Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

Resumen

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Resumen

En la cirugía reconstructiva, existe una necesidad clínica de una alternativa a los métodos actuales de reconstrucción autóloga que son complejos, costosos y el comercio un defecto para otro. La ingeniería de tejidos mantiene la promesa para hacer frente a esta creciente demanda. Sin embargo, la mayoría de las estrategias de ingeniería de tejidos no logran generar sustitutos de tejidos estables y funcionales debido a la mala vascularización. Este documento se centra en un modelo de cámara de la ingeniería de tejidos in vivo de la vascularización intrínseca de una arteria y una vena perfundido ya sea como un asa arteriovenosa o una configuración de flujo a través del pedículo se dirige dentro de una cámara hueca protegida. En este sistema basado en cámara de germinación angiogénico se produce a partir de los vasos arteriovenosas y este sistema atrae la migración celular endógeno isquémica e inflamatoria impulsado que llena gradualmente el espacio de la cámara con el tejido fibro-vascular. celular exógena / implantación de la matriz en el momento de la construcción de la cámara aumenta sur celularsupervivencia y determina la especificidad de los tejidos de ingeniería que se desarrollan. Nuestros estudios han demostrado que este modelo de cámara puede generar con éxito diferentes tejidos tales como la grasa, el músculo cardíaco, el hígado y otros. Sin embargo, se requieren modificaciones y mejoras para garantizar la formación de tejido diana es consistente y reproducible. En este artículo se describe un protocolo estandarizado para la fabricación de dos modelos de cámara ingeniería de tejidos vascularizados diferentes in vivo.

Introducción

La fabricación de tejido vascularizado funcional utilizando un enfoque de la ingeniería de tejidos es un paradigma emergente en la medicina regenerativa. ^1,2 Muchos enfoques para diseñar tejido nuevo y sano para el reemplazo de tejido lesionado o órganos defectuosos se han desarrollado de forma experimental, ^3-6 en pequeños modelos animales con potencial clínico prometedor. ^7,8 Sin embargo, la vascularización sigue siendo uno de los grandes desafíos para la ingeniería de tejidos, limitando su potencial para crecer tejidos de tamaño clínicamente relevante. ⁹

Los enfoques actuales para vascularizar tejidos seguir ya sea una vía extrínseca donde los nuevos vasos crecen desde el lecho vascular receptor e invaden todo el tejido implantado construye ¹⁰ o una vía vascularización intrínseca donde la vasculatura crece y se expande al unísono con el tejido de reciente desarrollo. ¹¹ El enfoque extrínseca tradicionalmente involucra células de siembra en un andamioin vitro y la implantación de la construcción completa en el animal vivo con la expectativa de que los nutrientes, suministradas previamente por los medios de cultivo, se obtiene de la circulación. ^12,13 El concepto es simple como crecimiento vascular es demasiado lento y sólo implantes muy delgadas (< 1-2 mm de espesor) seguirá siendo viable. El aporte de nutrientes y oxígeno a través de una vascularización suficiente y rápida está en el corazón de todos los intentos exitosos para crecer sustitutos de ingeniería tisular más complejos y de mayor tamaño, como los huesos, los músculos, la grasa y los órganos sólidos. ^14,15 vascularización intrínseca ofrece la posibilidad de construcciones más grandes a desarrollar por el crecimiento tisular progresiva acorde con la expansión de su suministro de sangre. Un diseño es la implantación in vivo en una cámara de un pedículo vascular con o sin un andamio sembrado celular. ^5,6 Esto ha allanado el camino a nuevos procedimientos para la generación de tejidos vascularizados intrínsecamente más gruesas. ^16,17

Más recientemente, se han desarrollado estrategias para pre-vascularizan injertos de tejido, antes de la implantación. Estas redes de vasos sanguíneos incorporados están dirigidos a inosculate con vasos de acogida en la implantación que permitan la rápida provisión de un suministro de sangre completa para mejorar la supervivencia de todas las partes de un injerto de tejido grueso trasplantado. ¹⁸

Fuimos pioneros en un modelo in vivo vascularizado ingeniería de tejidos en animales pequeños, que involucra una cámara cerrada semi-rígido implantado subcutáneamente que contiene un pedículo vascular perfundido y biomateriales que contienen células. La cámara crea un ambiente isquémico que estimula la germinación de los vasos angiogénicos implantados. ³ El pedículo vascular puede ser o bien un bucle arteriovenosa reconstruida o una arteria de flujo a través intacta y la vena. ^3-6,19 Este vasculares brotes pediculares un funcionamiento y una amplia arterio -capillary red venosa que une en el arteeriole y venoso termina con el pedículo vascular. ^3,20 Además, la cámara de soporte hueco que rodea protege el tejido en desarrollo de la deformación potencialmente fuerzas mecánicas y prolonga la unidad isquémico para mejorar la vascularización. ^3,21,22 Si el pedículo recipiente simplemente se implanta en tejido normal y no dentro del espacio protegido de la cámara, el brote angiogénico cesa a lo largo de la misma línea de tiempo como una herida normal y no hay nuevos tejidos se acumulan alrededor del pedículo. Los investigadores han utilizado esta configuración in vivo para producir construcciones de tejido vascularizado funcionales tridimensionales con vasculatura de apoyo y de tamaño clínicamente relevante. ^4,23 Por otra parte, las construcciones de tejido vascularizado de ingeniería con su pedículo vascular intacto se pueden cosechar para posterior trasplante en el sitio de la lesión ^24,25. Un escenario más clínicamente factible sería la creación de la cámara en el lugar definitivo para la reconstrucción sUCH como el de mama. Por lo tanto, este enfoque de novo la ingeniería de tejidos podría tener potencial clínico para proporcionar una nueva fuente de tejido diana funcional para la cirugía reconstructiva. ^26-28

El siguiente protocolo proporcionará una guía general para la construcción de una cámara de la ingeniería de tejidos vascularizado in vivo en la rata, que podría adaptarse en diferentes modelos animales y se emplea para examinar los procesos complejos de la angiogénesis, la producción de la matriz, y la migración celular y la diferenciación.

Protocolo

Los protocolos descritos aquí han sido aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital St. Vincent de Melbourne, Australia, y se llevaron a cabo bajo una estricta adherencia a las directrices del Consejo de Investigación Médica y Salud Nacional de Australia.

NOTA: Dos protocolos de la cámara se describen a continuación. Los dos modelos diferentes y sus diseños de cámara específicos se ilustran en la Figura 1. Cámara (1) está hecha de policarbonato (para el modelo de cámara bucle arteriovenosa rata). Su forma es cilíndrica con un diámetro 13 mm interno y altura 4 mm. Una ventana en un punto en la pared permite el acceso libre del pedículo. En el segundo modelo (por flujo a través del pedículo rata modelo de cámara), la cámara está hecha de acrílico y es rectangular (10 x dimensiones de 8 x 4 mm ³ internos). Tiene dos aberturas de 1,5 mm en los lados opuestos para acomodar la arteria femoral y la vena, ya que traspasan la cámara.

1. Rata arteriovenosa Loop Cámara Modelo (Una Chamber por animal)

NOTA: Antes de iniciar la cirugía, asegúrese de que todos los instrumentos han sido esterilizados adecuadamente. Del mismo modo, garantizar la instrumentos resto en las toallas estériles y están a una distancia razonable del campo quirúrgico para evitar la contaminación durante el procedimiento.

1. Preparación del animal para la cirugía
   1. Utilice las ratas con un peso mínimo de 250 gramos por su gran tamaño de los vasos para la creación del asa arteriovenosa.
   2. Anestesiar al animal con 4% de inhalación de isoflurano. Corroborar la adecuada profundidad de la anestesia mediante la evaluación de la falta de respuesta a los pies-pellizco. Después de la anestesia, mantener al animal anestesiado adecuadamente durante todo el procedimiento con isoflurano al 2%.
   3. Colocar el animal en posición supina sobre una almohadilla de calentamiento y aplicar lubricante estéril para los ojos para evitar la desecación durante la cirugía.
   4. El uso de una máquina de afeitar eléctrica, afeitarse ambas ingles y eliminar el vello con un trozo de gasa húmeda.
   5. Prepara los sitios quirúrgicos con clorhexidina/ Solución de etanol al 70% y la caída del animal con toallas estériles. Administrar una sola dosis de carprofeno (5 mg / kg, vía subcutánea) como analgésico.
2. Cosecha de la vena femoral del injerto
   1. Utilizando una cuchilla # 15, hacer una incisión en la piel de 4 cm de largo en la ingle izquierda paralelo al ligamento inguinal. Esto expone la almohadilla de grasa inguinal.
   2. Corte a través de la almohadilla de grasa circunferencialmente con unas tijeras dejando lo saque de su pedículo vascular basado en los vasos epigástricos.
   3. Usando tijeras micro, liberar las adherencias del tejido conectivo membranosas entre la pared abdominal y vasos femorales subyacentes.
   4. Coloque un retractor en la pared abdominal y tire en sentido medial. Esto expone el ligamento inguinal y toda la longitud de los vasos femorales.
   5. El uso de micro fórceps y tijeras curvas diseccionar la vena epigástrica y aislarlo de la grasa que rodea y tirando suavemente de corte. Esta vena actúa como una correa de sujeción en la construcción de bucle.
   6. using micro pinzas y tijeras curvadas micro abren la vaina perivascular que contiene los vasos femorales y los nervios de todo el camino desde el ligamento inguinal hasta su bifurcación distal a la rama epigástrica.
   7. El uso de micro fórceps, recoger la vena femoral por su adventicia y suavemente separarlo de los tejidos circundantes y la arteria que acompaña. Hacer esto con micro fórceps y tijeras curvadas micro puntas redondas por tirar del tejido aparte y cortar a través de él.
      NOTA: Nunca agarrar todo el espesor de la pared de la vena ya que esto podría causar un trauma a la íntima por lo que es propenso a la trombosis.
   8. Se ligan las ramas laterales encontraron durante la disección con sutura de nylon 10/0 o coagulan con un coagulador bipolar.
   9. Con la vena femoral completamente gratis, ligar sus extremos proximal y distal con suturas de seda 4/0. Asegúrese de obtener un injerto de vena de al menos 10 mm de longitud e incluye aproximadamente 0,5 cm de longitud de la rama epigástrica para ser utilizado como una correa de sujeción tipo cuerdapara mantener el circuito abierto en la cámara.
   10. El uso de micro pinzas y tijeras micro rectas, recortar la adventicia de los extremos del injerto tirando suavemente y corte. Esto también se puede hacer más tarde, antes de anastomosis microquirúrgicas.
   11. Enjuague bien el injerto de vena con solución salina heparinizada (10 U / ml de heparina) y se deja reposar en la solución. Cerrar la herida con un funcionamiento continuo 4/0 sutura de seda más dos o tres puntos interrumpidos simples adicionales.
3. Creación de arteriovenosa Loop y la implantación de la Cámara
   1. Repita los pasos 1.2.1 a 1.2.4 de la misma manera exacta en la extremidad contralateral.
   2. El uso de micro fórceps, diseccionar y aislar tanto la arteria y la vena epigástrica formar la capa de grasa que rodea. Para ello, tirando suavemente el tejido lejos de los vasos
   3. El uso de micro fórceps, recoger la arteria femoral por su adventicia y liberarla de los tejidos circundantes. Hacer esto con micro fórceps y micro-redonda en punta curvadatijeras ro tirando el tejido aparte y cortar a través de él. Ligar o coagular sus ramas laterales.
   4. Ligar la arteria femoral y la vena distal a la aparición de los vasos epigástricos utilizando sutura de seda 4/0.
   5. Colocar una sola pinza proximal en cada uno de la arteria femoral y la vena. Usando una tijera afilada micro recta, transversal hacer un corte limpio en cada vaso distal a la aparición de las ramas epigástricos. Colocar un fondo de contraste de plástico estéril debajo de los buques.
   6. Enjuague los vasos vigorosamente con cantidades generosas de solución salina heparinizada hasta que toda la sangre se retira del lumen.
   7. Llevar el injerto de vena en el campo operatorio y eliminar cualquier adventicia redundante de los extremos de los buques como en el paso 1.2.10, si es necesario.
   8. Realizar ambas anastomosis microquirúrgica con sutura de nylon 10/0. Anastomosan el extremo proximal del injerto de vena a la vena femoral y el extremo distal a la arteria femoral. Esto permitirá que la sangre fluya fesde la arterial al lado venoso sin resistencia por parte de las válvulas dentro de la vena del injerto.
      NOTA: Asegúrese de que los vasos femorales y el injerto de vena reposo en su posición natural sin ningún tipo de giros.
   9. Compruebe si hay fugas en ambos sitios de anastomosis. Resolver las fugas pequeñas, que parecen no pulsante de la sangre que sale del lugar de la anastomosis, mediante la colocación de un pequeño trozo de grasa en la parte superior y suavemente comprimir durante 5-10 minutos. Grandes fugas pulsantes que inundan rápidamente todo el campo necesitarán puntos adicionales.
   10. Comprobar la permeabilidad del asa arteriovenosa. oclusión suave de la arteria femoral debe hacerlo encoge mientras que el mismo en la vena femoral debe engorge ella.
   11. Colocar la base de la cámara de la ingeniería de tejidos bajo el asa arteriovenosa con este último en reposo en su posición natural, sin giros o torceduras.
   12. Fije la base de la cámara al ligamento inguinal y la fascia muscular subyacente con suturas de nylon 6/0.
   13. Coloque la tapa sobre labase de manera que los vasos femorales entran en la cámara a través de una muesca (ventana en el lado de la cámara). Al cerrar la tapa, asegúrese de que las capturas las ramas epigástricos, entre la base de la cámara y la tapa, que actúan como correas de sujeción para sujetar el asa arteriovenosa en su posición.
   14. Cerrar la herida con un funcionamiento continuo 4/0 sutura de seda más dos o tres puntos interrumpidos simples adicionales.
   15. Deje que el animal se recupere de la anestesia en un cojín de calentamiento.
   16. No dejar al animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Del mismo modo, no devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado. 24 horas más tarde, administrar otra dosis única de carprofeno (5 mg / kg, vía subcutánea) como analgésico.
   17. Tratar la herida con un ungüento antibiótico tópico durante 5 días. Si se abre la herida, anestesiar al animal como en el paso 1.1.2 a través de 1.1.5 y cerrar la herida como en 1.30.14. Controlar la salud de los animales todos los días. La eutanasia del animal usando una dosis letal de la inyección intraperitoneal lethabarb (163 mg / kg en 0,25 ml por 23 agujas G) si el animal muestra más de un signos moderados de inacitivity, falta de apetito, pérdida de peso y pérdida de color.

2. El flujo a través de la Cámara de pedículo (dos cámaras por animal)

1. Preparación del animal para la cirugía
   1. Repita los pasos 1.1.1 a 1.1.4. Dos cámaras se pueden implantar en las dos regiones de la ingle de una sola rata.
2. Aislamiento de vasos femorales y la inserción de la Cámara
   1. Repita los pasos 1.2.1 a través de 1.2.8.
   2. Con ambos arteria y la vena completamente liberado de los tejidos circundantes y sus ramas se ligó, llevar la cámara en el campo operatorio.
   3. Coloque cada uno de los vasos femorales intactas en la correspondiente ranura de asegurarse de que no hay torceduras o dobleces de la base de la cámara.
   4. Cerrar la cámara por attaching de la tapa a la base. Cierre de la herida utilizando un funcionamiento continuo 4/0 sutura de seda más dos o tres puntos de sutura interrumpidas simples adicionales y permitir que el animal se recupere como se describió previamente.

3. Cosecha de Cámaras y procesamiento de tejido

1. Una vez que se alcanzan los puntos de tiempo del experimento (4-6 semanas después de la implantación), anestesiar al animal como en el paso 1.1.2 y repetir los pasos 1.1.3 a través de 1.1.5.
2. Abra la herida usando una cuchilla # 15 y cortar a través de los tejidos con tijeras hasta que la cámara está completamente expuesto.
3. Exponer los vasos femorales proximales a la construcción y prueba de la permeabilidad vascular: ocluye suavemente el recipiente con dos microforceps, a continuación, la leche de la sangre en una dirección distal y finalmente liberar la pinza proximal. Si el recipiente se llena de sangre de nuevo, esto confirma la permeabilidad. Ligar los vasos femorales proximalmente en el caso del bucle arteriovenosa y ambos proximal y distalmente en el caso de THe flujo a través de la configuración, y quitar las cámaras con el tejido que contiene en bloque.
4. Al final del experimento, la eutanasia del animal usando una dosis letal de inyección lethobarb intraperitoneal (163 mg / kg en 0,25 ml por 23 aguja G).
5. Fijar los tejidos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 24 hr. Divida a los tejidos múltiples secciones transversales (1-2 mm de espesor) y embed de cera de parafina o compuesto de temperatura óptima de corte para las secciones de parafina (5 micras) o secciones congeladas (10 micras), respectivamente. ^{3,4,8,17,22, 24}
6. Realizar la tinción histológica de rutina, tales como hematoxilina y eosina para examinar la morfología general de los tejidos. Realizar la tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo específico para identificar el tipo de célula de interés, por ejemplo ^{3,4,8,17,22,24,29} troponina T cardiaca inmunotinción de los cardiomiocitos.

Resultados

Se realizó la creación microquirúrgico de cámaras de ingeniería de tejidos como se describe en el protocolo anterior. Los tejidos generados dentro de las cámaras pueden ser examinados histológicamente como describen en el paso protocolo 3. Varios tipos de tejidos han sido diseñados con éxito utilizando la cámara de vascularizado in vivo (Figura 2). Estos incluyen el tejido cardíaco con los cardiomiocitos neonatales de rata (Figura 2a),

Discusión

Ingeniería de la microcirculación está siendo investigado actualmente fundamentalmente a través de dos enfoques. El primero implica el desarrollo de una red vascular altamente interconectada dentro de la construcción in vitro de manera que cuando se implanta, los capilares de la cama vascular anfitrión se conectan con los de la trasplantado construir a través de un proceso llamado inosculation, asegurando así el suministro de nutrientes no sólo a la periferia pero también para el núcleo. ^21,32,3...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells