Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Zusammenfassung

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zusammenfassung

Zirkulierende (zellfreier) microRNAs (miRNAs) von Zellen in den Blutstrom freigesetzt. Die Menge der spezifischen mikroRNAs im Zirkulations wurde einem Krankheitszustand verbunden und hat das Potential als Krankheits Biomarkers verwendet werden. A sensitive und genaue Methode MikroRNA Quantifizierung zum Zirkulieren eines farbstoffbasierte Chemie und digitalen PCR Technologie Tröpfchens wurde vor kurzem entwickelt. Insbesondere Locked unter Verwendung Nukleinsäure (LNA) miRNA-spezifische Primer mit einem grünen fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff in einem kompatiblen digital Tröpfchen PCR System -basierte es ist möglich, die absolute Quantifizierung von spezifischen miRNAs zu erhalten. Hier beschreiben wir, wie diese Technik darstellende miRNA Menge in biologischen Flüssigkeiten, zu beurteilen, wie Plasma und Serum, ist sowohl möglich als auch effektiv.

Einleitung

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protokoll

MicroRNA Isolierung von Plasma oder Serum

Hinweis: Plasma und Serum Vorbereitung ist ein bedeutender Schritt in zirkulierenden miRNA Quantifizierung. Es gibt keine bevorzugte Verfahren für Plasma und Serumpräparat. Die einzige wichtige Sache zu prüfen ist, dass alle Proben aus dem gleichen Experiment muss genau den gleichen Workflow verarbeitet werden. Starten von 200 & mgr; l Serum oder Plasma. Gesamt-RNA kann aus Serum oder Plasma unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits isoliert werden.

1. Das Protokoll für Gesamt-RNA (einschließlich miRNA) Isolierung

1. Thaw Serum / Plasma-Proben auf Eis.
2. 1 ml Lysis Reagent (z. B. QIAzol) bis 200 & mgr; l Serum / Plasma.
3. Mix von Verwirbelung und legen Sie den Schlauch des Homogenats auf der Bank bei RT für 5 min enthält.
4. In 3 ul einer 4,16 nM Lösung des synthetischen miRNA Cel-miR-39-3p von C. elegans.
5. In 200 ul Chloroform. Das Röhrchen wird kräftig für 15 Sekunden. Platz the Rohr auf der Bank bei RT für 2 min.
6. Zentrifuge für 15 min bei 12000 xg bei 4ºC Phasen Trennung zu erhalten: Die obere wässrige Phase enthält RNA.
7. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen, etwa 700 & mgr; l, vermeiden Übertragung eines weißen Zwischenschichtmaterial.
8. 1 ml 100% Ethanol und mischen durch Umdrehen.
9. Pipettieren bis 700 & mgr; l der Probe in einen Mini spin column auf einer 2 ml Sammelröhrchen gegeben. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge bei 12.000 g für 15 Sekunden. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
10. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die restliche Probe verwendet wird.
11. In 700 & mgr; l Puffer RWT an den Mini-Spin-Säule, den Deckel schließen und Zentrifuge für 15 Sekunden bei 12.000 xg um die Säule zu waschen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
12. Pipettieren 500 ul Puffer RPE in die Mini-Spin-Säule. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge für 15 Sekunden bei 12.000 Umdrehungen pro Minute. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Wiederholen Sie es noch einmal.
13. Zentrifugieren Sie die Mini-Spin-Säule mit voller Geschwindigkeit für 2 min, um die Spin-Säule zum TrocknenMembran aus restliche Ethanol.
14. Übertragen Sie die Mini-Spin-Säule in ein neues 1,5 ml Sammelröhrchen und Pipette 35 ul RNase-freies Wasser auf die Membran der Säule.
15. Zentrifugieren für 1 min bei 12000 xg um die RNA zu eluieren.
16. Lagern Sie die RNA bei -80 ° C.
    Hinweis: Da RNA-Konzentration nicht genau bestimmt werden kann, als Maß für Fixvolumen Eingangsgrße verwenden.

2. MicroRNA Reverse Transkription

1. Tauen die reverse Transkription (RT) Reagenzienmix Komponenten: 5x Reaktionspuffer, Nuklease-freies Wasser. Mix Umdrehen sanft die Rohre und auf Eis. Unmittelbar vor dem Gebrauch zu entfernen aus dem Gefrierschrank und auf Eis, das Enzym-Mix. Spin down alle Reagenzien.
2. Bereiten Sie die RT Reagenzienmix auf Eis , wie in Tabelle 1 beschrieben. Bereiten Sie mindestens 10% größer als Mischung.
3. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren, und dann drehen nach unten.
4. Inkubieren für 60 min bei 42 ° C.
5. Hitze-Inaktivierung die Reverse Transkriptase für 5 min bei 95 ° C.
6. Sofort kühlen auf 4 ° C.
7. Lagern Sie die cDNA bei -20 ° C.

3. cDNA Verdünnung

1. Verdünnen Sie die Menge an cDNA-Matrize, die für die geplanten ddPCR Reaktionen in nukleasefreiem Wasser. Verdünnen Sie die cDNA-Reaktion zwischen 1:50 und 1: 500 in Wasser, abhängig von Ziel-miRNA Hülle und Fülle. Die verdünnte cDNA bei -20 ° C. Die verdünnte cDNA nachgewiesen für mindestens 3 Monate bei -20 ° C stabil.

4. Tröpfchenerzeugung und PCR

Hinweis: Tröpfchenerzeugung sollte auf 8 Proben gleichzeitig durchgeführt werden. Technische Replikate sind nicht erforderlich, aufgrund der hohen Reproduzierbarkeit dieser Technologie ^12,15 .A Leerwert -Kontrolle (NTC) Probe in jeder Platte ausgeführt werden soll und für jede unterschiedliche ddPCR Zustand.

1. Auftauen und den Master - Mix ins Gleichgewicht (z. B. EvaGreen Master Mix), microRNA - Primer - Set und cDNA bei RT.
2. Mischen Sie den Master Mix thoroughly durch das Rohr mehrmals umgekehrt wird. Spin down alle Reagenzien.
3. Bereiten Sie die ddPCR Mischung wie in Tabelle 2 beschrieben. Wenn mehrere ddPCR Reaktionen durchgeführt werden, bereiten eine ddPCR Arbeits-Lösung mischen. Bereiten Sie mindestens 10% größer als Mischung.
4. Nach dem Zusammenbau gründlich ddPCR Mix mischen und Spin-down.
5. Dispense 12 ul ddPCR mischen in eine 96-Well-PCR-Platte oder PCR-Röhrchen.
6. In 8 ul der verdünnten cDNA-Matrize in jedes Röhrchen / Vertiefung.
7. Legen Sie die Tröpfchengeneratorpatrone in die Halterung.
8. Transfer 20 ul jeder hergestellten Probe zu den Probenvertiefungen (mittlere Reihe) der Tröpfchengeneratorpatrone vorsichtig, während Luft am Boden des Bohrlochs Blasen zu vermeiden.
9. Füllen Sie jedes Öl gut (untere Reihe) mit 70 & mgr; l Tropfengenerator Öl.
10. Haken Sie die Dichtung über den Patronenhalter und legen Sie in den Tröpfchengenerator.
11. Schließen Sie den Deckel Tropfenerzeugung zu beginnen nach Hersteller protocol. Wenn Tröpfchenerzeugung abgeschlossen ist, öffnen Sie den Deckel, die Einweg-Dichtung entfernen. Die oberen Vertiefungen der Patrone enthalten die Tröpfchen.
12. Pipettieren langsam und gleichmäßig 40 ul die Inhalte der acht Top-Brunnen (die Tröpfchen) in eine einzige Säule einer 96-Well-PCR-Platte.
13. Verschließen Sie die PCR-Platte mit Folie unmittelbar nach dem Tröpfchen übertragen Verdunstung zu vermeiden. Verwenden Sie durchstechbaren Folienplatte Dichtungen, die mit den Nadeln in der Tröpfchen Leser kompatibel sind.
14. Beginnen thermischen Zyklen (PCR) innerhalb von 30 Minuten von der Platte abdichten.
15. Führen Sie die Rad - Protokoll gemäß Tabelle 3.

5. Droplet Lese

1. Schalten Sie den Tropfen Leser.
2. Bewegen Sie die Platte aus dem Thermocycler zum Tröpfchen Leser.
3. Legen Sie die 96-Well-PCR-Platte, die die Post-PCR-Tröpfchen in die Basis des Plattenhalters enthält.
4. Die Oberkante des Plattenhalters auf der PCR-Platte. Drücken Sie mit beiden FreigabezungenSie die PCR-Platte in der Halterung zu befestigen.
5. Starten Sie die Software aus dem System PC.
   1. Klicken Sie auf Setup, um das Experiment (Absolute Quantifizierung) dann auf Ausführen zu definieren klicken Sie auf die Tröpfchen Lesen zu beginnen.
   2. Wenn Tröpfchen Lesen abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Analysieren", um die Daten zu öffnen und zu analysieren.
   3. Verwenden Sie die 2D - Amplitude Grundstück in der Analyse - Software , die positiven Tröpfchen (Lasso - Werkzeug) (Abbildung 1B) zu wählen.
   4. Verwenden Sie die Registerkarte Ereignisse die Anzahl der positiven und insgesamt Tröpfchen zu überprüfen. Eine Gesamtzahl von 18.000 - 21.000 Tröpfchen wird in der Regel mit ddPCR ohne Sonden erreicht.
   5. Sobald die positive Tröpfchen ausgewählt werden, exportieren die Konzentrationswerte miRNA der Export CSV-Option aus dem Konzentrations Reiter.

Ergebnisse

Die absolute Menge an spezifischen miRNAs pro ml Plasma oder Serum können mit einem grün fluoreszierenden DNA-bindenden Farbstoff und Tröpfchen digitale PCR - Technologie bestimmt werden. Abbildung 1 den Prozess der positiven Tröpfchen Auswahl präsentiert, die die endgültige miRNA - Konzentration bestimmt (Kopien / ul ) in der Amplifikationsreaktion durch die Analysesoftware berechnet. Die Menge jeder miRNA im Blut ist ganz anders, als andere einige miRNA-Arten hä...

Diskussion

Zirkulieren miRNAs sind im Blut bei extrem niedrigen Konzentrationen und die Menge an RNA, die aus Plasma und Serumproben extrahiert werden kann, ist gering. Aus diesem Grund sind sie schwierig mit anderen Techniken wie Mikroarray und RNA-Sequenzierung zu quantifizieren. Darüber hinaus gibt es eine verallgemeinerte keine Einigung über die Datennormalisierung und die Anwesenheit von endogenen "Referenz" miRNAs im Blut. In diesem Zusammenhang ist eine sensible Technik wie Tröpfchen digitale PCR, der fähig is...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation