ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

Abstract

חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) וחלקיקי subviral (SVPs) הם גישה חלופית עיצוב חיסון ויראלי מציע את היתרונות של בטיחות ביולוגית מוגברת יציבות לאורך שימוש פתוגנים חיים. ללא זיהומיות עצמית הרכבה, VLPs משמש להציג חלבונים מבניים כמו immunogens, תוך עקיפת צורך פתוגנים חיים או וקטורים ויראליים רקומביננטי למסירת אנטיגן. במאמר זה, אנחנו מדגימים את השלבים השונים של עיצוב VLP ופיתוח עבור יישומים עתידיים ניסויים בבעלי חיים פרה-קליניים. ההליך כולל את השלבים הבאים: בחירה של אנטיגן, ביטוי של אנטיגן בתור תא של בחירה, טיהור VLPs / SVPs, וכימות עבור מינון האנטיגן. אנו מדגימים שימוש בשני שורות תאי יונקי חרקים לביטוי של אנטיגנים שלנו להדגים כיצד מתודולוגיות שונות בתשואה. המתודולוגיה הציג עשויה לחול על מגוון רחב של פתוגנים יכול להיות מושגת על ידי החלפת אנטיגנים עם str immunogenicחלבוני uctural של מיקרואורגניזם המשתמש של עניין. VLPs ו SVPs לסייע באפיון אנטיגן ובחירת המועמדים החיסון הטוב ביותר.

Introduction

חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) מהווים טכנולוגיה אושרה לחיסון אדם. למעשה, חלק מן החיסונים מורשים יותר contemporarily, כולל וירוס הפפילומה האנושי (HPV) Β הפטיטיס (HepΒ) חיסונים להעסיק את הגישה הזו. VLPs נוצר חלבונים מבניים מסוגלים הרכבה עצמית. החלקיקים התאספו לחקות מורפולוגיות ויראלי, אבל לא יכולים להדביק או לשכפל משום שהם חסרי הגנום נגיפי. VLPs יכול לבוא לידי ביטוי מטוהרים מן מספר מערכות פרוקריוטים ו האיקריוטים. סקירה של הספרות עולה כי מערכות ביטוי שונות מועסקות בשיעורים הבאים: החיידקים - 28%, שמרים - 20%, צמח - 9%, חרק - 28%, ו יונקים - 15% ^1. ראוי לציין, חיסוני HPV מבוססים על חלבון קפסיד L1 מיוצרים שמרים (Gardasil) או מערכת תא חרק (Cervarix) ^2. חיסוני HepΒ, Recombivax ו Engerix-Β, מיוצרים גם בשמרים, והם מורכבים אנטיגן שטח HepΒ ³, 4.

אנו משתמשים במערכות ביטוי תאי יונקים וחרקים לייצר VLPs המחייב שיתוף ביטוי של חלבונים מבניים מרובים להרכבה. העבודה שלנו מתמקדת בעיצוב, ייצור, וחיסונים VLP מבוססי טיהור נגד פתוגנים אנושיים: נגיף שפעת, וירוס סינסיציאלי הנשימה (RSV), וירוס דנגה (DENV), ו Chikungunya וירוס (CHIKV). השיטות שלנו גמישות מספיק כדי לאפשר שיתוף ביטוי של החלבונים המבניים המרובים פלסמידים ביטוי מרובים, או פלסמיד ביטוי יחיד (איור 1). בעבר, שהפקנו מטוהרים H5N1 VLPs התאספו מן שיתוף ביטוי של פלסמידים קידוד hemagglutinin שפעת (HA), נורמינידאז (NA), מטריצה ​​(M1) בתאים עובריים אנושיים כליות 293T ^5,6. הגנים היו קודון אופטימיזציה עבור ביטוי בתאי יונקים ו משובטים לתוך pTR600, וקטור ביטוי איקריוטיים המכיל את ציטומגלווירוס מיידית-מוקדם אמרגן אחד פלוס אינטרון לייזום transcription מוסיף איקריוטיים ואת האות polyadenylation הורמון גדילה שור להפסקת שעתוק ^7. גישה דומה באמצעות שלושת פלסמיד שיתוף הביטוי של HA, NA (איור 1 א) ו חלבון מטריקס ויראלי חלופי, HIV Gag P55, שמשה דור VLPs H3N2 תת סוג שפעת עונתית אדם במחקר זה הוכח ליצור VLPs בגודל דומה כחלקיקים שפעת ^8. למרות החיסונים לשפעת בעיקר לעורר נוגדנים אנטי-HA, תוספת של נורמינידאז שפעת מתווכת פעילות sialidase לאפשר VLP ניצני מתאי transfected ⁹ וגם בהווה מטרות immunogenic נוספים. כדי לייצר RSV VLPs, אנחנו גם נבחרנו הליבה הקשורה של HIV Gag לעצב חיסונים אבטיפוס שמציגים גליקופרוטאינים משטח RSV בלעדי להפגין עוד יותר גמישות של היווצרות VLP באמצעות HIV Gag, כפי שתואר לעיל ואופיין על ידי מיקרוסקופי אלקטרוני ^6,10. אחריםבעבר הראו כי VLPs הצגת ניתן להרכיב גליקופרוטאינים RSV באמצעות מרכיבים נגיפיים שונים וירוס מחלת ניוקאסל (NDV) ^11, ושפעת מטריקס ^12. רצפים גליקופרוטאין משטח באורך מלא נוצלו במחקר זה כדי לשמור על תצורות הילידים כי ייתכן שיהיה צורך עבור קולטן פונקציונלי assay הכרה נוגדן איגוד באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA).

דוגמאות שלנו עבור שימוש במערכות ביטוי פלסמיד בודד כדי ליצור חלקיקים הם DENV ו CHIKV. במקרה של DENV, נוכל לייצר חלקיקים subviral (SVPs) ללא קפסיד בתאים 293T מתוך פלסמיד יחיד המכיל קלטת ביטוי גנים מבניים PRM / E ^13. סגן נשיא בכיר המונח משמש כדי לציין את חוסר חלבון הליבה או קפסיד באסיפה של חלבונים מבניים ויראלי. לחי VLPs ניתן לייצר גם באמצעות פלסמיד יחיד המכיל קלטת גנים מבניים CHIKV, קפסיד קידוד חלבוני מעטפה, או אניתאי nsect על ידי הדבקה עם baculovirus רקומביננטי קידוד קלטת הגנים מבני באותו אופטימיזציה עבור ביטוי תא חרקים (1B איור - C).

התוצאה הסופית של ביטוי גישות שנדון לעיל היא השחרור VLPs לתוך מדיום תרבית תאים כי אז יכול להיות מטוהר באמצעות ultracentrifugation באמצעות כרית גליצרול 20%. בדו"ח זה, אנו מציגים שיטות להביע ולטהר VLPs אלה ממערכות תאי יונקים וחרקים.

Protocol

1. מערכת ביטוי יונקת עבור דור של שפעת H3N2 VLP

1. Subclone hemagglutinin גליקופרוטאינים מבניים ויראלי (HA), נורמינידאז (NA), וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) P55 Gag לתוך וקטורים ביטוי איקריוטיים, כגון pTR600 שתואר לעיל. ⁷
2. להגביר דנ"א coli Escherichia המוסמכות כימית (למשל, DH5α) ולבודד פלסמיד transfection כיתה באמצעות ערכת טיהור פלסמיד לפי הוראות היצרן. כמות ה- DNA תלויה תשואה והצרכים של המשתמש.
3. לשמור על שורת תאים יונקים, 293T, בתקשורת צמיחה המכיל 10% נסיוב עוברי-שור (FBS) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ באינקובטור humidified.
4. לגדל תאים כאלה בבקבוק בתרבית רקמה T-150 מכיל 45-75 x 10 ⁶ תאים לכל בקבוק כזה כי הבקבוק משיג דבקות תא שלם confluency התא 85-95% על ידי למחרת. בדוק התאים תחת מיקרוסקופ עבור conflu הרצויency.
   הערה: צפיפות התאים גבוהה מומלץ בדרך כלל להניב ביטוי חלבון אופטימלי עם רעילות מינימלית כאשר באמצעות ריאגנטים transfection המסחריים אולם יתר confluency עלול לגרום הצטברות של פסולת הסלולר תוצרי לוואי ולהפחית כדאיות התא.
5. ביום transfection, להכין ליפוזום תערובת DNA על פי המלצות היצרן ו transfect תאי DNA עם רכב ה- DNA של 1: 1: 2 של HA: NA: Gag עם כמות ה- DNA כוללת של 40 מיקרוגרם לכל בקבוק T-150. לדלל פתרונות דנ"א ליפוזום במדיה transfection סרום ללא ללא אנטיביוטיקה כך שכל בקבוק מכיל בהיקף כולל של 20-30 מ"ל.
   הערה: יחס של מבני גן עשוי לדרוש אופטימיזציה למשתמש. אמנם לא הפגין כאן, הליך transfection דומה שבוצע עם וירוס סינסיציאלי נשימה (RSV) F ו- HIV Gag ביחס של 1: 1. עבור פלסמידים ביטוי יחיד DENV ו CHIKV, סך של 20 מיקרוגרם של ה- DNA לכל בקבוק T-150 משמשים דואר אופטימליxpression. דנ"א: יחסי מגיב transfection מותאמים למשתמש. שימוש מומלץ בינוני transfection ויסות בשיטות transfection, כלומר, transfections שומני polycationic ממליץ הפחתה או העדר בסרום שור עובר ובכך תקשורת ניתן להשלים עם הורמוני גדילה ויסודות קורט כדי לתמוך בצמיחה בהעדר בסרום.
6. חזור צלוחיות על 37 מעלות צלזיוס עם חממת 5% CO _2. עבור נפח של 200 מ"ל, השתמש 9 T-150 צלוחיות. התאים נשמרים בינוני תרבות transfection עד יום קציר VLP.
7. supernatant תרבות קציר מתאי לאחר 72-96 שעות-transfection פוסט תלוי אנטיגן, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80%, כפי שהוערך על ידי בדיקה מיקרוסקופית. העברת supernatant לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ספין התאים למטה ב 500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר.
   הערה: החלפת supernatant 3 ימים עם תקשורת transfection מחומם מראש, סרום ללא טריה תאים חסידים יהיה yielמנה שנייה da של VLPs עם תשואה דומה או מופחת מעט צריכה להיות מותאמת על ידי משתמש.
8. supernatant ולסנן ברכה דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation.
9. בדוק את פעילות hemagglutination של VLPs HA-להביע ידי assay hemagglutination תקן ¹⁴ באמצעות טורקיה 0.8% או כדוריות דם אדומות יונקים או להמשיך עם ELISA אנטיגן ספציפי. ראה איור 2 תוצאות נציג.

2. ביטוי VLP לחי שימוש מערכת תא baculovirus / חרקים

1. צור baculovirus רקומביננטי להביע קפסיד Chikungunya וירוס וחלבוני מעטפה (C-E3-E2-6K-E1) מן זן S-27 באמצעות מערכת ביטוי baculovirus מסחרית.
2. תרבות Spodoptera frugiperda תאים Sf9 במדיום הגידול Sf9 סרום ללא עם 100 U / פניצילין מ"ל ו סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 28 ° C. השתמש 3-5 x 10 ⁵ ג / מ"ל ליזום תרבויות בקבוק טווה עבור suspensצמיחת תאי יון. המעבר שגרתי, כאשר הם מגיעים צפיפות התא של 2-4 x 10 ⁶ ג / מ"ל (כל 3-4 ימים).
3. Sf9 תרבות תאים בתרחיף צלוחיות טווות עם הערבוב ב 130 סל"ד על מערכת צלחת בוחש מרובה. עבור אוורור נאות, לשמור כרכי תרבות ללא יותר ממחצית הנפח של הבקבוק הטווה.
4. עבור הביטוי של הלחי VLPs, להדביק תאים Sf9 בצפיפות של 2 x 10 מ"ל ⁶ תאים / עם baculovirus רקומביננטי על ריבוי של זיהום של 1 ולחזור 28 ° C חממה. בדרך כלל, להדביק צלוחיות טווה אחד או שניים, המכיל 250 מ"ל תאים Sf9.
   הערה: למרות שאנו לא משתמשים בשיטה זו, תאי Sf9 עלולים להיות מתורבתים צלוחיות שייקרו ב 28 ° C באמצעות פלטפורמה שייקרה.
5. תרבויות קציר לאחר 72-96 שעות לאחר הפגיעה, או כאשר כדאיות התא ירדה ל 70-80% כפי שנקבע על ידי הכללת Trypan כחול על פי פרוטוקול של היצרן.
   הערה: התאים ממשיכים להתרבות בעוד נגוע וישכדאיות מצוינת ~ 80% בתרבויות Sf9 נגועים baculovirus הלחי VLP רקומביננטי ב 3 ימים לאחר פגיעה (dpi). תאים נגועים baculovirus גדולים במראה. מורפולוגיה עשויה גם לשנות מן הסיבוב כדי מלבני. In-בשלבים המאוחרים של זיהומים baculovirus, התאים החלו lyse.
6. העברת תרבויות ישירות מתרבות ההשעיה לתוך 50 מ"ל צינורות חרוטי ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °.
7. אסוף supernatants ולסנן דרך קרום 0.22 מיקרומטר נקבוביים לפני השקיעה באמצעות ultracentrifugation.

3. שקיעה / טיהור VLP / SVPs

1. לעקר 25 מ"מ x 89 מ"מ צינורות ultracentrifuge גג פתוח עם אתנול 70% במנדף בטיחות ביולוגית. ודא אתנול התייבש מעל לפני השימוש.
2. טען עד 32 מ"ל של supernatant לתוך צינור נקי. בהיקף מינימלי של 25 מ"ל מומלץ כדי למנוע קריסה ונזק של צינורות ultracentrifuge מולא כראוי.
3. בזהירות בבסיס שנינות supernatantsג 3 מ"ל 20% גליצרול סטרילי ב PBS (v / v). הפוך צינורות בטוחים מאוזנים.
4. ספין על 135,000 XG במשך 4 שעות ב 4 ° C.
5. לשאוב supernatant, הבטחת הגלולה לא לעקור מן הצינור.
6. Resuspend משקעים VLPs בתחתית הצינורות עם PBS סטרילי על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ. כמות PBS צריך resuspend VLPs תלוי תשואה חלבון VLP הכולל ויישומים במורד הזרם. בדרך כלל, resuspend כל גלולה VLP בלפחות 100 μl.
7. חנות דגימות 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר -80 ° C אחסון עבור אחסון לטווח ארוך.

4. קביעת תשואות חלבון ותשואות אנטיגן ספציפיות

1. קבע את תכולת החלבון הכולל בשיטת כימות חלבון מסחרית, כגון assay BCA לפי הפרוטוקול של היצרן.
2. כדי להעריך תוכן אנטיגן ספציפי, לבצע assay immunosorbent הישיר enzyme-linked (ELISA) על ידי ציפוי דילולים סידוריים של אנטיגן סטנדרטי 2-51; גרם של מדגם חלבון הכולל על צלחת ELISA 96-גם שטוח תחתונה.
   1. עקוב עם נוגדני אנטיגן ספציפי לחקור את הנוכחות של אנטיגנים על הצלחת ולהשתמש מצעי פיתוח ELISA קונבנציונליים לייצר ספיגה לזיהוי עבור קורא microplate. ראה איור 2 תוצאות נציג assay HA ו ELISA למדגם HA-להביע VLP; שילובים רבים של HA ו NA הם אולי אבל התשואות עשויות להיות שונות על תאימות HA-NA ^15.
      הערה: נוגדנים אנטיגן ספציפי יש זיקות משתנה ומומלץ כי טיטרציה דילול נקודת הסיום של נוגדנים להיקבע לפני ביצוע כימות VLP. נוגדנים מסחריים יצטרכו טווחי ריכוז או דילול מומלצים לשימוש ELISA, כמו גם פרוטוקולים שהציעו.

תוצאות

תשואות VLP היו משתנות על ידי עיצוב מבנה אנטיגן ויראלי. בפרוטוקול זה, אנו הוכחנו שימוש בתאי חרקים יונקים לייצור SVP או VLPs ב supernatant וטיהור על ידי ultracentrifugation. ארבעה תת-סוגים של DENV PRM / E קלטות ביטוי מבני גן ששמשו לבניית הגירסות של SVPs DENV (המסומן כמו 1-4) בלוח 1...

Discussion

השתמשנו הטכניקות המתוארות לעיל להביע בהצלחה ולטהר SVPs ו VLPs מורכבת של חלבונים מבניים מרובים עבור פתוגנים שונים. באופן כללי, אנו משתמשים במערכות ביטוי יונקים ליצור VLPs שלנו. עם זאת, בידינו, תאים יונקים נגזרים תשואות VLP לחי היו נמוכות. תשואת VLP לחי הייתה חזקה יותר בעת השימו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12163
DMEM	Cellgro	10-013
Lipofectamine	Life Technologies	L3000075	Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000
Opti-MEM I	Life Technologies	31985062
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016
Cimarec I 6 multipoint stirrer plate	ThermoFisher Scientific	50094596
Polyclear ultracentrifuge tubes	Seton	7025	Confirm appropriate tubes for ultracentrifuge and bucket size
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
Phosphate citrate buffer	Sigma	P4922
o-phenylenediamine dihydrochloride	Sigma	P8287
0.22 μm vacuum filter top (500 ml)	Nalgene	569-0020
Glycerol	Sigma	G5516
H2SO4	Sigma	339741
Sf-900 II SFM	ThermoFisher Scientific	10902-096