تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

Summary

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Abstract

تعميم (من خالية من الخلايا) الرنا الميكروية (miRNAs) تم إصدارها من الخلايا في مجرى الدم. وقد تم ربط كمية من microRNAs محددة في الدورة الدموية إلى حالة المرض ولديه القدرة على أن تستخدم العلامات البيولوجية المرض. تم تطوير طريقة حساسة ودقيقة لتعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الكيمياء قائم على الأصباغ وقطيرة تكنولوجيا PCR الرقمية مؤخرا. على وجه التحديد، وذلك باستخدام مغلق الأحماض النووية (LNA) المستندة الاشعال ميرنا معين مع الفلورسنت صبغة الحمض النووي ملزم الأخضر في قطرات نظام PCR الرقمية متوافق أنه من الممكن الحصول على تقدير المطلق للmiRNAs محددة. هنا، نحن تصف كيفية أداء هذه التقنية لتقييم كمية ميرنا في السوائل البيولوجية، مثل البلازما والمصل، على حد سواء مجدية وفعالة.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protocol

عزل الرنا الميكروي من البلازما أو مصل

ملاحظة: البلازما وإعداد المصل هو خطوة ذات الصلة في تعميم ميرنا الكمي. لا يوجد أي إجراء المفضل لالبلازما وإعداد المصل. الشيء الوحيد المهم للنظر هو أن جميع العينات من نفس التجربة يجب معالجتها باستخدام بالضبط نفس العمل. نبدأ من المصل 200 ميكرولتر أو البلازما. الحمض النووي الريبي مجموع يمكن عزله عن المصل أو البلازما باستخدام مجموعات متاحة تجاريا.

1. بروتوكول لإجمالي RNA (بما في ذلك ميرنا) عزل

1. عينات المصل / البلازما ذوبان الجليد على الجليد.
2. إضافة 1 مل من تحلل الكاشف (على سبيل المثال، QIAzol) إلى 200 ميكرولتر المصل / البلازما.
3. مزيج من قبل vortexing ووضع الأنبوب الذي يحتوي على جناسة على مقاعد البدلاء في RT لمدة 5 دقائق.
4. إضافة 3 ميكرولتر من حل نانومتر 4.16 من الاصطناعية ميرنا سل-مير 39-3p من C. ايليجانس.
5. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم. هز أنبوب بقوة لمدة 15 ثانية. المركز الرابعأنبوب الإلكترونية على مقاعد البدلاء في RT لمدة 2 دقيقة.
6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية للحصول على فصل مراحل: المرحلة المائية العليا تحتوي على الحمض النووي الريبي.
7. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد، نحو 700 ميكرولتر، وتجنب نقل أي مواد البيني البيضاء.
8. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ ومزيج من قبل انقلاب.
9. الماصة حتى 700 ميكرولتر من العينة في عمود الدوران مصغرة وضعت على أنبوب جمع 2 مل. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
10. كرر هذه الخطوة باستخدام عينة المتبقية.
11. إضافة 700 ميكرولتر العازلة RWT إلى عمود الدوران مصغرة، إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 12000 x ج لغسل العمود. تجاهل التدفق من خلال.
12. الماصة 500 ميكرولتر العازلة RPE في عمود الدوران مصغرة. إغلاق الغطاء وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في 12000 دورة في الدقيقة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
13. أجهزة الطرد المركزي لعمود الدوران مصغرة بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة حتى يجف عمود الدورانغشاء من الايثانول المتبقية.
14. نقل عمود الدوران مصغرة لأنبوب 1.5 مل مجموعة جديدة والماصة 35 ميكرولتر المياه خالية من ريبونوكلياز على الغشاء العمود.
15. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 12000 x ج لأزل الحمض النووي الريبي.
16. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: منذ تركيز الحمض النووي الريبي لا يمكن تحديده بدقة، استخدام وحدات التخزين الثابتة كمقياس للكمية المدخلات.

2. الرنا الميكروي النسخ العكسي

1. ذوبان الجليد في النسخ العكسي (RT) مكونات المزيج كاشف: 5X عازلة رد فعل، nuclease خالية من المياه. مزيج عكس بلطف الأنابيب ومكان على الجليد. مباشرة قبل الاستعمال، وإزالة مزيج انزيم من الثلاجة ووضعها على الجليد. تدور باستمرار كل الكواشف.
2. تحضير مزيج كاشف RT على الجليد كما هو موضح في الجدول رقم 1. إعداد لا يقل عن 10٪ مزيج تزيد.
3. خلط رد فعل من قبل pipetting، ثم تدور إلى أسفل.
4. احتضان لمدة 60 دقيقة في 42 ج.
5. للحرارة إبطال نشاط ترحد ذاته الناسخ لمدة 5 دقائق في 95 ج.
6. على الفور بارد إلى 4 درجات مئوية.
7. تخزين كدنا] في -20 درجة مئوية.

3. [كدنا التخفيف

1. تخفيف كمية من قالب [كدنا حاجة لردود الفعل ddPCR المخطط لها في المياه الحرة نوكلياز. تمييع رد فعل [كدنا بين 01:50 و 1: 500 في الماء، وتعتمد على الهدف ميرنا وفرة. تخزين [كدنا المخفف في -20 درجة مئوية. أثبت كدنا] المخففة لتكون مستقرة لمدة 3 أشهر على الأقل عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

4. الجيل الرذاذ وPCR

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ الجيل الحبرية في 8 عينات في وقت واحد. ليس مطلوبا من مكررات التقنية، ويرجع ذلك إلى استنساخ عالية من هذه التكنولوجيا يجب تشغيل ^12،15 .A لا تحكم قالب (NTC) عينة في كل لوحة ولكل حالة ddPCR مختلفة.

1. ذوبان الجليد وتتوازن مزيج الرئيسي (على سبيل المثال، EvaGreen ميكس ماجستير)، الرنا الميكروي مجموعة التمهيدي وكدنا] في RT.
2. مزيج الموافق ميكس ماجستيرoroughly التي كتبها قلب الأنبوب عدة مرات. تدور أسفل كل الكواشف.
3. تحضير مزيج ddPCR كما هو موضح في الجدول رقم (2). وعندما يتم تنفيذ ردود الفعل ddPCR متعددة، وإعداد ddPCR مزيج عمل-حل. إعداد لا يقل عن 10٪ مزيج تزيد.
4. تجميعها مرة واحدة، تخلط جيدا وتدور باستمرار مزيج ddPCR.
5. الاستغناء عن 12 ميكرولتر من ddPCR مزيج إلى 96 جيدا لوحة PCR أو أنابيب PCR.
6. إضافة 8 ميكرولتر من قالب [كدنا المخفف إلى كل أنبوب / جيد.
7. أدخل خرطوشة قطرة مولد في حامل.
8. نقل 20 ميكرولتر من كل عينة على استعداد لآبار العينة (الصف الأوسط) من خرطوشة قطرة مولد بعناية مع تجنب فقاعات الهواء في أسفل البئر.
9. ملء كل بئر النفط (الصف السفلي) مع 70 ميكرولتر من النفط قطرة المولد.
10. ربط طوقا على حامل خرطوشة وإدراجه في مولد قطرة.
11. إغلاق الغطاء لبدء توليد الحبر بما يتوافق والعلاقات العامة الشركة المصنعةotocol. عندما انتهى جيل قطرة، فتح الغطاء، وإزالة حشية المتاح. أعلى آبار خرطوشة تحتوي على قطرات.
12. الماصة ببطء وسلاسة 40 ميكرولتر من محتويات ثمانية آبار العليا (قطرات) في عمود واحد من لوحة 96-جيدا PCR.
13. ختم لوحة PCR مع احباط مباشرة بعد نقل قطرات لتجنب التبخر. استخدام pierceable الأختام احباط لوحة التي تتوافق مع الإبر في القارئ قطرة.
14. تبدأ الدراجات الحرارية (PCR) في غضون 30 دقيقة من ختم اللوحة.
15. أداء بروتوكول الدراجات وفقا للجدول 3.

5. القطرة القراءة

1. السلطة على القارئ قطرة.
2. نقل لوحة من cycler الحرارية للقارئ قطرة.
3. وضع لوحة 96-جيدا PCR يحتوي على-PCR بعد قطرات في قاعدة حامل اللوحة.
4. ضع الجزء العلوي من حامل لوحة على لوحة PCR. اضغط بحزم كل من علامات التبويب الإفراجوصولا الى تأمين لوحة PCR في حامل.
5. بدء تشغيل البرنامج من جهاز الكمبيوتر نظام.
   1. انقر فوق إعداد لتعريف التجربة (الكمي المطلق) ثم انقر فوق تشغيل لبدء القراءة الحبرية.
   2. عندما قطرة قراءة كاملة، انقر على "تحليل" الزر لفتح وتحليل البيانات.
   3. استخدام السعة مؤامرة 2D في برامج التحليل لتحديد قطرات الإيجابية (أداة لاسو) (الشكل 1B).
   4. استخدم علامة التبويب الأحداث للتحقق من عدد من قطرات الإيجابية والشاملة. وحققت 21،000 قطرات عادة مع probeless ddPCR - مجموع عدد 18000.
   5. مرة واحدة ويتم اختيار قطرات إيجابية، تصدير قيم تركيز ميرنا باستخدام الخيار تصدير بتنسيق csv من علامة التبويب التركيز.

النتائج

القيمة المطلقة من miRNAs محددة لكل مل من البلازما أو مصل يمكن تحديد باستخدام صبغة الفلورسنت الحمض النووي ملزم الأخضر وقطيرة تكنولوجيا PCR الرقمية الشكل 1 يعرض عملية إيجابية-قطرات الاختيار، والذي يحدد تركيز ميرنا النهائي (نسخ / ميكرولتر ) في رد ف...

Discussion

miRNAs تعميم موجودة في الدم بتركيزات منخفضة للغاية وكمية من الحمض النووي الريبي التي يمكن استخلاصها من عينات البلازما والمصل منخفضة. لهذا السبب، فإن من الصعب تحديد مع تقنيات أخرى مثل ميكروأري وتسلسل الحمض النووي الريبي. وعلاوة على ذلك، هناك نقص معمم الاتفاق على تطبيع ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation