هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة

Summary

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Abstract

في الجراحة الترميمية، هناك حاجة السريرية عن بديل للطرق الحالية لإعادة الإعمار ذاتي التي هي معقدة ومكلفة والتجارة عيب واحد لآخر. هندسة الأنسجة مستقبل واعد لتلبية هذا الطلب المتزايد. ومع ذلك، تفشل معظم استراتيجيات هندسة الأنسجة لتوليد بدائل الأنسجة مستقرة وظيفية بسبب ضعف الأوعية الدموية. وتركز هذه الورقة على المجراة هندسة الأنسجة نموذج غرفة الأوعية الدموية الذاتية حيث يتم توجيه الشريان perfused والوريد إما حلقة شرياني أو تكوين عنيق التدفق من خلال داخل غرفة جوفاء المحمية. في هذا النظام القائم على غرفة يحدث تنتشر عائية من الأوعية الشريانية وهذا النظام يجذب الدماغية والتهابات مدفوعة هجرة الخلايا الذاتية التي تملأ تدريجيا مساحة الغرفة مع النسيج الليفي الوعائي. الخارجية خلية / غرس مصفوفة عند بناء غرفة يعزز سور خليةvival ويحدد خصوصية الأنسجة المهندسة والتي تتطور. وقد أظهرت دراستنا أن هذا النموذج الغرفة يمكن أن تولد الأنسجة المختلفة مثل الدهون والعضلات القلبية والكبد وغيرها بنجاح. ومع ذلك، هناك حاجة التعديلات والتحسينات لضمان النسيج المستهدف تشكيل ثابت واستنساخه. توضح هذه المقالة بروتوكول موحد لتصنيع اثنين من نماذج مختلفة الغرفة هندسة الأنسجة أوعية دموية في الجسم الحي.

Introduction

افتعال الأنسجة أوعية دموية الوظيفية باستخدام نهج هندسة الأنسجة هو النموذج الناشئ في مجال الطب التجديدي. ^1،2 العديد من المقاربات لهندسة أنسجة جديدة وصحية لاستبدال الأنسجة المصابة أو الأجهزة المعيبة تم تطويرها ^و3-6 تجريبيا في نماذج حيوانية صغيرة إمكانات واعدة السريرية. ^7،8 ومع ذلك، الأوعية الدموية لا تزال واحدة من التحديات الكبرى للهندسة الأنسجة الحد من قدرتها على النمو أنسجة حجم ذات الصلة سريريا. ⁹

النهج الحالية ليوعي الأنسجة اتبع إما مسار خارجي حيث تنمو سفن جديدة من السرير الوعائي المستفيدة وتغزو جميع أنحاء الأنسجة المزروعة يبني ¹⁰ أو مسار الأوعية الدموية جوهري حيث ينمو الأوعية الدموية ويوسع في انسجام تام مع الأنسجة النامية حديثا. ¹¹ نهج خارجي ينطوي عادة خلايا البذر على سقالةفي المختبر، وغرس بناء الكامل في الحيوانات الحية مع توقع أن المواد الغذائية، زودت من قبل وسائل الإعلام والثقافة، وسوف يكون مصدرها من التداول. ^12،13 مفهوم مبسط كما نشوب الأوعية الدموية بطيئة جدا وفقط يزرع رقيقة جدا (< سوف 1-2 مم) تبقى قابلة للحياة. توفير المواد الغذائية والأكسجين عن طريق الأوعية الدموية كافية والسريع هو في صميم أي محاولات ناجحة لزراعة بدائل أكثر تعقيدا وأكبر الأنسجة المهندسة مثل العظام والعضلات والدهون والأجهزة الصلبة، ويقدم ^14،15 الأوعية الدموية الجوهرية احتمال يبني أكبر لتطوير نمو الأنسجة التدريجي بما يتناسب مع زيادة امدادات الدم. تصميم واحد هو في الجسم الحي زرع في غرفة من عنيق الأوعية الدموية مع أو بدون خلية سقالة المصنفة. ^5،6 وقد أدى ذلك إلى تمهيد الطريق لإجراءات جديدة لتوليد سمكا الأنسجة أوعية دموية في جوهرها. ^16،17

وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت استراتيجيات ما قبل يوعي ترقيع الأنسجة، وذلك قبل الغرس. وتهدف شبكات الأوعية الدموية أدرجت هذه لتفممض مع السفن المضيف في غرس السماح لسرعة توفير إمدادات الدم الكامل لتحسين البقاء على قيد الحياة من جميع أجزاء من الكسب غير المشروع نسيج سميك المزروعة. ¹⁸

نحن رائدة في الجسم الحي أوعية دموية نموذج هندسة الأنسجة في الحيوانات الصغيرة التي تنطوي على تحت الجلد المزروع الغرفة المغلقة شبه الصلبة التي تحتوي على عنيق الأوعية الدموية perfused والحيوية التي تحتوي على الخلية. غرفة يخلق بيئة الدماغية التي تحفز تنتشر عائية من السفن زرعها. ³ عنيق الأوعية الدموية يمكن أن تكون إما حلقة شرياني أعيد بناؤها أو شريان تدفق من خلال سليمة والوريد. ^3-6،19 هذه الأوعية الدموية براعم عنيق على أداء والشريانية واسعة شبكة -capillary-الوريدية التي تربط في كل من الفنeriole وريدي ينتهي عنيق الأوعية الدموية. ^3،20 علاوة على ذلك، الغرفة دعم جوفاء المحيطة تحمي الأنسجة النامية من المحتمل تشويه القوى الميكانيكية ويطيل من محرك الدماغية لتعزيز الأوعية الدموية. ^3،21،22 إذا تم زرع عنيق سفينة ببساطة إلى الأنسجة الطبيعية وليس داخل الفضاء محمي من الغرفة، تنتشر عائية يتوقف على طول نفس الجدول الزمني كجرح عادي وليس أنسجة جديدة سوف تتراكم حول عنيق. وقد استخدم الباحثون هذا التكوين في الجسم الحي لإنتاج بنيات أوعية دموية وظيفية ثلاثية الأبعاد الأنسجة مع الأوعية الدموية داعمة والحجم ذات الصلة سريريا. ^4،23 علاوة على ذلك، ويبني أنسجة أوعية دموية هندسيا مع عنيق الأوعية الدموية سليمة لها يمكن أن تحصد لزرع لاحق في مكان الاصابه . ^24،25 شأنه أن سيناريو أكثر جدوى سريريا أن يخلق غرفة في موقع نهائي لاعادة اعماراوك والثدي. وبالتالي، يمكن لهذا دي نوفو نهج هندسة الأنسجة لديها امكانات السريرية لتوفير مصدر جديد من النسيج المستهدف وظيفية للجراحة الترميمية ^26-28

فإن بروتوكول التالية توفر المرشد العام لبناء في الجسم الحي أوعية دموية غرفة هندسة الأنسجة في الفئران، والتي يمكن تكييفها في نماذج حيوانية مختلفة، وتستخدم لدراسة العمليات المعقدة من الأوعية الدموية، وإنتاج مصفوفة، والهجرة الخلوية والتمايز.

Protocol

وقد تمت الموافقة على البروتوكولات المذكورة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوان في مستشفى ملبورن سانت فنسنت واستراليا، وكانت تجرى في إطار الالتزام الصارم للمبادئ التوجيهية للمجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية الاسترالية.

ملاحظة: يتم وصف بروتوكولين غرفة أدناه. ويوضح نماذج مختلفة وتصاميم غرفة معينة في الشكل 1. غرفة يرصد (1) من البولي (لنموذج غرفة الفئران شرياني حلقة). ومن أسطواني مع الداخلية قطرها 13 ملم وارتفاعه 4 مم. نافذة عند نقطة واحدة في الجدار يسمح بالوصول دون عوائق لعنيق. في النموذج الثاني (لالفئران التدفق من خلال عنيق نموذج غرفة)، ويتكون من غرفة polyacrylic وغير مستطيلة (10 × 8 × أبعاد 4 مم ³ الداخلية). فقد اثنين من 1.5 ملم فتحات على جانبي لاستيعاب شريان الفخذ والوريد لأنها تتعدى الغرفة.

1. الجرذ شرياني حلقة غرفة نموذج (واحد شامالبر لكل الحيوان)

ملاحظة: قبل بدء عملية جراحية، تأكد من أن جميع الصكوك تم تعقيمها بشكل صحيح. وبالمثل، وضمان بقية الأدوات على مناشف معقمة وهي على مسافة معقولة من حقل الجراحة لتجنب التلوث أثناء العملية.

1. إعداد الحيوان للجراحة
   1. استخدام الفئران وزنها لا يقل عن 250 غرام لحجمها الكبير من السفن لخلق حلقة شرياني.
   2. تخدير الحيوان مع استنشاق الأيزوفلورين 4٪. تأكيد عمق كاف من التخدير عن طريق تقييم تجاوب إلى أخمص قدميه قرصة. بعد التخدير، والحفاظ على الحيوانات تخدير كاف في جميع أنحاء الداخلي مع 2٪ الأيزوفلورين.
   3. وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة ظاهرة الاحتباس وتطبيق مواد التشحيم معقم للعين لمنع جفاف أثناء الجراحة.
   4. باستخدام الحلاقة الكهربائية، يحلق على حد سواء الخاصرتين وإزالة الشعر بقطعة من الشاش الرطب.
   5. الإعدادية مواقع الجراحية مع الكلورهيكسيدين/ 70٪ محلول الإيثانول وثنى الحيوان مع المناشف المعقمة. إدارة جرعة واحدة من كاربروفين (5 ملغ / كغ، تحت الجلد)، ومسكن.
2. حصاد الفخذ الوريد الكسب غير المشروع
   1. باستخدام شفرة رقم 15، وجعل شق الجلد 4 سم على موازاة الفخذ الأيسر إلى الرباط الإربي. هذا يعرض لوحة الدهون الأربية.
   2. قطع طريق لوحة الدهون محيطي مع مقص ترك الأمر تعلق على عنيق في الأوعية الدموية على أساس سفن شرسوفي.
   3. باستخدام المقص الصغير، تحرير التصاقات الأنسجة الضامة غشائي بين جدار البطن والأوعية الفخذ الأساسية.
   4. وضع ضام على جدار البطن وسحب إعلامي. هذا يفضح الرباط الإربي وطول كل من الأوعية الفخذ.
   5. باستخدام ملقط الصغيرة ومقص منحني تشريح الوريد شرسوفي وعزلها من الدهون المحيطة بها عن طريق سحب والقطع بلطف. يعمل هذا المنوال كما حبل عند بناء حلقة.
   6. النقيبز ملقط الصغيرة والمقص الصغير منحني فتح غمد ماحول الأوعية التي تحتوي على الأوعية الفخذية والعصبية على طول الطريق من الرباط الإربي إلى القاصي التشعب لفرع شرسوفي.
   7. باستخدام ملقط الجزئي، والتقاط الوريد الفخذي من البرانية وبلطف فصلها عن الأنسجة المحيطة بها والمرافق الشريان. القيام بذلك مع ملقط الصغيرة ومنحني المقص الصغير أشار ذهابا وعن طريق سحب الأنسجة، وبصرف النظر قطع من خلال ذلك.
      ملاحظة: أبدا الاستيلاء على سمك كامل من جدار الوريد لأن ذلك قد يسبب صدمة للالبطانية مما يجعلها عرضة للتخثر.
   8. فروع جانبية Ligate وجدت أثناء تشريح مع خياطة 10/0 النايلون أو تخثر لهم مخثار ثنائي القطب.
   9. مع الوريد الفخذي خالية تماما، ligate الداني والقاصي ينتهي مع 4/0 خيوط الحرير. تأكد من الحصول على الكسب غير المشروع الوريد لا يقل عن 10 ملم طول وتشمل حوالي 0.5 سم طول فرع شرسوفي لاستخدامها بمثابة حبل حبل الرجلعقد حلقة مفتوحة في الغرفة.
   10. باستخدام ملقط الصغيرة والمقص الصغير على التوالي، وتقليم البرانية من طرفي الكسب غير المشروع عن طريق سحب بلطف والقطع. ويمكن أيضا أن يتم ذلك في وقت لاحق، قبل مفاغرة المجهرية.
   11. تدفق الكسب غير المشروع الوريد بمحلول ملحي heparinized (10 U / مل من الهيبارين) وترك الأمر للراحة في الحل. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة.
3. إنشاء شرياني حلقة وزرع الغرفة
   1. كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.4 في نفس الطريقة بالضبط على الطرف المقابل.
   2. باستخدام ملقط الجزئي، تشريح وعزل كل من الشريان والوريد شرسوفي تشكيل لوحة الدهون المحيطة بها. القيام بذلك عن طريق سحب بلطف الأنسجة بعيدا عن السفن
   3. باستخدام ملقط الجزئي، والتقاط الشريان الفخذي بواسطة البرانية وتحريره من الأنسجة المحيطة بها. القيام بذلك مع ملقط الصغيرة ومنحني مستديرة مدببة هيئة التصنيع العسكريمقص ريال عماني عن طريق سحب الأنسجة، وبصرف النظر قطع من خلال ذلك. Ligate أو تخثر فروع جانبها.
   4. Ligate الشريان الفخذي والوريد البعيدة إلى ظهور الأوعية شرسوفية باستخدام 4/0 خياطة الحرير.
   5. وضع المشبك واحد قريب على كل من شريان الفخذ والوريد. باستخدام مقص حاد الصغيرة على التوالي، وجعل عرضية نظيفة قطع في كل القاصي السفينة إلى ظهور فروع شرسوفية. وضع خلفية تباين بلاستيكية معقمة تحت السفن.
   6. تدفق السفن بقوة مع كميات سخية من المياه المالحة heparinized حتى يتم إزالة كافة الدم من التجويف.
   7. جلب الكسب غير المشروع الوريد في حقل الجراحة وإزالة أي البرانية زائدة من نهايات الأوعية 'كما في الخطوة 1.2.10، إذا لزم الأمر.
   8. تنفيذ كل مفاغرة المجهرية مع خياطة 10/0 النايلون. يفاغر نهاية القريبة من الكسب غير المشروع الوريد إلى الوريد الفخذي ونهاية البعيدة إلى الشريان الفخذي. وهذا سوف يسمح بتدفق الدم وROM الشرياني إلى الجانب الوريدي دون مقاومة من الصمامات داخل الأوردة الكسب غير المشروع.
      ملاحظة: تأكد من أن السفن الفخذ والوريد الكسب غير المشروع بقية في موقفهم الطبيعي دون أي التقلبات.
   9. تحقق من وجود تسرب في كلا الموقعين المفاغرة. حل التسريبات الصغيرة، التي تبدو وكأنها غير النابض الدم يسيل من موقع توصيلي، عن طريق وضع قطعة صغيرة من الدهون على أعلى وضغط بلطف لمدة 5-10 دقائق. وأكبر تسرب النابض أن الفيضانات بسرعة الحقل بأكمله يحتاج غرز إضافية.
   10. تحقق المباح من الحلقة شرياني. انسداد طيف من الشريان الفخذي ينبغي أن تجعل من انكماش في حين أن نفس الشيء في الوريد الفخذي ينبغي أن التهم عليه.
   11. وضع قاعدة للغرفة هندسة الأنسجة تحت حلقة شرياني مع يستريح الأخيرة في موقفها الطبيعي دون التقلبات أو مكامن الخلل.
   12. تأمين قاعدة من الغرفة إلى الرباط الإربي والكامنة لفافة العضلات مع 6/0 خيوط النايلون.
   13. وضع غطاء علىالقاعدة بحيث الأوعية الفخذ تدخل الغرفة من خلال تحقيقها (نافذة في جانب من الغرفة). عند إغلاق الغطاء، والتأكد من أنها ملفتة للفروع شرسوفي، بين القاعدة الغرفة وغطاء، والتي تكون بمثابة الحبال لعقد حلقة شرياني في الموقف.
   14. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة.
   15. السماح للحيوان للتعافي من التخدير على وسادة الاحترار.
   16. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. وبالمثل، لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. بعد 24 ساعة، إدارة جرعة أخرى واحدة من كاربروفين (5 ملغ / كغ، تحت الجلد)، ومسكن.
   17. علاج الجرح مع مرهم مضاد حيوي موضعي لمدة 5 أيام. إذا تم فتح الجرح، تخدير الحيوان كما في الخطوة 1.1.2 خلال 1.1.5 وإغلاق الجرح كما هو الحال في 1.30.14. مراقبة صحة الحيوان يوميا. الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة قاتلة من حقن lethabarb داخل الصفاق (163 ملغ / كغ في 0.25 مل بنسبة 23 إبرة G) إذا تبين للحيوان أكثر من علامات معتدلة من inacitivity، فقدان الشهية، وفقدان الوزن وفقدان اللون.

2. تدفق من خلال غرفة عنيق (اثنان غرف في الحيوان)

1. إعداد الحيوان للجراحة
   1. كرر الخطوات من 1.1.1 خلال 1.1.4. يمكن زرع غرفتين في كل من مناطق الفخذ من الفئران واحد.
2. عزل سفن الفخذ والإدراج للغرفة
   1. كرر الخطوات من 1.2.1 خلال 1.2.8.
   2. مع كل من الشريان والوريد سراح تماما من الأنسجة المحيطة بها وفروعها ligated، وجلب الغرفة في مجال الجراحة.
   3. وضع كل من الأوعية الفخذ سليمة على شق المقابلة للقاعدة الغرفة والتأكد من عدم وجود التقلبات أو مكامن الخلل.
   4. إغلاق الغرفة عن طريق attachiنانوغرام غطاء للقاعدة. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة والسماح للحيوان لاسترداد كما هو موضح سابقا.

3. حصاد الدوائر ومعالجة الأنسجة

1. مرة واحدة يتم الوصول إلى نقطة زمنية في التجربة (4-6 أسابيع بعد الزرع)، تخدير الحيوان كما في الخطوة 1.1.2 وكرر الخطوات من 1.1.3 خلال 1.1.5.
2. فتح الجرح باستخدام شفرة رقم 15 وقطع طريق الأنسجة مع مقص حتى يتعرض الغرفة تماما.
3. فضح الأوعية الفخذ الأقرب إلى بناء واختبار لالمباح الأوعية الدموية: انسداد بلطف السفينة مع اثنين من microforceps، ثم الألبان والدم في اتجاه القاصي وأخيرا الافراج عن ملقط القريبة. إذا تملأ وعاء مع الدم مرة أخرى، وهذا يؤكد المباح. Ligate الأوعية الفخذ قريب في حالة من الحلقة شرياني وكلاهما قريب وبشكل أقصى في حالة من اله التدفق من خلال التكوين، وإزالة غرف مع تحتوي على الأنسجة ككل.
4. في نهاية التجربة، الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة قاتلة من حقن lethobarb داخل الصفاق (163 ملغ / كغ في 0.25 مل بنسبة 23 إبرة G).
5. إصلاح الأنسجة في 4٪ امتصاص العرق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. الأنسجة تقسيمها إلى أقسام عرضية متعددة (1-2 مم) وتضمينها في شمع البارافين أو الأمثل مجمع درجة حرارة القطع لأقسام البارافين (5 ميكرون) أو أقسام المجمدة (10 ميكرون)، على التوالي. ^{3،4،8،17،22، 24}
6. أداء تلطيخ النسيجي الروتينية مثل الهيماتوكسيلين ويوزين لدراسة مورفولوجية العام للأنسجة. أداء تلطيخ المناعى مع الأجسام المضادة المحددة لتحديد نوع الخلية من الفائدة، ^{3،4،8،17،22،24،29} على سبيل المثال التروبونين القلبي T المناعية للالعضلية.

النتائج

تم تنفيذ إنشاء المجهرية غرف هندسة الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. الأنسجة المولدة داخل غرف يمكن فحص تشريحيا كما وصف في خطوة بروتوكول تم 3. أنواع الأنسجة المختلفة هندسيا بنجاح باستخدام المجراة غرفة أوعية دموية (الشكل 2). وتشمل ه?...

Discussion

ويجري حاليا التحقيق في الهندسة من دوران الأوعية الدقيقة أساسا من خلال نهجين. الأول ينطوي على تطوير شبكة الأوعية الدموية المتشابكة للغاية ضمن التركيبة في المختبر بحيث عندما زرعت، الشعيرات الدموية من السرير الوعائي المضيفة التواصل مع تلك التي زرعها بناء من خلال ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells