdruck zu bringen und zu reinigen.

Protokoll

1. Mammalian Expression System zur Erzeugung von Influenza H3N2 VLP

1. Subklon viralen Struktur Glykoproteine ​​Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und Human Immunodeficiency Virus (HIV) Gag p55 in eukaryotische Expressionsvektoren, wie zuvor beschrieben pTR600. ⁷
2. Amplify DNA in chemisch kompetente Escherichia coli (zB DH5a) und zu isolieren , die Transfektion-grade - Plasmid ein Plasmid - Reinigungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird . DNA-Menge ist abhängig von Ertrag und Anforderungen des Benutzers.
3. Pflegen Säugerzelllinie, 293T, in Wachstumsmedium , enthaltend 10% fötales-Rinderserum (FBS) bei 37 ° C mit 5% CO ₂ in einem befeuchteten Inkubator.
4. Zellen wachsen , so dass ein T-150 - Gewebekulturkolben 45-75 x 10 ⁶ Zellen pro Kolben enthält , so dass Kolben vollständige Zellhaftung und 85-95% Zellkonfluenz durch die folgenden Tag erhält. Untersuchen Zellen unter dem Mikroskop für die gewünschte confluparenz.
   Hinweis: Hochzelldichte wird in der Regel eine optimale Proteinexpression mit minimaler Zytotoxizität ergeben empfohlen, wenn es um kommerzielle Transfektionsreagentien jedoch über Konfluenz unter Verwendung von Nebenprodukten in Akkumulation von zellulären Abfällen führen kann und die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren.
5. Am Tag der Transfektion vorbereiten Liposomen und DNA-Gemisch gemäß den Empfehlungen des Herstellers und DNA-Zellen mit einer DNA-Zusammensetzung von 1 transfizieren: 1: 2 von HA: NA: Gag mit einer Gesamt-DNA-Menge von 40 ug pro T-150-Kolben. Verdünnte DNA und Liposomen-Lösungen in serumfreiem Transfektionsmedium ohne Antibiotika, so dass jeder Kolben mit einem Gesamtvolumen von 20 bis 30 ml enthält.
   Hinweis: Verhältnis der Genkonstrukte können Benutzer Optimierung erfordern. 1-Verhältnis: Obwohl hier nicht gezeigt, eine ähnliche Transfektionsverfahren mit Respiratory Syncytial Virus (RSV) F und HIV Gag wurde bei einer 1 durchgeführt. Für DENV und CHIKV einzelnen Expressionsplasmide, insgesamt 20 & mgr; g DNA pro T-150-Kolben werden für optimale e verwendetxpression. DNA: Transfektionsreagenz Verhältnisse sind Anwender optimiert. Verwendung empfohlen Transfektionsmedium basierend auf Transfektionsverfahren, dh polykationischen Lipids Transfektionen Reduktion oder Abwesenheit von fötalem Rinderserum empfehlen daher mit Wachstumshormonen und Spurenelemente ergänzt werden können Medien Wachstum in Abwesenheit von Serum zu unterstützen.
6. Rückkolben auf 37 ° C mit 5% CO ₂ -Inkubator. Bei einem Volumen von 200 ml, verwenden 9 T-150 Flaschen. Die Zellen werden in der Transfektion Kulturmedium bis zum Tag der VLP Ernte gehalten.
7. Ernte-Kulturüberstand von Zellen nach 72-96 Stunden nach der Transfektion auf Antigen-abhängig, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auf 70-80% verringert, wie durch mikroskopische Untersuchung geschätzt. Übertragungsüberstand in 50 ml konische Röhrchen und spin die Zellen nach unten bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren.
   Hinweis: Ersatz von 3 Tage Überstand mit frischem vorgewärmten, Serum-freien Transfektionsmedien zu adhärenten Zellen werden yielda zweite Menge von VLPs mit ähnlichen oder leicht verminderte Ausbeute und sollten durch Anwender optimiert werden.
8. Pool Überstand und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation mittels Ultrazentrifugation.
9. Testen Sie die Hämagglutinationsaktivität der HA-exprimierenden VLPs durch Standard Hämagglutinationsassay ¹⁴ 0,8% Pute oder roten Blutkörperchen von Säugetieren oder gehen Sie mit Antigen-spezifischen ELISA. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse.

2. CHIK VLP Expression unter Verwendung von Baculovirus / Insektenzellen-System

1. Generieren rekombinanten Baculovirus exprimiert Chikungunya-Virus-Kapsid und Hüllproteine ​​(C-E3-E2-6K-E1) von S-27-Stamm Kommerzielle Baculovirusexpressionssystems verwenden.
2. Kultur Spodoptera frugiperda Sf9 - Zellen in serumfreiem Sf9 Wachstumsmedium mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 28 ° C. Verwenden Sie 3-5 x 10 ⁵ c / ml Rührflasche Kulturen für suspens zu initiierenIonen-Zellwachstum. Passage routinemäßig , wenn sie erreichen Zelldichten von 2-4 x 10 ⁶ c / ml (alle 3-4 Tage).
3. Kultur Sf9-Zellen in Suspension in Spinnerflaschen mit auf einem Mehr Rührerplatte System bei 130 Umdrehungen pro Minute gerührt. Für eine ordnungsgemäße Belüftung Kulturvolumina bei nicht mehr als die Hälfte des Volumens des Rührflasche halten.
4. Zur Expression von VLPs CHIK, Sf9 Zellen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml mit rekombinantem Baculovirus mit einer Multiplizität der Infektion von 1 und zurück auf 28 ° C Inkubator infizieren. Typischerweise infizieren ein oder zwei Spinnerflaschen mit 250 ml Sf9-Zellen.
   Hinweis: Während wir diese Methode nicht verwenden, können Sf9-Zellen bei 28 ° C in Schüttelkolben kultiviert werden, einen Shaker-Plattform.
5. Ernte Kulturen nach 72-96 h nach der Infektion, oder wenn die Lebensfähigkeit der Zellen auf 70-80% verringert hat, wie durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt nach dem Protokoll des Herstellers.
   Anmerkung: Die Zellen fortzusetzen, während infizierte zu proliferieren, und es gibta ~ 80% Lebensfähigkeit in Sf9 Kulturen mit rekombinanten CHIK VLP Baculovirus infiziert bei 3 Tage nach der Infektion (dpi). Baculovirus-infizierte Zellen sind größer in Erscheinung. Morphologie kann auch von rund bis länglich ändern. In der späten Stadien der Baculovirus-Infektion begannen die Zellen zu lysieren.
6. Transfer Kulturen direkt aus Suspensionskultur in 50 ml konische Röhrchen und die Zellen des Abschaltens bei 500 × g für 5 Minuten bei 4 ° C.
7. Sammeln Sie Stände und filtriert durch ein 0,22 um Porenmembran vor der Sedimentation über Ultrazentrifugation.

3. Sedimentation / Reinigung von VLP / SVP

1. Sterilisieren 25 mm x 89 mm nach oben offenen Ultrazentrifuge Rohre mit 70% Ethanol in Biosicherheit Kapuze. Stellen Sie sicher, das Ethanol vor dem Gebrauch durchgetrocknet ist.
2. Legen Sie bis zu 32 ml Überstand in ein sauberes Röhrchen. Ein minimales Volumen von 25 ml wird empfohlen, von nicht ausreichend gefüllt Ultrazentrifugenröhrchen Kollaps und Schäden zu vermeiden.
3. Sorgfältig unterlegen Stände Witzh sterile 3 ml 20% Glycerin in PBS (v / v). Stellen Sie sicher, Rohre ausgeglichen sind.
4. Spin bei 135.000 xg für 4 h bei 4 ° C.
5. Überstand entfernen, wird das Pellet gewährleisten nicht aus dem Rohr entfernen.
6. Resuspendieren sedimentiert VLPs an Boden der Röhrchen mit sterilem PBS durch kräftiges Pipettieren nach oben und unten. Die Menge an PBS benötigt VLPs zu suspendieren, hängt von VLP Gesamtproteinausbeute und Downstream-Anwendungen. Typischerweise resuspendieren jedes Pellet VLP in mindestens 100 & mgr; l.
7. Store Proben 4 ° C für die kurzzeitige Lagerung und -80 ° C Lagerung für die Langzeitlagerung.

4. Bestimmung Proteinausbeuten und spezifische Antigen Ausbeuten

1. Bestimmen Sie den Gesamtproteingehalt Kommerzielle Proteinquantifizierung Verfahren, wie BCA-Test gemäß Herstellerprotokoll.
2. Um spezifische Antigengehalt beurteilen, führen direkte Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) durch Beschichtung serielle Verdünnungen von Standard-Antigens und 2-51; g Gesamtproteinprobe auf einem ELISA-96-Well-Platte mit flachem Boden.
   1. Folgen mit antigen-spezifischen Antikörpern die Anwesenheit der Antigene auf der Platte zu sondieren und konventionellen ELISA Entwicklung Substrate verwenden, um nachweisbare Absorption für Mikrotiterplatten-Lesegerät herzustellen. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Ergebnisse von HA und ELISA - Test für eine Probe VLP-HA zum Ausdruck bringen; viele Kombinationen von HA und NA sind möglicherweise aber gibt bei der HA-NA - Kompatibilität ¹⁵ unterscheiden.
      Hinweis: Antigen-spezifischen Antikörper weisen variable Affinitäten und es wird empfohlen, dass Endpunktverdünnungs-Titration von Antikörpern vor der Durchführung VLP Quantifizierung bestimmt werden. Kommerzielle Antikörper haben vorgeschlagen, Konzentrations- oder Verdünnungsbereich für die Verwendung in ELISA sowie vorgeschlagenen Protokollen.

Ergebnisse

VLP Ausbeuten waren variabel durch virale Antigen-Konstrukt-Design. In diesem Protokoll haben wir die Verwendung von Insekten- und Säugerzellen für die Produktion von VLPs SVP oder in Überstand und die Reinigung durch Ultrazentrifugation demonstriert. Vier Subtypen von DENV prM / E - Strukturgens Expressionskassetten wurden verwendet , um die Versionen von DENV SVPs zu konstruieren (wie abgegrenzte 1-4) in Tabelle 1 und zeigen einen Bereich zwischen 1,1 bis 2,6 mg Ges...

Diskussion

Wir haben die Techniken, die oben beschrieben erfolgreich verwendet, um auszudrücken und zu reinigen, SVP und VLPs aus mehreren Strukturproteine ​​für verschiedene Krankheitserreger. In der Regel verwenden wir Säugetier-Expressionssysteme unserer VLPs zu erzeugen. in unseren Händen, abgeleitet Säugetier-Zelle jedoch CHIK VLP Ausbeuten waren gering. CHIK VLP Ausbeute war robuster, wenn ein rekombinantes Baculovirus-Insektenzellsystem. Im allgemeinen Baculovirus-Insektenzellsysteme, ergeben höhere Mengen an reko...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096