MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Özet

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Özet

mikroRNA (miRNA'ların) (hücre içermeyen) dolaşımdaki kan akışı içine hücrelerden salınırlar. dolaşımdaki Belirli mikroRNA miktarı bir hastalık durumu ile bağlantılı hastalık belirteç olarak kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olmuştur. Dijital PCR teknolojisi bir boya temelli kimya kullanılarak ve damlacık microRNA ölçümü dolaşan için hassas ve doğru bir yöntem son zamanlarda geliştirilmiştir. Spesifik olarak, nükleik asit (LNA) belirli miRNA'ların mutlak miktarının elde edilmesi mümkün olmaktadır, uyumlu bir damlacık dijital PCR sisteminin yeşil floresan DNA bağlayıcı boya ile miRNA spesifik primerler tabanlı Kilitli kullanılarak. Burada, bu tekniği gerçekleştirmek gibi plazma ve serum gibi biyolojik sıvılarda, içinde miRNA miktarını değerlendirmek için nasıl tarif uygulanabilir ve etkili hem de.

Giriş

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protokol

Plazma ya da serum gelen mikroRNA İzolasyon

Not: Plazma ve serum hazırlama miRNA miktarının dolaşımdaki ilgili bir adımdır. plazma ve serum hazırlanması için herhangi bir tercih işlemi yoktur. dikkate Önemli olan tek şey aynı deneyden tüm örnekler aynı iş akışı kullanarak işlenmelidir olmasıdır. 200 ul serum veya plazmadan başlayın. Toplam RNA ticari olarak temin edilebilir kitler kullanılarak serum veya plazma izole edilebilir.

1. (miRNA dahil) Toplam RNA Protokolü İzolasyon

1. Buz üzerinde Çözülme serum / plazma örnekleri.
2. 200 ul serum / plazma liziz reaktifi (örn., QIAzol) 1 ml ilave edilir.
3. vorteks karışım, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah üzerinde Homojenat içeren tüp yerleştirin.
4. C. sentetik miRNA cel-miR-39-3p bir 4.16 nM çözeltisi 3 ul ekleyin elegans.
5. kloroform 200 ul ekle. 15 saniye boyunca kuvvetlice tüpü çalkalayın. Yeri inci2 dakika boyunca oda sıcaklığında tezgah e tüpü.
6. 4 ° C'de 12,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj aşamaları ayırma elde etmek üzere, üst sulu faz RNA içerir.
7. , Yeni bir tüpe 700 ul sulu faz transfer herhangi bir beyaz interfaz malzeme transferini engellemek.
8. % 100 etanol 1 ml ilave edilir ve çevirerek karıştırın.
9. Pipet yukarı mini spin kolon içine numune 700 ul 2 ml toplama tüpü yerleştirilir. 15 saniye boyunca 12.000 xg'de kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın.
10. Kalan örnek kullanarak bu adımı yineleyin.
11. Mini döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekle sütunu yıkamak için 12,000 xg'de 15 sn için kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın.
12. Mini spin kolon içine Pipetleyin 500 ul Tampon RPE. 12.000 rpm'de 15 saniye boyunca kapağı ve santrifüj kapatın. flow-through atın. Yine bu adımı yineleyin.
13. spin kolon kurumasını 2 dakika süreyle tam hızda mini spin kolon santrifüjKalıntı etanolden membran.
14. Sütunun membran üzerinde yeni bir 1.5 ml'lik bir toplama tüpü ve damlalıklı 35 mL RNaz içermeyen su mini spin kolon aktarın.
15. RNA elüte etmek için 12,000 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj.
16. -80 ° C'de RNA saklayın.
    Not: RNA konsantrasyonu, doğru olarak belirlenebilir edemediğinden, giriş miktarı için bir ölçü olarak, sabit hacimli kullanımı.

2. mikroRNA Ters Transkripsiyon

1. 5x reaksiyon tamponu, nükleaz içermeyen su: ters transkripsiyon (RT) reaktif karışımı bileşenleri çözülme. Yavaşça karıştırın buz üzerinde tüpler ve yeri tersini. Kullanımdan hemen önce, dondurucudan enzim karışımı çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. tüm reaktifler aşağı doğru döndürün.
2. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi buz üzerinde RT reaktif karışımı hazırlayın. En az% 10 aşan karışımı hazırlayın.
3. Pipetleme tarafından reaksiyonu karıştırın ve daha sonra aşağı doğru döndürün.
4. 42 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
5. Rever Isı inaktive95 ° C'de 5 dakika boyunca SE transkriptaz.
6. Hemen ardından 4 ° C'ye soğutun.
7. -20 ° C'de cDNA saklayın.

3. cDNA Sulandırma

1. nükleaz içermeyen su içinde planlanan ddPCR reaksiyonları için gerekli olan cDNA şablon miktarının seyreltilir. 1:50 ve 1 arasında cDNA reaksiyonu sulandırmak: 500 suda, hedef miRNA bereket bağlıdır. -20 ° C'de seyreltilmiş cDNA saklayın. seyreltilmiş cDNA -20 ° C'de en az 3 ay boyunca stabil olduğu kanıtlanmıştır.

4. damlacık oluşturma ve PCR

Not: damlacık oluşturma her seferinde 8 numuneler üzerinde yapılmalıdır. Teknik çoğaltır nedeniyle ^12,15 .A Şablonsuz kontrol (NTC) bir numunesi, her plaka çalıştırılmalıdır bu teknolojinin yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ve her biri farklı ddPCR durum için gerekli değildir.

1. Çözülme ve ana karışımı dengeye (örn., EvaGreen Master Mix) oda sıcaklığında, mikroRNA primer seti ve cDNA.
2. Master Mix th Mixoroughly Tüpü birkaç kez baş aşağı çevirerek. tüm reaktifleri aşağı doğru döndürün.
3. Tablo 2'de tarif edildiği gibi ddPCR karışımı hazırlayın. Birden ddPCR reaksiyonlar gerçekleşirken zaman, ddPCR çalışma-çözeltisi karışımı hazırlayın. en az% 10 aşan karışımı hazırlayın.
4. monte kez iyice karıştırın ve ddPCR karışımı aşağı doğru döndürün.
5. ddPCR 12 ul, 96 oyuklu bir plaka, PCR ya da PCR tüpleri içine karıştırmak dağıtın.
6. de / her bir tüpe seyreltildi cDNA şablonunun 8 ul ekle.
7. tutucu içine damlacık jeneratör kartuşu takın.
8. Aktarım hava kaçınarak kuyunun dibinde kabarcıkları dikkatle ise damlacık jeneratör kartuşunun örnek kuyu (orta sıra) her Hazırlanan numune 20 ul.
9. damlacık jeneratör yağı 70 ul her petrol kuyusu (alt sıra) doldurun.
10. kartuş yuvasına üzerinde conta kanca ve damlacık jeneratör yerleştirin.
11. Üreticinin pr göre damlacık nesil başlatmak için kapağını kapatınotocol. damlacık oluşturma bittiğinde, kapağı açın atılabilir conta çıkarın. kartuşun üst kuyular damlacıkları içerir.
12. 96 oyuklu bir PCR plaka tek bir sütuna sekiz en oyuklara (damlacıklar) içeriğinin pipetleyin yavaş ve düzgün 40 ul.
13. hemen buharlaşmasını önlemek için damlacıkların aktardıktan sonra folyo ile PCR plaka mühür. Damlacık okuyucu iğne ile uyumlu delinebilir folyo plaka contaları kullanın.
14. bir plak kapatıldı, 30 dk içinde termal çevrimi (PCR) başlayın.
15. Tablo 3'e göre bisiklet protokolü gerçekleştirin.

5. Damlacık Okuma

1. damlacık okuyucu açın.
2. damlacık okuyucuya termal döngü plaka taşıyın.
3. plaka sahibinin tabanına PCR sonrası damlacıkları içeren 96-PCR plaka koyun.
4. PCR plaka üzerinde plaka sahibinin üst yerleştirin. Sıkıca hem serbest bırakma tırnaklarını basınaşağı tutucuya PCR plakasını sabitlemek için.
5. Sistem PC'den yazılımını başlatın.
   1. deneyi (Mutlak miktar) tanımlamak için Kur'u tıklatın ve sonra damlacık okumaya başlamak için Çalıştır 'ı tıklatın.
   2. damlacık okuma tamamlandığında, tıklayın açın ve verileri analiz etmek için, lütfen "Analiz".
   3. Pozitif damlacıkları (kement aracı) (Şekil 1B) seçmek için analiz yazılımı 2D genlik arsa kullanın.
   4. Pozitif ve toplam damlaların sayısını kontrol etmek Olaylar sekmesini kullanın. 18.000 toplam sayısı - 21.000 damlacıkları genellikle probeless ddPCR ile elde edilir.
   5. Pozitif damlacıklar seçildikten sonra, Konsantrasyon sekmesinden ihracat .csv seçeneğini kullanarak miRNA konsantrasyon değerleri ihracat.

Sonuçlar

Plazma ya da serum ml başına özgül miRNA'ların mutlak miktarı, dijital PCR teknolojisi yeşil fluoresan DNA bağlayıcı boya kullanılarak ve damlacık belirlenebilir. 1 son MiRNA konsantrasyonunu belirler pozitif damlacıkları seçim sürecini sunulur şekil (kopya / ml ) analiz yazılımı ile hesaplanmıştır amplifikasyon reaksiyonunda. Kandaki her miRNA miktarı diğerlerine göre biraz miRNA türü daha bol olması, çok farklıdır. d...

Tartışmalar

Sirkülasyon miRNA'lar son derece düşük konsantrasyonlarda, kanda bulunan plazma ve serum örneklerinden elde edilebilir RNA miktarı düşüktür. Bu nedenle, bu tür mikrodizi ve RNA dizi analizi gibi diğer tekniklerle ölçmek zordur. Ayrıca, veriler normalleştirme üzerinde anlaşma genel bir eksikliği ve kan endojen "referans" miRNA'ların varlığı yoktur. Bu bağlamda, serum veya plazma çok düşük dahi olsa ml başına miRNA kopya sayısını sayma yeteneğine sahip damlacık dijital ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation