Que circula MicroARN Cuantificación Usando ADN vinculante tinte Química y gotita de PCR digital

Resumen

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Resumen

Circulación (de libres de células) microRNAs (miRNAs) son liberados de las células en el torrente sanguíneo. La cantidad de microRNAs específicos en la circulación se ha relacionado con un estado de enfermedad y tiene el potencial para ser utilizado como biomarcador de la enfermedad. Un método sensible y exacto para la circulación de la cuantificación de microARN usando una química a base de colorante y tecnología de gotas de PCR digital ha sido desarrollado recientemente. Específicamente, utilizando ácido nucleico cerrado (LNA) a base de cebadores-miARN específico con un colorante de unión a ADN fluorescente verde en un sistema digital de PCR gotita compatible es posible obtener la cuantificación absoluta de miRNAs específicos. A continuación, se describe la forma de realizar esta técnica para evaluar la cantidad de miRNA en fluidos biológicos, tales como plasma y suero, es factible y eficaz.

Introducción

MicroRNAs (miRNAs) are released into blood circulation by potentially all the cells of the organism, as a consequence of active release or necrotic and apoptotic processes. Cell-free miRNAs have been detected in the bloodstream either as free stable molecules or linked to lipoproteins or enveloped inside exosomes and microvesicles ^1-3. They are believed to function as cell-to-cell communicators ⁴, and their amount changes in the presence of cancer, cardiac disorders or autoimmune diseases ^5-7. Their accurate and reproducible quantification is the basis for their evaluation as disease biomarkers. However, for several reasons already described elsewhere ^8,9, miRNA quantification in serum or plasma, as well as other body fluids, could be very challenging ^10,11. We recently developed a method for the absolute quantification of circulating miRNAs, based on miRNA-specific LNA primers and DNA-binding dye droplet digital PCR (ddPCR) technology ¹². This methodology has been applied to the validation of miRNA breast cancer biomarkers ^13,14.

After the partitioning of each reverse-transcribed miRNA molecule inside a nanoliter-sized droplet, it is possible to count the copy number of each miRNA in each sample, basically counting the number of green, and therefore positive, fluorescent droplets. As soon as a PCR reaction occurs, a positive count is achieved, without the need to establish a standard curve or taking PCR efficiency into account in target amount calculation, as it happens with quantitative RT-PCR (RT-qPCR). In addition, ddPCR proved to be more sensitive and accurate than RT-qPCR in circulating miRNA quantification ¹⁵. In this article we present the detailed protocol of this methodology, discussing the most relevant steps andspecifically considering serum and plasma clinical samples.

Protocolo

Aislamiento MicroARN del plasma o suero

Nota: El plasma y suero de preparación es un paso relevante en la circulación de miARN cuantificación. No existe un procedimiento preferido para la preparación de plasma y suero. La única cosa importante a tener en cuenta es que todas las muestras del mismo experimento deben ser elaborados utilizando exactamente el mismo flujo de trabajo. Comenzar a partir de suero o plasma de 200 l. El ARN total se puede aislar a partir de suero o plasma usando kits disponibles en el mercado.

1. Protocolo para el ARN total (incluyendo miRNA) Aislamiento

1. Las muestras de suero / plasma descongelación en hielo.
2. Añadir 1 ml de reactivo de lisis (por ejemplo., QIAzol) a 200 l de suero / plasma.
3. Mezclar con el vórtex y colocar el tubo que contiene el homogeneizado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Añadir 3 l de una solución de 4,16 nM del miARN miR-cel-39-3p sintético a partir de C. elegans.
5. Añadir 200 l de cloroformo. Agitar vigorosamente durante 15 segundos. º lugartubo de correo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2 min.
6. Centrifugar durante 15 min a 12.000 xg a 4 ° C para obtener la separación fases: la fase acuosa superior contiene ARN.
7. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, a unos 700 l, evitar la transferencia de cualquier material interfase blanca.
8. Añadir 1 ml de etanol al 100% y se mezcla por inversión.
9. Pipet hasta 700 l de la muestra en una columna de mini giro colocado en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a 12.000 xg durante 15 seg. Desechar el flujo continuo.
10. Repita este paso con el resto de la muestra.
11. Añadir 700 l de tampón de TAR a la columna de centrifugación mini, cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 xg para lavar la columna. Desechar el flujo continuo.
12. Pipetear 500 l de tampón RPE en la columna de centrifugación mini. Cierre la tapa y centrifugar durante 15 segundos a 12.000 rpm. Desechar el flujo continuo. Repita este paso de nuevo.
13. Se centrifuga la columna de centrifugación de mini a toda velocidad durante 2 minutos para secar la columna de centrifugaciónmembrana a partir de etanol residual.
14. Transferir la columna de la mini giro a un nuevo tubo de 1,5 ml de recogida y pipeta de 35 l de agua libre de RNasa en la membrana de la columna.
15. Centrifugar durante 1 min a 12.000 xg para eluir el RNA.
16. Almacenar el ARN a -80 ° C.
    Nota: Puesto que la concentración de ARN no puede determinarse con precisión, utilizar volúmenes fijos como una medida para la cantidad de entrada.

2. El microARN transcripción inversa

1. Descongelar los transcripción inversa (RT) componentes de la mezcla de reactivos: Tampón de reacción 5x, agua libre de nucleasa. Mezclar invirtiendo suavemente los tubos y el lugar en el hielo. Inmediatamente antes de su uso, retire la mezcla de enzimas del congelador y colocar en hielo. Centrifugar todos los reactivos.
2. Preparar la mezcla de reactivo de RT en hielo como se describe en la Tabla 1. Preparar al menos 10% superior a la mezcla.
3. Mezclar la reacción con la pipeta, y luego girar hacia abajo.
4. Incubar durante 60 minutos a 42 ° C.
5. Heat-inactivar la revertranscriptasa SE durante 5 min a 95 ° C.
6. Inmediatamente enfriar a 4 ° C.
7. Almacenar el ADNc a -20 ° C.

3. La dilución de cDNA

1. Diluir la cantidad de cDNA plantilla necesaria para las reacciones ddPCR previstas en agua libre de nucleasa. Se diluye la reacción de ADNc de entre 1:50 y 1: 500 en agua, en función de los genes miARN objetivo abundancia. Almacenar el ADNc diluida a -20 ° C. El cDNA diluido resultó ser estable durante al menos 3 meses a -20 ° C.

4. Generación de la gotita y PCR

Nota: la generación de la gotita se debe realizar en 8 muestras a la vez. Técnico repeticiones no son necesarios, debido a la alta reproducibilidad de esta tecnología ^12,15 .A No Control plantilla (NTC) de la muestra debe ser ejecutado en cada placa y para cada condición ddPCR diferente.

1. Descongelar y equilibrar la mezcla maestra (por ejemplo., EvaGreen Master Mix), el juego de primers Micro RNA y cDNA a temperatura ambiente.
2. Mezclar la TH Master Mixoroughly invirtiendo el tubo varias veces. Centrifugar todos los reactivos.
3. Prepare la mezcla ddPCR como se describe en la Tabla 2. Cuando se realizan múltiples reacciones ddPCR, preparar una mezcla ddPCR-solución de trabajo. Preparar al menos 10% superior a la mezcla.
4. Una vez montada, mezclar bien y centrifugar la mezcla ddPCR.
5. Dispensan 12 l de ddPCR mezclan en una placa de 96 pocillos PCR o los tubos de PCR.
6. Añadir 8 l de molde de ADNc diluida a cada tubo / pocillo.
7. Insertar el cartucho generador de gotas en el soporte.
8. Transferencia de 20 l de cada muestra preparada a los pocillos de muestra (fila central) del cartucho generador de gotas con cuidado, evitando las burbujas de aire en la parte inferior del pozo.
9. Llenar cada pocillo de aceite (fila inferior) con 70 l de aceite de generador de gotas.
10. Enganche la junta sobre el soporte del cartucho y se insertan en el generador de gotas.
11. Cierre la tapa para que comience la generación de gotas según la pr del fabricanteotocol. Cuando la generación de gotas ha terminado, abra la tapa, retire la junta desechable. Los pocillos superior del cartucho contienen las gotitas.
12. Pipet lenta y suavemente 40 l de los contenidos de los ocho pozos superiores (las gotas) en una sola columna de una placa de 96 pocillos de PCR.
13. Sellar la placa con papel de PCR inmediatamente después de la transferencia de gotas para evitar la evaporación. Usar juntas de la placa de lámina perforables que son compatibles con las agujas en el lector de gotas.
14. Comenzará el ciclo térmico (PCR) dentro de los 30 minutos después del cierre del plato.
15. Realizar el protocolo de ciclado de acuerdo a la Tabla 3.

5. Lectura de la gotita

1. Encender el lector de gotas.
2. Mover la placa del termociclador para el lector de gotas.
3. Coloque la placa de PCR de 96 pocillos que contiene las gotas de post-PCR en la base del soporte de la placa.
4. Coloque la parte superior del soporte de la placa en la placa de PCR. Presione firmemente las dos lengüetas de liberaciónhacia abajo para asegurar la placa de PCR en el soporte.
5. Iniciar el software desde el PC del sistema.
   1. Haga clic en Configuración para definir el experimento (Cuantificación absoluta) a continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar la lectura de las gotas.
   2. Cuando la lectura de la gotita se haya completado, haga clic en el botón para abrir y analizar los datos "Analizar".
   3. Usar el diagrama de amplitud 2D en el software de análisis para seleccionar las gotitas positivos (herramienta de lazo) (Figura 1B).
   4. Utilice la ficha Eventos para comprobar el número de gotitas positivas y totales. Un total de 18.000 - 21.000 gotitas se logra por lo general con ddPCR sin sonda.
   5. Una vez que se seleccionan las gotitas positivos, exportar los valores de concentración miARN utilizando la opción de la exportación .csv desde la pestaña de concentración.

Resultados

La cantidad absoluta de miRNAs específicos por ml de plasma o suero se puede determinar usando un colorante de unión a ADN fluorescente verde y tecnología de gotas de PCR digital. La Figura 1 presenta el proceso de selección-gotitas positivo, que determina la concentración final miRNA (copias / l ) en la reacción de amplificación calculado por el software de análisis. La cantidad de cada uno de los genes miARN en la sangre es muy diferente, siendo algunas especie...

Discusión

miRNAs circulantes están presentes en la sangre en concentraciones extremadamente bajas y la cantidad de ARN que se puede extraer a partir de muestras de plasma y suero es baja. Por esta razón, son difíciles de cuantificar con otras técnicas tales como microarrays y secuenciación de ARN. Por otra parte, hay una falta generalizada de acuerdo sobre la normalización de datos y la presencia de miRNAs endógenos "de referencia" en la sangre. En este contexto, una tecnología sensible como gotita PCR digital, ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA reverse transcription
MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxx and 2100000-21xxxxx	Primers for miRNA amplification inside droplets
QX200 droplet generator	BioRad	186-4002	Instrument used for droplet reading
QX200 droplet reader	BioRad	186-4003	Instrument used for droplet generation
QuantaSoft software	BioRad	186-3007	Software for data collection and analysis
PX1 PCR plate sealer	BioRad	181-4000	Plate sealer
DG8 droplet generator cartridges and gaskets	BioRad	186-4008	Cartridges used to mix sample and oil to generate droplets
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 droplet generator oil for EvaGreen dye	BioRad	186-4005	Oil for droplet generation