在组织工程由内在血管化<em&gt;在体内</em&gt;组织工程商会

摘要

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

摘要

在重建手术，有临床需要的替代自体重建的目前的方法这是复杂，昂贵和贸易一个缺陷另一个。组织工程有望的承诺来解决这一不断增长的需求。然而，大多数组织工程的战略不能产生，因为血管不佳的稳定和功能的组织替代品。本文的重点固有血管形成，其中一个灌注动脉和静脉无论是作为静脉循环或流动通过椎弓根配置是针对受保护的中空室内部的体内组织工程室模型。在此基础室系统的血管生成萌芽从动静脉血管发生，并且该系统吸引了缺血性和炎症性驱动，内生细胞的迁移，逐渐填满了成纤维血管组织室内空间。外源性细胞/在室内施工时矩阵植入增强细胞河畔存活率并确定工程化组织其发展的特异性。我们的研究表明，这种模型室可以成功产生不同组织如​​脂肪，心肌，肝脏等。然而，需要修改和改进，以确保目标组织的形成是一致的和可重复的。本文介绍了两种不同的血管组织工程室模型体内制造的标准化协议。

引言

制造使用组织工程方法官能血管化组织的再生医疗的新兴的范例^。1,2-许多方法来设计新的，健康的组织用于更换损伤组织或有缺陷的器官已经开发^，3-6实验小动物模型有前途的临床潜力^，7,8然而，血管仍然是组织工程限制其增长潜力的临床相关的规模组织中的巨大挑战之一^。9

当前方法血管化组织遵循任一个外在途径，其中新血管从收件人血管床生长和侵入整个植入组织构造¹⁰或在脉管生长并用新显影组织一致膨胀的特性血管通路¹¹的外在途径传统上涉及种子细胞到支架在体外和植入完整的构建与营养物质，以文化传媒之前提供期望的活的动物，会从循环进行采购^。12,13概念是简单的血管内生长太慢，只有非常薄的植入物（< 1-2毫米厚）会保持可行性。通过充分的和快速的血管的装置提供营养和氧气是在任何成功尝试变得越来越复杂，以及较大的组织工程化的替代品，例如骨骼，肌肉，脂肪和实体器官的心脏^。14,15内在血管提供了潜在的较大的结构进行性组织生长与不断扩大的血液供应相当的发展。一种设计是在体内植入到血管蒂的具有或不具有细胞接种的支架的腔室^。5,6-这种铺平了道路，为较厚本质血管化组织的生成的新程序^。16,17

最近，人们已经开发预血管化组织移植，植入之前。这些合并血管网络的目的是与植入血管主机允许一个完整的血液供应的快速提供，提高移植厚的组织移植的所有部分的生存inosculate ¹⁸

我们率先在小动物体内血管化组织工程模型，它涉及含灌注血管蒂和含有细胞的生物材料一皮下植入半刚性封闭室。腔室产生刺激来自植入血管血管生成萌芽缺血环境³的血管蒂可以是一个重构的静脉循环或一个完整的流通动脉和静脉^。3-6,19此血管蒂豆芽一个运作和广泛动这在两个艺术链接-capillary，静脉网eriole和静脉的血管蒂而且结束^。3,20，周围的中空支撑腔的机械力可能变形保护发展组织，延长了缺血性驱动器来增强血管^。3,21,22如果血管蒂被简单地植入到正常组织，而不是腔室的受保护的空间内，血管生成萌芽沿同一时间轴作为一个正常的伤口和没有新的组织将累积周围椎弓根停止。研究者已经用这种体内配置以产生具有和临床相关大小的支持性血管三维官能血管化组织构建体^。4,23此外，以其完整的血管蒂的工程化血管化组织构建物可收获在损伤部位后续移植^24,25更临床可行方案将在确定的网站重建s内创建室UCH的乳房。因此，这个新生组织工程学的方法可能有临床应用前景提供功能靶组织重建手术的新来源^。26-28

以下方案将提供一般的指导在大鼠，它可适于在不同的动物模型，并用来检查血管生成，基质产生，和细胞迁移和分化的复杂的过程来构造的体内血管组织工程室中。

研究方案

这里所描述的协议已经批准了圣文森特医院墨尔本，澳大利亚的动物伦理委员会，并在严格遵守进行了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会准则。

注意:两个腔室的协议如下所述。在两个不同的模型以及它们特定的腔室的设计在图1中示出。腔室（1）由聚碳酸酯（大鼠动静脉回路腔室模型）的。它是圆柱形的，其内部13mm直径和高度4毫米。在墙上一个点的窗口允许蒂通行无阻。在第二个模型（大鼠流通椎弓根室模型），该腔室是由聚丙烯，并且是长方形的（10×8×4mm的³的内部尺寸）。它具有在相对侧2个1.5毫米筛孔以容纳股动脉和静脉，因为他们犯室中。

1.鼠动静脉环形腔模型（一湛BER每动物）

注:在开始手术，确保所有的仪器已妥善消毒。同样地，确保在无菌巾仪器休息和是在从手术领域一个合理的距离，以避免在操作过程中的污染。

1. 动物准备手术
   1. 使用大鼠，体重至少250克创造的动静脉循环的其大尺寸的船只。
   2. 麻醉用4％的异氟醚吸入动物。通过评估反应迟钝到脚趾捏证实麻醉深度足够。麻醉后，保持在全国各地设有2％异氟醚的程序充分麻醉动物。
   3. 放置动物在对某变暖垫仰卧位置并应用无菌润滑剂的眼睛，以防止在手术过程中干燥。
   4. 使用电动剃须刀，剃既腹股沟和用一块湿纱布除去毛发。
   5. 准备用洗必泰外科网站/ 70％乙醇溶液和悬垂性用无菌毛巾动物。管理卡洛芬单剂量（5毫克/千克，皮下），为镇痛药。
2. 股静脉移植收获
   1. 用＃15刀片，使在平行于腹股沟韧带左侧腹股沟一个4厘米长的皮肤切口。这暴露腹股沟脂肪垫。
   2. 通过脂肪垫用剪刀离开它连接到其血管蒂的基础上上腹船只沿圆周切割。
   3. 采用微型剪刀，释放腹壁和基本股血管的结缔组织薄膜组织粘连。
   4. 放在腹壁牵开和内侧拉。这暴露腹股沟韧带和股血管的整个长度。
   5. 采用微型镊子和弯剪解剖上腹部静脉和其周围脂肪孤立它轻轻拉动和切割。这静脉构建循环时充当系绳。
   6. 使用设G微型镊子和弯曲微剪刀打开包含股血管和神经从腹股沟韧带分叉远端分支上腹一路血管周围鞘。
   7. 使用微型镊子，其外膜拿起股静脉并轻轻它从周围组织中分离和伴随动脉。与微型镊子和弧形圆尖微剪刀被拉开的组织，并通过它切割做到这一点。
      注意:不要抢静脉壁的整个厚度，这样可能会损伤到内膜使其容易发生血栓形成。
   8. 用10/0尼龙线在解剖过程中发现或双极电凝凝他们结扎侧枝。
   9. 与股静脉完全免费的，结扎其近端和远端用4/0丝缝线。确保获得至少10毫米长的静脉移植物，包括大约要使用的胃脘支0.5厘米长的一个家伙绳系绳以保持循环在腔室打开。
   10. 使用微型镊子直显微剪，轻轻拉动和切割修整从移植物的两端的外膜。这也可以稍后进行，显微吻合之前。
   11. 同花顺肝素生理盐水溶液（10 U / ml的肝素）的静脉移植，并把它留在溶液中休息。采用连续运行4/0丝线缝合加上两个或三个额外的单纯间断缝合关闭伤口。
3. 商会动静脉循环和植入的创建
   1. 重复步骤1.2.1在对侧肢体完全相同的方式1.2.4。
   2. 使用微型镊子，解剖和隔离都上腹动脉和静脉形成周围的脂肪垫。通过轻轻地从容器拉离组织这样做
   3. 使用微型镊子，拿起它的外膜股动脉和自由从周围组织。与微型镊子和弧形圆尖话筒做到这一点ロ剪刀由拉开的组织，并通过它切割。结扎或凝固的侧枝。
   4. 结扎的股动脉和远端静脉用4/0丝线缝合腹壁血管的出现。
   5. 将单页夹近端在每个股动脉和静脉。用一把锋利的直线微剪刀，做一个干净的横向切割在每个容器远端分支胃脘的出现。放置血管下的无菌塑料对比的背景。
   6. 慷慨量肝素化盐水的大力冲洗容器，直到所有的血液从腔中移除。
   7. 把静脉移植到手术视野，并从船'端任何多余的外膜按照步骤1.2.10，如果需要的话。
   8. 执行与10/0尼龙线都显微吻合。吻合的静脉移植物的股静脉和远端到股动脉的近端。这将允许血液流FROM动脉到静脉侧未经移植静脉内瓣膜性。
      注意:确保股血管，并在其自然位置的静脉移植其余没有任何波折。
   9. 检查在两个吻合口漏。 ，通过放置在顶部的小片的脂肪和5-10分钟轻轻压缩解决小的泄漏，这看起来像非脉动血出来吻合部位的。这迅速淹没了整场较大的脉动泄漏将需要额外的针。
   10. 检查动静脉循环的通畅。股动脉的温和闭塞应使其收缩而在股静脉同样应该充盈它。
   11. 放置组织工程室的底部与在其天然位置后者静止而不扭曲或扭结的静脉循环下。
   12. 腔室的底部固定到腹股沟韧带和下面的肌肉筋膜与6/0尼龙缝线。
   13. 将在盖子碱以使股血管通过一个凹口进入腔室（在该室的侧面窗口）。当关闭盖子，确保它捕获胃脘分支机构，腔底座和盖子，它作为绳索举行动静脉循环到位的。
   14. 采用连续运行4/0丝线缝合加上两个或三个额外的单纯间断缝合关闭伤口。
   15. 让动物从麻醉对变暖垫恢复。
   16. 不要离开无人看管的动物，直到它已经恢复了足够的意识，以保持胸骨斜卧。同样，不要返回已动过手术，以公司的其他动物，直到完全康复的动物。 24小时后，管理卡洛芬的另一单剂量（5毫克/千克，皮下），为镇痛药。
   17. 治疗与局部抗生素软膏伤口5天。如果伤口被打开，通过1.1.5麻醉动物如步骤1.1.2和关闭伤口为1.30.14。每日监测动物的健康。使用腹腔lethabarb注射致死剂量（163毫克/公斤于0​​.25ml由23政针）如果动物显示inacitivity，食欲不振，体重减轻和颜色的损失的多于一个温和的迹象安乐死的动物。

2.流通型椎弓根商会（每个动物钱伯斯）

1. 动物准备手术
   1. 重复步骤1.1.1至1.1.4。两个腔室可被植入到单个大鼠的两个腹股沟区域。
2. 股血管的分离和商会的插入
   1. 重复步骤1.2.1至1.2.8。
   2. 与这两个动脉和静脉完全释放周围组织及其分支机构的连接，使腔进入手术区域。
   3. 将每个完整的股血管的上腔底座，确保没有扭曲或打结相应的缝隙。
   4. 附近attachi室纳克盖子在底座上。使用连续运行4/0丝线缝合加两种或三种附加单纯间断缝合闭合伤口，并允许动物如前所述恢复。

3.钱伯斯和组织处理的收获

1. 一旦实验的时间点（4-6周植入后）均达到，麻醉动物如步骤1.1.2并重复步骤1.1.3至1.1.5。
2. 使用＃15刀片打开伤口，并通过用剪刀剪的组织，直到室完全暴露。
3. 近端暴露股血管的构建和测试血管通畅:具有两个microforceps轻轻堵塞血管，然后奶血液在远侧方向最后松开近侧钳。如果容器有血再次填充，这证实了通畅。近侧和两个近端和远端结扎股血管中的动静脉环的情况下，在第的情况下Ë流通的配置，并与含组织整块移除腔室。
4. 在实验结束时，安乐死（由23政针163毫克/公斤0.25毫升）用腹膜内lethobarb注射致死剂量的动物。
5. 在室温下固定在4％低聚甲醛的组织24小时。分组织成多个横截面（1-2毫米厚），并在石蜡或最佳切割温度化合物为石蜡切片（5微米），或冷冻切片（10微米），分别嵌入^{。3,4,8,17,22， 24}
6. 执行日常组织染色，如行HE研究组织的一般形态。用特异性抗体进行免疫染色，以确定感兴趣的细胞类型^{，3,4,8,17,22,24,29}用于心肌例如肌钙蛋白T免疫染色。

结果

如上述在协议中所述进行显微创作组织工程的腔室。腔室内部产生的组织可以在组织学检查中的协议步骤描述3.各种组织类型都使用在体内血管腔室（ 图2）被成功地工程化。这些包括与新生大鼠心肌细胞（ 图2A），肌肉组织与大鼠骨骼肌成肌细胞（ 图2B），和脂肪组织与来自脂肪组织的细胞外基质（ 图2C）衍生的?...

讨论

微循环工程，目前正在通过两种方式本质上的影响。第一种方法，使得在植入时显影体外构建体中的高度互连的血管网，从主机血管床毛细管与那些连接移植通过一个过程被称为吻合构造，从而保证营养素的递送不仅向外围但还向核心^。21,32,33这被称为预血管。第二种方法试图直接增强宿主自身的脉管体内 ，使毛细血管发芽之前或与之同时植入细胞分化和组织的生长发生^...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 15 Blade Scalpel	Braun	BB515
1 Toothed Adson Forceps	Braun	BD527R
1 Needle Holder	Braun	BM201R
1 Bipolar Coagulator	Braun	US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5	S & T	00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11	S & T	00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11	S & T	00090
2 Single Clamps B-3	S & T	00400
2 10/0 nylon suture	S & T	03199
1 6/0 nylon suture	Braun	G2095469
2 4/0 Silk Sutures	Braun	C0760145
Xilocaine 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparin Sodium	Dealmed	272301	5000 UI / ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber	custom made
1 flow-through chamber	custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μg/mL
Troponin T antibody	Abcam	Ab8295	4 μg/mL
Human-specific Ku80 antibody	Abcam	Ab80592	0.06 μg/mL
Desmin antibody	Dako	M0760	2.55 μg/mL
Cell Tracker CM-DiI dye	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 cells